專利名稱：一種建立小鼠全基因組突變胚胎干細(xì)胞庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種建立小鼠全基因組突變胚胎干細(xì)胞庫的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組和其它一些重要動植物基因組全序列測定已經(jīng)或?qū)⒃诮诘玫酵瓿?，同時更多的物種基因組測序計劃正在開展。然而這些工作只是理解生物體基因組功能的第一步，由于大部分的基因功能尚未知曉，隨著海量的序列數(shù)據(jù)的快速積累，人們面臨著如何鑒定這些序列數(shù)據(jù)所代表的生物學(xué)功能的巨大挑戰(zhàn)，生物信息學(xué)的發(fā)展為分析基因組序列推測基因的功能提供了前所未有的便利。
然而，實驗研究，特別是在體內(nèi)的基因功能研究仍然是獲得基因功能信息的最重要和不可或缺的手段，體內(nèi)外的基因及基因組功能的實驗研究和生物信息學(xué)一起構(gòu)成了功能基因組學(xué)研究騰飛的兩個翅膀。對人類基因組功能的研究是當(dāng)前最迫切需要開展的項目，通過分析疾病家系從而定位相關(guān)的基因為了解人類基因的功能提供了重要的途徑，但是這方面的資源畢竟是有限的，大量人類基因功能的研究只能通過相對間接的途徑，特別是基本上無法利用人類自身進(jìn)行體內(nèi)的研究(除了一些用于疾病治療的目的)，而利用模式生物開展基因功能的體內(nèi)研究是目前最為可取的手段。
小鼠是目前被采用的最接近人類生物學(xué)功能的模式動物，在小鼠基因組內(nèi)進(jìn)行基因剔除的研究是揭示小鼠基因功能的重要手段，同時這類研究對于理解人類的同源基因提供了非常直接的線索。
目前國內(nèi)外主要是利用基因捕獲技術(shù)(gene trapping)或化學(xué)誘變劑(如ENU等)對小鼠胚胎干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)進(jìn)行隨機(jī)突變，然后通過篩選和基因定位來確定相應(yīng)的基因突變部位，由于胚胎干細(xì)胞具有分化全能性，可以利用這些細(xì)胞建立具有不同基因突變的小鼠個體，從而可以在個體水平上研究基因的功能。然而，目前這一研究所獲得的突變胚胎干細(xì)胞克隆進(jìn)度緩慢，還不能真正支持功能基因組學(xué)研究的需要，造成這一現(xiàn)象的主要原因是大家普遍采用的對突變細(xì)胞克隆逐個鑒定的方法仍然是一個耗時和耗力的策略。
因此，本領(lǐng)域迫切需要建立一種在全基因組范圍內(nèi)的大規(guī)模、高通量獲取基因突變小鼠的方法及相關(guān)技術(shù)，唯有如此才能在真正意義上讓功能基因組研究走上快速發(fā)展的道路，拉動后繼研究的投入和大量基因新功能的發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種大規(guī)模、高通量獲取基因突變小鼠的相關(guān)技術(shù)，即一種建立小鼠全基因組突變胚胎干細(xì)胞庫的方法。本發(fā)明方法可在短時期內(nèi)獲得覆蓋90％以上基因的小鼠突變胚胎干細(xì)胞庫和相應(yīng)的篩選平臺，利用這一系統(tǒng)可以滿足人們對大多數(shù)特定基因進(jìn)行小鼠體內(nèi)研究的需要。
在本發(fā)明第一方面，提供了一種建立大規(guī)模突變胚胎干細(xì)胞庫的方法，包括步驟(a)將基因捕獲載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，所述的基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)是LTR-RNA剪接的受體序列-啟動子-篩選基因-RNA剪接的供體序列-LTR，其中篩選基因不含polyA區(qū)；(b)篩選存活的、帶有篩選基因的胚胎干細(xì)胞；(c)合并存活的胚胎干細(xì)胞，獲得突變胚胎干細(xì)胞庫。
在另一優(yōu)選例中，所述基因捕獲載體中，啟動子選自CMV、PGK、或LTP。
在另一優(yōu)選例中，篩選基因選自Neo、Puro、Hygro、Pac或GFP。
在另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細(xì)胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干細(xì)胞。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種突變胚胎干細(xì)胞庫，所述胚胎干細(xì)胞庫含有的胚胎干細(xì)胞是基因突變的細(xì)胞，且所述的細(xì)胞庫是用以下方法制備的(a)將基因捕獲載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，所述的基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)是LTR-RNA剪接的受體序列-啟動子-篩選基因-RNA剪接的供體序列-LTR，其中篩選基因不含polyA區(qū)；(b)篩選存活的、帶有篩選基因的胚胎干細(xì)胞；
