專利名稱：一種與雄激素產(chǎn)生下降相關(guān)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及男性生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種與雄激素產(chǎn)生下降相關(guān)的基因，以及雄激素合成下降的雄性小鼠模型的建立方法。
背景技術(shù)：
隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的飛速發(fā)展，醫(yī)療水平不斷提高，全世界范圍內(nèi)的人口平均壽命普遍延長，老年人比例在上升，世界正在步入老齡化時(shí)代。估計(jì)世界上60歲以上的人口將從 1999年的5. 93億(約占總?cè)丝诘?0% )增加到2050年的19. 7億(約占總?cè)丝诘?2%)。 老齡化時(shí)代使更多的男性有機(jī)會(huì)經(jīng)歷更年期階段，給他們的身體和生活帶來諸多煩惱和不適。目前全世界有4. 08億，亞洲有2億，美國有2. 5千萬中老年男性正經(jīng)歷著雄激素缺乏問題的困擾，再過30年，該數(shù)字可能會(huì)增加一倍。因此關(guān)注中老年男性雄激素缺乏，提高老年人生活質(zhì)量，已成為全球關(guān)注的醫(yī)學(xué)重要課題。
目前，對于中老年男性雄激素缺乏的發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究尚無理想的動(dòng)物模型。國內(nèi)有人采用自然衰老動(dòng)物作為模型研究，存在飼養(yǎng)時(shí)間長，成本高等問題。因此， 目前還沒有非常成熟的雄激素缺乏或衰老的動(dòng)物模型。
中老年雄激素缺乏發(fā)病機(jī)制仍不清楚，雄激素因何原因出現(xiàn)不同程度的下降，該領(lǐng)域的研究引起很多學(xué)者廣泛的興趣。有研究結(jié)果顯示，由脂類代謝紊亂導(dǎo)致的男性肥胖患者體內(nèi)雄激素水平存在不同程度的下降，在脂類代謝恢復(fù)體重減輕后會(huì)有所提升，可以提示脂類代謝紊亂可能與雄激素缺乏有關(guān)。PLIN在參與脂類代謝的過程中發(fā)揮全局性的調(diào)控作用，主要包括調(diào)控膽固醇代謝和甘油三酯代謝兩個(gè)方面。
膽固醇是合成雄激素的前體物質(zhì)，其在睪丸間質(zhì)細(xì)胞膽固醇側(cè)鏈裂解酶 (P450scc)的作用下轉(zhuǎn)化成孕烯醇酮，孕烯醇酮在各種類固醇激素合酶的作用下合成雄激素，PLIN可能通過影響膽固醇代謝來干擾雄激素合成。有研究結(jié)果顯示，PLIN基因 rsl052700*A變異型可以提高總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平以及13041A/14995A亞型能夠降低高密度脂蛋白膽固醇的含量。除此之外，研究顯示雄激素可以降低總膽固醇和低密 度脂蛋白膽固醇水平，進(jìn)而有利于膽固醇代謝。
目前，現(xiàn)有技術(shù)中對于PLIN基因是否可以影響動(dòng)物雄激素的水平還沒有研究和報(bào)導(dǎo)。有必要進(jìn)一步關(guān)注PLIN基因與雄激素之間的關(guān)系。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種雄性小鼠雄激素產(chǎn)生下降新的相關(guān)基因PLIN。
本發(fā)明還公開了一種雄激素產(chǎn)生下降的雄性大鼠模型的建立方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種脂粒外周蛋白(Perilipin，或PLIN)或其編碼基因的用途，用于制備檢測雄激素缺乏疾病的試劑。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性擴(kuò)增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑，其是特異性識(shí) 別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性擴(kuò)增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對； 或是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所 示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑盒，其中包 括容器，以及位于容器中的特異性識(shí)別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1、各組大鼠血清總睪酮水平柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量組和高劑 量組)血清總睪酮(TT)濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.039)。圖2、各組大鼠血清超氧化物歧化酶活力柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量 組和高劑量組)血清超氧化物歧化酶(S0D)活力下降，且隨染毒劑量增加，超氧化物歧化酶 (S0D)活力下降幅度加大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 0001)。圖3、各組大鼠血清丙二醛含量柱狀圖。與對照組比較，模型組(低劑量組和高劑 量組)血清丙二醛(MDA)含量升高，且隨染毒劑量增加，丙二醛(MDA)含量升高幅度加大， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0. 008)。圖4、PLIN-A和PLIN-B在模型組和對照組的差異表達(dá)。M Marker I ；H :模型組； C :對照組。PLIN-A和PLIN-B在模型組的表達(dá)水平與對照組相比，明顯下調(diào)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)脂粒外周蛋白(perilipin，或PLIN)基因是 一種與雄激素產(chǎn)生下降相關(guān)的基因，可以該基因?yàn)闃?biāo)志物，來確定待測對象的雄激素產(chǎn)生 情況。PLIN基因及其用途PLIN基因是一種參與脂類代謝過程的基因，其編碼的蛋白質(zhì)在脂類代謝中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其高度保守地存在于哺乳動(dòng)物中。人PLIN基因的核苷酸序列參見GenBank 登錄號(hào)MM : 170290所示，編碼513aa的蛋白質(zhì)；大鼠的PLIN基因的核苷酸序列參見 GenBank登錄號(hào)NM_013094.1所示，編碼517aa的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人通過分析雄激素缺乏模型的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PLIN基因與雄性激素的產(chǎn)生下降密切相關(guān)。在雄激素缺乏動(dòng)物模型中，PLIN基因及其亞型發(fā)生顯著的下調(diào)。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，可以以PLIN基因作為檢測(確定、鑒定或診斷)哺乳動(dòng)物雄激素缺乏的標(biāo)志物(標(biāo)記物)。通過分析PLIN基因的表達(dá)情況(包括基因水平上或蛋白水平上)，從而得知受試者的雄激素產(chǎn)生情況，為疾病的診斷或預(yù)后提供依據(jù)，或可早期評估受試者罹患雄激素缺乏相關(guān)疾病(如更年期)的可能性。
