專利名稱：：一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，屬于動物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景動物疾病模型主要用于實驗生理學(xué)、實驗病理學(xué)和實驗治療學(xué)(包括新藥篩選)的研究。人類疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，若以人本身作為實驗對象來深入探討疾病的發(fā)生機(jī)制，推動醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展則非常緩慢，且臨床積累的經(jīng)驗在時間和空間上都存在局限性，而且許多實驗在道義上和方法上也受到限制；而借助動物模型進(jìn)行間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實驗結(jié)果并與人類疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便、更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。誘發(fā)性動物模型是通過物理、生物、化學(xué)等致病因素的作用，人為誘發(fā)出的具有類似人類疾病特征的動物模型。誘發(fā)性動物模型制作方法簡便，實驗條件容易控制，重復(fù)性好，在短時間內(nèi)可誘導(dǎo)出大量疾病模型，廣泛用于藥物篩選、毒理、傳染病、腫瘤、病理機(jī)制的研究。周圍血管內(nèi)膜增生及其由此所造成的管腔狹窄乃至阻塞，一直是困擾血管外科的一大難題。針對周圍血管內(nèi)膜增生發(fā)病機(jī)制的各個環(huán)節(jié)，需要進(jìn)行大量的動物實驗，因此，致周圍血管內(nèi)膜增生動物模型本身有重大的實用價值，可以對各種藥物的藥效及作用機(jī)理進(jìn)行驗證，進(jìn)一步探索血管內(nèi)膜增生的發(fā)病機(jī)理及有效治療措施，因此，科學(xué)地建立致周圍血管內(nèi)膜增生動物模型是發(fā)現(xiàn)對周圍血管內(nèi)膜增生疾病更為有效治療藥物與疫苗的有利前提。血管內(nèi)膜增生及由此所造成的管腔狹窄是高血壓和血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病共同的生理特征,與血管重塑密切相關(guān),最終將影響靶器官的功能。血管內(nèi)膜增生發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為可能與內(nèi)皮功能障礙與損傷、血小板聚集與血栓形成、血管平滑肌細(xì)胞(Vasularsmoothmusclecell,VSMC)向內(nèi)膜遷移、增殖及合成大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)等多種因素有關(guān)。醫(yī)學(xué)界認(rèn)為血管內(nèi)膜增生最主要的機(jī)制之一就是激活了的VSMC中原癌基因過度表達(dá),造成細(xì)胞大量增殖。血管內(nèi)膜增生長期折磨著患者，也給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前還沒有成熟的動物模型出現(xiàn)，因此建立具有科學(xué)性、重復(fù)性與多樣性的動物模型具有十分重要的意義，以此推動醫(yī)學(xué)界對血管內(nèi)膜增生的研究，進(jìn)一步揭示血管內(nèi)膜增生的發(fā)病機(jī)理，使血管內(nèi)膜增生的研究更加規(guī)范化，標(biāo)準(zhǔn)化，從而更加準(zhǔn)確、客觀的驗證各種藥物對血管內(nèi)膜增生的療效機(jī)理。
發(fā)明內(nèi)容針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，以建立一種周圍血管內(nèi)膜增生的動物模型，彌補了目前沒有成熟的動物模型的不足，可用于研究周圍血管內(nèi)膜增生疾病的發(fā)病機(jī)理以及治療該病的藥物的篩選和療效觀察等。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的-一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，包括以下步驟(1).取至少一組健康哺乳動物，對其中至少一組靜脈推注注射用冬凌草甲素，連續(xù)注射712天，"每天注射一次，劑量為0.30mg/kgcf'15mg/kgcf1;(2).