(c)合并存活的胚胎干細(xì)胞，獲得突變胚胎干細(xì)胞庫。
在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞庫含有5-30萬個突變胚胎干細(xì)胞克隆。
在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞庫被分成500-1000個亞庫，每個亞庫含有100-300個突變胚胎干細(xì)胞克隆。
在另一優(yōu)選例中，所述的胚胎干細(xì)胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干細(xì)胞。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明的突變胚胎干細(xì)胞庫的用途，它被用于制備突變胚胎干細(xì)胞庫的cDNA。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變胚胎干細(xì)胞庫被分成500-1000個亞庫，每個亞庫含有100-300個突變胚胎干細(xì)胞克隆，并且每個細(xì)胞亞庫都用于制備亞庫cDNA。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明的突變胚胎干細(xì)胞庫的另一用途，它被用于篩選特定基因突變的胚胎干細(xì)胞克隆。即根據(jù)特定基因的序列，用PCR來篩選亞庫的cDNA樣本，從而選出對應(yīng)的突變的胚胎干細(xì)胞克隆。
在本發(fā)明的第五方面，還通過了一種獲得突變小鼠胚胎干細(xì)胞的方法，包括基因捕獲載體的構(gòu)建、突變胚胎干細(xì)胞克隆組的建立和突變基因位點的鑒定方法。
具體實施例方式
本發(fā)明人利用逆轉(zhuǎn)錄病毒具有的細(xì)胞內(nèi)染色體隨機(jī)低(單)拷貝插入的特性，以及大部分基因具有polyA信號的特點，在胚胎干細(xì)胞上進(jìn)行基因polyA的基因捕獲。如果基因捕獲載體插入到某一個基因中，則該載體提供的篩選基因和插入基因提供的polyA信號位點將賦予該胚胎干細(xì)胞具有抵抗細(xì)胞篩選藥物的特性；如果基因捕獲載體沒有插入在基因區(qū)域中，篩選基因由于自身沒有攜帶polyA的信號，因此轉(zhuǎn)錄的RNA不能穩(wěn)定地存在以及翻譯，因此胚胎干細(xì)胞將死亡。所以經(jīng)過篩選而存活的胚胎干細(xì)胞克隆，都發(fā)生了某個基因被插入基因捕獲載體的事件，由于外源片段的插入會破壞原來基因的功能，因此利用這一方法可在短期內(nèi)建立具有數(shù)量龐大的細(xì)胞克隆組成的突變胚胎干細(xì)胞庫。例如15萬個細(xì)胞克隆組成的突變胚胎干細(xì)胞庫，平均每個基因被突變5次。這些突變胚胎干細(xì)胞庫所具有的突變類型在理論上將覆蓋90％以上的小鼠基因組基因。
具體地，本發(fā)明方法采用polyA捕獲的原理，所用的基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)如下LTR-RNA剪接的受體序列-啟動子-篩選基因-RNA剪接的供體序列-LTR本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建可用常規(guī)方法進(jìn)行。通常，母本質(zhì)粒為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或其它真核表達(dá)載體，例如Clontech公司的pSIR。
篩選基因可以是抗藥基因如Neo、Puro、Hygro、Pac，或者是報告基因如GFP等。用于本發(fā)明的篩選基因均需要去除基因終止密碼子后的polyA信號區(qū)域。
篩選基因可以用在胚胎干細(xì)胞中基因啟動活性的啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，如CMV、PGK、LTP等啟動子。
載體5′端連接有RNA剪接的受體序列(SA)，載體的3′端連接有RNA剪接的供體序列(SD)。此外，在SA和SD的外側(cè)分別是LTR元件。適用于本發(fā)明的SA、SD和LTR元件沒有特別限制，可以選用本領(lǐng)域已知的各種SA、SD和LTR元件。
所用的母本質(zhì)粒是自身失活型的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，因此當(dāng)用該質(zhì)粒產(chǎn)生的假病毒感染細(xì)胞，插入到染色體上的載體后，其5′端LTR自動失活，篩選基因Neo的表達(dá)因此不受LTR的干擾。
基因捕獲載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞中可以利用常規(guī)方法進(jìn)行，如假病毒感染法或者質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移法。