可采用各種技術(shù)來檢測PLIN基因或其編碼的蛋白的表達(dá)情況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中?；蛩缴?，檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA，或針對mRNA ;可用等已有技術(shù)如(但不限于)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Southern印跡法、DNA序列分析等。蛋白水平上，可用的已有技術(shù)如(但不限于)=Western印跡法、酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)、SDS-PAGE 等，從而實(shí)現(xiàn)蛋白水平上的定性或定量。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，通過定量或半定量的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法來分析樣品中PLIN基因或其編碼的蛋白的表達(dá)情況以及表達(dá)量，從而可作出判斷。
較佳地，還設(shè)置正常的對照組，以確定PLIN基因或其編碼的蛋白在正常動(dòng)物體中的表達(dá)情況。
試劑和試劑盒
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測PLIN基因的表達(dá)情況的試劑。所述的試劑是特異性識(shí)別PLIN蛋白或其編碼基因的試劑。包括但不限于抗PLIN蛋白的抗體、特異性擴(kuò)增PLIN基因的引物。
作為本發(fā)明的一種選擇方式，所述的試劑例如是特異性擴(kuò)增PLIN基因的引物對。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的引物對具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN基因)；或者所述的引物對具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN-A基因)；所述的引物對具有SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN-B基因)。上述引物對擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物具有合適的長度，且特異性高，對于復(fù)雜體系的擴(kuò)增也具有良好的特異性，特別適合用于定量或半定量地檢測PLIN基因的表達(dá)情況。
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測PLIN基因的表達(dá)情況的試劑盒，該試劑盒包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對具有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN基因)；或者所述的引物對具有SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN-A基因)；所述的引物對具有SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6所示的序列(用于擴(kuò)增PLIN-B基因)。
此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑， 包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對照液、洗液等?；蛘?，所述的試劑盒中還可包括酶聯(lián)免疫試劑，二抗，顯色液等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或核酸序列分析軟件等。
雄激素缺乏動(dòng)物模型
本發(fā)明中，所述的“非人哺乳動(dòng)物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴。所述的非人哺乳動(dòng)物在基因組的組成、器官解剖、個(gè)體的發(fā)育、代謝方式、疾病發(fā)病機(jī)制等方面和人類接近，可良好地應(yīng)用于人類疾病發(fā)病機(jī)制、藥物藥理學(xué)研究等方面。優(yōu)選的，所述的非人哺乳動(dòng)物是鼠，如大鼠。
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有典型的雄激素缺乏動(dòng)物模型的問題，本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)D-半乳糖是一種良好的動(dòng)物亞急性衰老雄激素缺乏動(dòng)物模型的造模試劑。D-半乳糖可以有效地模擬代謝紊亂造成的衰老，而衰老伴隨著性腺功能減退，血清睪酮水平下降。本發(fā)明在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D-半乳糖，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能喪失和代謝紊亂，使機(jī)體內(nèi)氧自由基增加，抗氧化能力減弱，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生。性腺衰老是生物衰老的一個(gè)重要方面，在衰老過程中，伴隨下丘腦-垂體功能減退，睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig)合成雄激素的功能下降及其數(shù)目逐漸減少，導(dǎo)致中老年男子血清總睪酮(TT)平均每年下降約1%，游離睪酮(FT)下降 1.2%。所以，用一定劑量的D-半乳糖導(dǎo)致雄性動(dòng)物睪丸功能減退，雄激素水平下降，氧自由基增加，該模型用以模擬自然衰老導(dǎo)致的雄激素缺乏具有可行性。
本發(fā)明的動(dòng)物模型是采用D-半乳糖施用于非人哺乳動(dòng)物而制備的。一種施用的方法是非人哺乳動(dòng)物腹腔注射D-半乳糖。