將動物處死，取動物耳緣動脈或周邊小動脈作病理切片，光鏡下顯示內(nèi)膜明顯增厚，血管腔面積明顯縮小變窄，血管內(nèi)膜增加厚度、血管腔面積與對照組病理切片相比較有顯著性差異(P<0.01)，則周圍血管內(nèi)膜增生動物模型建立成功；若無上述現(xiàn)象，則周圍血管內(nèi)膜增生動物模型未建立成功。所述哺乳動物是新西蘭白兔，注射劑量為7.0mg/kgd—17.5mg/kgd—'。所述哺乳動物是SD大鼠，注射劑量為10mg/kgcT15mg/kgd—1。所述哺乳動物是比格犬，注射劑量為4.Omg/kgcf14.5mg/kgcf1。所述哺乳動物是恒河猴，注射劑量為0.30mg/kgd—10.35mg/kgd—'。所述注射用冬凌草甲素由山東弘立動物試驗研究有限公司制備，批號0706001。本發(fā)明建立的周圍血管內(nèi)膜增生動物模型重復(fù)性好，臨床癥狀明顯，操作方法簡單、安全、有效，造模成功率100%,適合大規(guī)模動物實驗。以本發(fā)明所述的方法建立的動物模型可以對各種藥物的藥效及作用機(jī)理進(jìn)行驗證，進(jìn)一步探索血管內(nèi)膜增生的發(fā)病機(jī)理及有效治療措施，因此，致周圍血管內(nèi)膜增生動物模型是發(fā)現(xiàn)對周圍血管內(nèi)膜增生疾病更為有效治療藥物與疫苗的有利前提。本發(fā)明提出了靜脈推注注射用冬凌草甲素可致兔、大鼠、犬與猴周圍血管內(nèi)膜增生的理論，為周圍血管內(nèi)膜增生的病理研究及治療周圍血管內(nèi)膜增生藥物的篩選提供了多種具有科學(xué)性與重復(fù)性的動物模型。該模型具有重要的實用價值和理論研究價值。圖1為對照組兔耳緣動脈切片光鏡圖OIOO);圖2為實驗組兔耳緣動脈病理切片光鏡圖(*100);圖3為對照組大鼠周邊小動脈切片光鏡圖(*100);圖4為實驗組大鼠周邊小動脈病理切片光鏡圖(*100);圖5為對照組犬周邊小動脈切片光鏡圖(*100);圖6為實驗組犬周邊小動脈病理切片光鏡圖(*100);圖7為對照組猴周邊小動脈切片光鏡圖(*100);圖8為實驗組猴周邊小動脈病理切片光鏡圖(*100)。具體實施方式實施例1:1.1建立致周圍血管內(nèi)膜增生(Intimahyperplasia，IH)兔動物模型，步驟為(1).選體重1.21.8kg的雄性健康新西蘭白兔10只，普通級，由山東省農(nóng)科院種兔廠提供，生產(chǎn)許可證號"SCXK(魯)20040013",隨機(jī)分為對照組與試驗組，各5只。對實驗組進(jìn)行耳緣靜脈推射注射用冬凌草甲素，每天注射一次，劑量為7.2mg/kg*d—',連續(xù)注射10d;對照組正常飼養(yǎng)10天。試驗組與對照組保持同等飼養(yǎng)條件與飼養(yǎng)環(huán)境。(2).將實驗組及對照組動物均處死，分離出耳緣動脈，用10%福爾馬林溶液原位固定，脫水、包埋、切片，作VanGieson氏染色和HE染色。1.2現(xiàn)象及結(jié)果1.2.1光鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)比較對照組正常兔耳緣動脈HE染色后，在低倍鏡下觀察內(nèi)膜完整,管壁厚薄均勻，層次清晰，細(xì)胞排列有序，如圖l所示；試驗組HE染色后，于低倍鏡下觀察血管內(nèi)膜明顯增厚，中層平滑肌細(xì)胞大量增生，穿過內(nèi)彈力纖維膜向管腔遷移,管腔面積明顯縮小，內(nèi)膜及中膜有大量脂質(zhì)沉積，有泡沫細(xì)胞形成，管壁細(xì)胞排列紊亂，彈力板斷裂，如圖2所示。1.2.2兩組耳緣動脈管腔面積及內(nèi)膜厚度的比較-用計算機(jī)對兩組兔耳緣動脈彈力纖維染色(VanGieson氏染色)后的切片圖像進(jìn)行分析，如表1所示，結(jié)果顯示內(nèi)膜厚度試驗組〉對照組(P〈0.01);管腔面積試驗組<對照組(P<0.01)。表l兔耳緣動脈血管管腔面積、內(nèi)膜厚度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注與對照組比較，*P<0.01。1.2.3結(jié)論由上述可知，對新西蘭白兔耳緣靜脈推注注射用冬凌草甲素可誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生、血管面積變小、血管腔道狹窄，對照組則未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象產(chǎn)生，證明注射用冬凌草甲素可致新西蘭白兔周圍血管內(nèi)膜增生，建立致周圍血管內(nèi)膜增生兔動物模型成功。實施例2:2.1建立致周圍血管內(nèi)膜增生(Intimahyperplasia,IH)大鼠動物模型，步驟如下(1).取健康雄性SD大鼠10只，體重310350g,由山東大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號"SCXK(魯)20040004",隨機(jī)分為對照組與試驗組(各五只)。