導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞后，基因捕獲載體插入到基因染色體中有4種情況，分別為1)插入到基因的5′調(diào)控區(qū)，造成基因調(diào)控區(qū)破壞而不能正常轉(zhuǎn)錄下游基因；2)插入在基因外顯子區(qū)域中，如果該外顯子是蛋白編碼區(qū)域，則造成蛋白編碼區(qū)被打斷；3)插入到基因內(nèi)含子中，在RNA剪接過程中，Neo基因?qū)⒑驮搩?nèi)含子的上下游外顯子融合成一個mRNA分子，如果該內(nèi)含子下游的外顯子是蛋白編碼序列，則造成蛋白編碼區(qū)被打斷；4)插入到基因不編碼蛋白的外顯子中，如果是插入在基因5′端的非編碼區(qū)外顯子，則產(chǎn)生的RNA將只翻譯Neo基因的讀框，被插入的基因不能翻譯，如果是插入在基因3′端的非編碼區(qū)，則對基因的功能可能沒有影響。
不論是那種情況，如果基因捕獲載體插入到某一個基因中，則該載體提供的篩選基因和插入基因提供的polyA信號位點將賦予該胚胎干細(xì)胞具有抵抗細(xì)胞篩選藥物的特性；如果基因捕獲載體沒有插入在基因區(qū)域中，篩選基因由于自身沒有攜帶polyA的信號，因此轉(zhuǎn)錄的RNA不能穩(wěn)定地存在以及翻譯，因此胚胎干細(xì)胞將死亡。經(jīng)過篩選而存活的胚胎干細(xì)胞克隆，都發(fā)生了某個基因被插入基因捕獲載體的事件，因此都是突變的胚胎干細(xì)胞。
將基因捕獲載體導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞后，可用常規(guī)方法篩選和培養(yǎng)插入了基因捕獲載體的胚胎干細(xì)胞。其過程、步驟和操作條件都是本領(lǐng)域中已知的。
對于篩選出的各突變的胚胎干細(xì)胞，將其合并后就獲得了本發(fā)明的突變的胚胎干細(xì)胞庫。用本發(fā)明方法可以在短時間內(nèi)獲得含有5-30萬個，較佳地10-20萬個，更佳地約15萬個突變胚胎干細(xì)胞克隆的細(xì)胞庫。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的細(xì)胞庫將進(jìn)一步分成500-1000個亞庫，每個亞庫具有150-300種胚胎干細(xì)胞克隆。針對每一個亞庫，將制備相應(yīng)的胚胎干細(xì)胞的混合cDNA，利用這些cDNA，可以采用PCR或其它方法方便地確定所需要的突變胚胎干細(xì)胞克隆所在的亞庫，然后到相應(yīng)的亞庫中對每個胚胎干細(xì)胞克隆進(jìn)行篩選，獲得相應(yīng)的突變胚胎干細(xì)胞克隆。
一種優(yōu)選的獲得特定基因突變的胚胎干細(xì)胞克隆的方法是，根據(jù)特定基因的序列，用PCR來篩選亞庫的cDNA樣本，將候選的含有特定基因插入突變的胚胎干細(xì)胞克隆限定在某(幾)個亞庫中。然后，對于亞庫中的每個胚胎干細(xì)胞克隆，用相同的PCR方法篩選出相應(yīng)的含有特定基因插入突變的胚胎干細(xì)胞克隆。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點在于(1)與傳統(tǒng)的用同源重組方式進(jìn)行基因剔除的方法相比，本發(fā)明方法具有高效、經(jīng)濟(jì)的特點，特別是免除了需要針對每個基因構(gòu)建基因打靶載體的繁瑣過程，從而為大規(guī)模、高通量獲取基因突變小鼠奠定了基礎(chǔ)。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1基因捕獲載體的構(gòu)建母本質(zhì)粒為pSIR(Clontech公司)，篩選基因是沒有polyA信號的Neo基因；用PGK作為Neo的啟動子。載體的3′端連接有RNA剪接的供體序列(SD)，載體5′端連接有RNA剪接的受體序列(SA)。質(zhì)粒構(gòu)建方法按常規(guī)進(jìn)行，從而獲得結(jié)構(gòu)如下的基因捕獲載體LTR-SA-PGK-Neo-SD-LTR。
所用的母本質(zhì)粒是自身失活型的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，因此當(dāng)用該質(zhì)粒產(chǎn)生的假病毒感染細(xì)胞，并插入到染色體上的載體后，其5′端LTR自動失活，篩選基因Neo的表達(dá)因此不受LTR的干擾。
實施例2突變胚胎干細(xì)胞庫的建立本實施例中采用假病毒感染法，并使用Orbigen公司的包裝細(xì)胞系Phoenix。
包裝細(xì)胞培養(yǎng)在盛有DME/10％FBS的培養(yǎng)基的100mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長到60-70％的密度(2-4×106)，用磷酸鈣共沉淀方法轉(zhuǎn)染10-15ug實施例1建立的基因捕獲載體質(zhì)粒，48小時后，收集細(xì)胞上清，離心后上清可儲于-80℃?zhèn)溆茫灰部捎煤珿418(0.5mg/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行對上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和單克隆篩選。一星期后挑選細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清的滴度，選擇可以產(chǎn)生高滴度的細(xì)胞系，一般可以達(dá)到每毫升培養(yǎng)上清105-106的病毒顆粒。
胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，滋養(yǎng)層細(xì)胞為用絲裂霉素處理過的原代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)有Neo基因的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，從液氮罐中取出一支凍存的胚胎干細(xì)胞，迅速投入37℃水?。挥脽o菌的巴斯德管吸出細(xì)胞放入帶10ml ES培養(yǎng)液的15ml Falcon離心管中，室溫下1000rpm離心5分鐘；棄上清，細(xì)胞用10ml 1×PBS洗滌一次，同上離心去除上清；用5ml培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞接種到鋪有絲裂霉素處理的滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板的一個孔中。細(xì)胞置于37℃，10％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，保持足夠的濕度；次日，以1×PBS洗去死細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每天如此操作，直至細(xì)胞長到合適的密度；吸去胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液，用5ml 1×PBS洗滌細(xì)胞；加入2ml 1×Trypsine-EDTA(含有1％雞血清)，在顯微鏡下跟蹤消化的進(jìn)程；待細(xì)胞消化到一定程度后(滋養(yǎng)層細(xì)胞成圓形，胚胎干細(xì)胞集落松散)，加入5ml培養(yǎng)液，終止消化反應(yīng)，取出細(xì)胞，加入到15ml Falcon離心管中，室溫1000rpm離心5分鐘；用培養(yǎng)液重新懸浮胚胎干細(xì)胞，接種到鋪有絲裂霉素處理的滋養(yǎng)層細(xì)胞的100mm培養(yǎng)皿中；每天換新鮮的培養(yǎng)液，直至胚胎干細(xì)胞長到合適的密度，這一過程通常需要2-3天；吸去胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入3ml上述獲得的假病毒儲存液內(nèi)含4ug/ml的polybrene，放置3小時，加入7ml胚胎干細(xì)胞培液；培養(yǎng)48小時后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2ml 1×Trypsine-EDTA(含有1％雞血清)，待細(xì)胞消化到一定程度后，同上離心洗滌后，按一定比例分置到100mm培養(yǎng)皿中，加入含有G418的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞克隆的篩選，使得每個平皿含100-300個細(xì)胞克隆(作為一個細(xì)胞亞庫)；待克隆長到一定程度后，加入1×Trypsine-EDTA(含有1％雞血清)消化，消化后將胚胎干細(xì)胞分為兩份，一份凍存，一份用于提取mRNA。
重復(fù)上述程序，共建立突變胚胎干細(xì)胞亞庫500-1000份，每個亞庫含100-300個細(xì)胞克隆。
實施例3突變胚胎干細(xì)胞庫cDNA的制備對于實施例2建立的每個突變胚胎干細(xì)胞亞庫，相應(yīng)建立一份cDNA，共相應(yīng)制備500-1000份cDNA；有關(guān)細(xì)胞mRNA和cDNA的制備方法按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，采用polydT和隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物。
實施例4突變胚胎干細(xì)胞克隆篩選對于篩選含指定基因突變的胚胎干細(xì)胞克隆，采用常規(guī)的PCR的方法進(jìn)行，5′端引物的設(shè)計選擇基因捕獲載體3′端序列，3′端引物選擇待研究基因終止編碼子后附近的外顯子序列，必要時可以設(shè)計成巢式PCR引物。
用上述引物對實施例3中獲得的所有突變胚胎干細(xì)胞亞庫的cDNA進(jìn)行PCR篩選，對獲得有陽性產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析和驗證，對驗證的獲得陽性的cDNA庫，復(fù)蘇相應(yīng)的胚胎干細(xì)胞亞庫，按一定稀釋度將細(xì)胞鋪在滋養(yǎng)層細(xì)胞上，使得胚胎干細(xì)胞長成細(xì)胞克隆，挑選2-3倍亞庫克隆數(shù)的細(xì)胞克隆，一份用于凍存，一份用于mRNA的提取和cDNA的制備并用于PCR篩選，獲得預(yù)計PCR產(chǎn)物的胚胎干細(xì)胞cDNA即是需要的突變胚胎干細(xì)胞克隆。