更佳地，所述的非人哺乳動(dòng)物是大鼠，所述方法包括給大鼠腹腔注射 200-1000mg/kg.天(較佳地300-500mg/kg.天)的D-半乳糖，持續(xù)1-3個(gè)月(較佳地為2 個(gè)月)。
本發(fā)明的動(dòng)物模型，可用于研究和闡述動(dòng)物雄激素水平下降的發(fā)生機(jī)制，為篩選和開發(fā)緩解雄激素水平下降的藥物提供途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1、大鼠亞急性衰老雄激素缺乏動(dòng)物建模方法及模型評價(jià)
I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)3月齡雄性SD大鼠，300±20g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；
2)動(dòng)物隨機(jī)分組分為對照組、低劑量模型組和高劑量模型組3組，每組8只大鼠；
3)實(shí)驗(yàn)試劑D_半乳糖,購于Sigma公司，貨號(hào)G0625 ；
4) D-半乳糖溶液配制以生理鹽水為溶劑，低劑量模型組配制150mg/mlD-半乳糖生理鹽水溶液，高劑量模型組配制250mg/ml D-半乳糖生理鹽水溶液；
5)建模方法按O. 2ml/100g體積注射；對照組注射相應(yīng)體積生理鹽水，低劑量模型組注射D-半乳糖300mg/kg.天，高劑量模型組注射D-半乳糖500mg/kg.天；腹腔注射2個(gè)月進(jìn)行大鼠雄激素缺乏造模；
6)模型評價(jià)方法2個(gè)月后大鼠尾尖取血，分離血清，按試劑盒說明書操作，測定血清總睪酮水平、超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量，評價(jià)造模結(jié)果。
結(jié)果見圖1-圖3，可見，給予D-半乳糖的大鼠，血清中總睪酮水平顯著下降、超氧化物歧化酶活力顯著下降、丙二醛含量顯著上升，且這種變化都是劑量依賴性的。
綜合上述結(jié)果，本發(fā)明人建立了一個(gè)典型的血清游離雄激素水平下降的、衰老的大鼠模型。
實(shí)施例2、PLIN及其兩個(gè)亞型(PLIN-A和PLIN-B)在雄激素缺 乏模型組和對照組的差異表達(dá)
對于造模成功的大鼠，采用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法分離純化、3 β -HSD染色法鑒定睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig),經(jīng)原代培養(yǎng)72h后Trizol試劑法提取大鼠Leydig細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步采用基因芯片篩選相關(guān)脂類代謝差異表達(dá)基因，最后采用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。
進(jìn)行RT-PCR的引物如下
PLIN
正向(SEQIDNO1)CAGGACGGCAAAAGACGC ；
反向(SEQIDNO2)CCACACCACCCAGGAAGC ；
PLIN-A
正向(SEQIDNO3)CGCAAGAAGAGCTGAGTAGCC ；
反向(SEQIDNO4)TGCCTTAGAAATGATGTGGGTC ；
PLIN-B
正向(SEQIDNO5)TTACGGATAACGTGGTAGACACT
反向(SEQIDNO6):AGGCACAAGTCGGAGGGT。
結(jié)果如圖4，顯示PLIN及其兩個(gè)亞型(PLIN-A和PLIN-B)在雄激素缺乏模型組和對照組的差異表達(dá)，與對照組相比，表達(dá)水平明顯下調(diào)。因此可見，PLIN及其兩個(gè)亞型 (PLIN-A和PLIN-B)的表達(dá)下調(diào)指示雄激素的下調(diào)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范
權(quán)利要求
1.一種脂粒外周蛋白或其編碼基因的用途，用于制備檢測雄激素缺乏疾病的試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性擴(kuò)增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白的抗體。
4.一種用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑，其是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述的試劑是特異性擴(kuò)增脂粒外周蛋白的編碼基因的引物對；或是特異性識(shí)別脂粒外周蛋白的抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，所述的引物對的核苷酸序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO 2所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID N0:6所示。
7.—種檢測用于檢測雄激素缺乏疾病的試劑盒，其中包括容器，以及位于容器中的特異性識(shí)別脂粒外周蛋白或其編碼基因的試劑。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其中包括容器，以及位于容器中的引物對；所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO1和SEQIDNO:2所示;或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO4所示;或者所述的引物對的核苷酸序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO6所示()
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與雄激素產(chǎn)生下降相關(guān)的基因。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)脂粒外周蛋白(perilipin，或PLIN)基因是一種與雄激素產(chǎn)生下降相關(guān)的基因，可以該基因?yàn)闃?biāo)志物，來確定待測對象的雄激素產(chǎn)生情況。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103014143SQ20111029821
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者李潤生, 袁偉, 何華, 王健, 劉媛媛, 李玉華 申請人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所