對實驗組進(jìn)行尾靜脈推注注射用冬凌草甲素，每天注射一次，劑量為12mg/kgcf1，連續(xù)注射10d;對照組正常飼養(yǎng)10天。試驗組與對照組保持同等飼養(yǎng)條件與詞養(yǎng)環(huán)境。(2).辨SD大鼠處死，在每只大鼠的周邊小動脈的相同部位取血管0.5cm,福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，每段血管間斷均勻切片810張，HE染色,每組各隨機(jī)取6片進(jìn)行光鏡觀察，照相和圖像分析,計算出I/M(內(nèi)膜/中膜)面積比和I/M厚度比。2.2現(xiàn)象及結(jié)果2.2.1血管形態(tài)學(xué)變化比較-經(jīng)光鏡檢査，對照組大鼠周邊小動脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑，中膜VSMC排列整齊，如圖3所示；試驗組內(nèi)膜明顯增生,新生內(nèi)膜中可見局灶性細(xì)胞增殖，內(nèi)膜呈進(jìn)行性彌漫性增厚，增厚的內(nèi)膜中以VSMC為主，如圖4所示，說明冬凌草甲素可致大鼠血管內(nèi)膜增生。2.2.2圖像分析結(jié)果將兩組大鼠的I/M厚度比和I/M面積比進(jìn)行比較,如表2所示，結(jié)果顯示1/M厚度比對照組<試驗迫飛P<0.01)，1/M面積比對照組>試驗組(P<0.01)。表2大鼠主動脈病理切片圖像分析結(jié)果(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與對照組比較，*P<0.01。2.2.3結(jié)論由上述可知，實驗組的血管內(nèi)膜增生，內(nèi)膜呈進(jìn)行性彌漫性增厚，對照組則未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象發(fā)生，證明了注射用冬凌草甲素可致大鼠周圍血管內(nèi)膜增生，建立致周圍血管內(nèi)膜增生大鼠動物模型成功。實施例3:3.1建立致周圍血管內(nèi)膜增生犬動物模型，步驟如下(1).取健康比格犬10只，雌雄不拘，體重1520kg，常規(guī)飼養(yǎng)，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號"SCXK(魯)20040004"，隨機(jī)分為對照組與試驗組(各5只)。對試驗組進(jìn)行前肢皮下頭靜脈推注注射用冬凌草甲素，每天注射一次，劑量為4.2mg/kgcT,連續(xù)注射10d;對照組正常詞養(yǎng)10天。試驗組與對照組保持同等飼養(yǎng)條件與飼養(yǎng)環(huán)境。(2).將兩組動物均處死，在周邊小動脈相同部位處取血管0.5cm,取已固定的周邊小動脈石蠟包埋,厚5ixin連續(xù)切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察周邊小動脈內(nèi)膜和中層的變化，進(jìn)行光鏡觀察，照相，使用計算機(jī)圖像分析儀測量周邊小動脈內(nèi)膜的厚度及面積。3.2現(xiàn)象與結(jié)果3.2.1周邊小動脈組織病理學(xué)變化比較試驗組比格犬的周邊小動脈內(nèi)膜和中層明顯增厚，局部明顯突起，中層靜止平滑肌細(xì)胞發(fā)生由收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)換，向內(nèi)膜遷移、增殖并分泌基質(zhì)形成過度增殖的新生內(nèi)膜，如圖6所示，與對照組(如圖5所示)比較差異有非常顯著性(P〈0.01)。3.2.2圖像分析結(jié)果將兩組犬的血管內(nèi)膜的厚度與面積進(jìn)行比較，如表3所示，結(jié)果顯示，血管內(nèi)膜厚度比較對照組〈試驗組(P〈0.01)，血管內(nèi)膜面積比較對照組〉試驗組(P〈0.01)。表32周邊小動脈病理切片圖像分析結(jié)果(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對照組比較，*P<0.01。3.2.3結(jié)論試驗組健康比格犬經(jīng)靜脈推注注射用冬凌草甲素后，周邊小動脈血管內(nèi)膜增生，內(nèi)膜與中層明顯增厚，血管內(nèi)膜的厚度試驗組〉對照組，血管內(nèi)膜面積試驗組<對照組，證明注射用冬凌草甲素可致比格犬周圍血管內(nèi)膜增生，建立致周圍血管內(nèi)膜增生比格犬動物模型成功。實施例4:4.1建立致周圍血管內(nèi)膜增生猴動物模型，步驟如下(1).