在獲得的該克隆細(xì)胞的染色體中，所需要研究的基因被基因捕獲載體插入，通過分析PCR產(chǎn)物的序列可以知道載體插入的位點。鑒定并獲得所需要的突變胚胎干細(xì)胞克隆后，可以將相應(yīng)的凍存的胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)擴(kuò)增后用于建立基因剔除小鼠或可以進(jìn)行其它研究。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種建立大規(guī)模突變胚胎干細(xì)胞庫的方法，其特征在于，包括步驟(a)將基因捕獲載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，所述的基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)是LTR-RNA剪接的受體序列-啟動子-篩選基因-RNA剪接的供體序列-LTR，其中篩選基因不含polyA區(qū)；(b)篩選存活的、帶有篩選基因的胚胎干細(xì)胞；(c)合并存活的胚胎干細(xì)胞，獲得突變胚胎干細(xì)胞庫。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因捕獲載體中，啟動子選自CMV、PGK、或LTP；篩選基因選自Neo、Puro、Hygro、Pac或GFP。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干細(xì)胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干細(xì)胞。
4.一種突變胚胎干細(xì)胞庫，其特征在于，所述胚胎干細(xì)胞庫含有的胚胎干細(xì)胞是基因突變的細(xì)胞，且所述的細(xì)胞庫是用以下方法制備的(a)將基因捕獲載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，所述的基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)是LTR-RNA剪接的受體序列-啟動子-篩選基因-RNA剪接的供體序列-LTR，其中篩選基因不含polyA區(qū)；(b)篩選存活的、帶有篩選基因的胚胎干細(xì)胞；(c)合并存活的胚胎干細(xì)胞，獲得突變胚胎干細(xì)胞庫。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞庫，其特征在于，所述細(xì)胞庫含有5-30萬個突變胚胎干細(xì)胞克隆。
6.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞庫，其特征在于，所述細(xì)胞庫被分成500-1000個亞庫，每個亞庫含有100-300個突變胚胎干細(xì)胞克隆。
7.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞庫，其特征在于，所述的胚胎干細(xì)胞是小鼠、大鼠、兔、蛙、或人的胚胎干細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求4所述的突變胚胎干細(xì)胞庫的用途，其特征在于，用于制備突變胚胎干細(xì)胞庫的cDNA。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的突變胚胎干細(xì)胞庫被分成500-1000個亞庫，每個亞庫含有100-300個突變胚胎干細(xì)胞克隆，并且每個細(xì)胞亞庫都用于制備亞庫cDNA。
10.如權(quán)利要求4所述的突變胚胎干細(xì)胞庫的用途，其特征在于，被用于篩選特定基因突變的胚胎干細(xì)胞克隆。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用基因捕獲技術(shù)建立大規(guī)模的覆蓋小鼠全基因組的突變小鼠胚胎干細(xì)胞庫的建立方法。它包括步驟(a)將基因捕獲載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，所述基因捕獲載體從5′至3′的結(jié)構(gòu)是LTR－RNA剪接的受體序列－啟動子－篩選基因－RNA剪接的供體序列－LTR，其中篩選基因不含polyA區(qū)；(b)篩選存活的、帶有篩選基因的胚胎干細(xì)胞；和(c)合并存活的胚胎干細(xì)胞，獲得突變胚胎干細(xì)胞庫。本發(fā)明還提供了突變基因位點的鑒定方法。本發(fā)明方法為大規(guī)模、高通量獲取基因突變小鼠奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK1548535SQ0311685
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月12日
發(fā)明者顧華, 黃芳, 王鑄鋼, 顧 華 申請人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司