取健康雄性恒河猴10只，體重3.77.3kg,單籠飼養(yǎng)，猴舍通風(fēng)良好，自然光照，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號"SCXK(魯)20040004"，隨機(jī)分為對照組與試驗組(各5只)。對實驗組進(jìn)行后肢皮下隱靜脈推注注射用冬凌草甲素，每天注射一次，劑量為0.32^g/kg'cf1,連續(xù)注射10d;對照組正常飼養(yǎng)10天。試驗組與對照組保持同等飼養(yǎng)條件與詞養(yǎng)環(huán)境。(2).處死恒河猴，在周邊小動脈相同部位處取血管0.5cm。將標(biāo)本石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色后，行光鏡檢査，照相。使用計算機(jī)圖像分析儀測量動脈內(nèi)膜的厚度及面積。4.2現(xiàn)象與結(jié)果4.2.1周邊小動脈的組織病理學(xué)變化比較試驗組經(jīng)靜脈注射注射用冬凌草甲素7d后周邊小動脈內(nèi)膜和中膜中VSMC細(xì)胞大量增殖，中膜中增生VSMC細(xì)胞向內(nèi)膜大量遷移，少數(shù)遷移殖至內(nèi)膜后繼續(xù)大量增值，血管內(nèi)膜增厚，使血管腔道狹窄乃至完全閉塞，如圖8所示，與對照組(如圖7所示)比較有顯著性差異(P〈0.01)。..4.2.2圖像分析結(jié)果將兩組健康雄性恒河猴的血管內(nèi)膜、血管中膜的厚度與面積進(jìn)行比較，如表4所示，結(jié)果顯示血管內(nèi)膜厚度比較對照組〈試驗組(P〈0.01)，血管內(nèi)膜面積比較對照組>試驗組(P〈0.01)。表4恒河猴主動脈病理切片圖像分析結(jié)果(x土s)組<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與對薛組比較，*P<0.01。4.2.3結(jié)論試驗組經(jīng)靜脈推注注射用冬凌草甲素后，血管內(nèi)膜增厚，血管腔道狹窄乃至完全閉塞，周邊小動脈內(nèi)膜的厚度試驗組>對照組，周邊小動脈內(nèi)膜面積試驗組<對照組，證明注射用冬凌草甲素可致恒河猴周圍血管內(nèi)膜增生，建立了致周圍血管內(nèi)膜增生恒河猴動物模型成功。權(quán)利要求1.一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，其特征在于包括以下步驟(1).取至少一組健康哺乳動物，對其中至少一組靜脈推注注射用冬凌草甲素，連續(xù)注射7～12天，每天注射一次，劑量為0.30mg/kg·d-1～15mg/kg·d-1；(2).將動物處死，取動物耳緣動脈或周邊小動脈作病理切片，光鏡下顯示內(nèi)膜明顯增厚，血管腔面積明顯縮小變窄，血管內(nèi)膜增加厚度、血管腔面積與對照組病理切片相比較有顯著性差異，則周圍血管內(nèi)膜增生動物模型建立成功。2.根據(jù)權(quán)利夢求l所述的一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，其特征在于所述哺乳動物是新西蘭白兔，注射劑量為7.0mg/kgd—'7.5mg/kgd—'。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，其特征在于所述哺乳動物是SD大鼠，注射劑量為10mg/kgd—'15mg/kgcf1。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，其特征在于所述哺乳動物是比格犬，注射劑量為4.0mg/kgd—'4.5rag/kgd—'。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，其特征在于所述哺乳動物是恒河猴，注射劑量為0.30mg/kgcT10.35mg/kgd—'。全文摘要本發(fā)明公開了一種建立周圍血管內(nèi)膜增生動物模型的方法，步驟為取健康哺乳動物，對其靜脈推注注射用冬凌草甲素，連續(xù)注射7～12天，每天注射一次，劑量為0.30mg/kg·d^-1～15mg/kg·d^-1；然后將動物處死，取動物耳緣動脈或周邊小動脈作病理切片，光鏡下顯示內(nèi)膜明顯增厚，血管腔面積明顯縮小變窄，血管內(nèi)膜增加厚度、血管腔面積與對照組病理切片相比較有顯著性差異，則周圍血管內(nèi)膜增生動物模型建立成功。本發(fā)明重復(fù)性好，臨床癥狀明顯，操作方法簡單、安全、有效，造模成功率100％，適合大規(guī)模動物實驗，具有重要的實用價值和理論研究價值。文檔編號A61B19/00GK101243993SQ20081001436公開日2008年8月20日申請日期2008年3月10日優(yōu)先權(quán)日2008年3月10日發(fā)明者田久,厲保秋,黃山英申請人:山東大學(xué)