一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法
【專利摘要】一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，涉及一種肝癌小鼠模型的建立方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法存在建立時間長、飼養(yǎng)成本高，并易出現(xiàn)飼養(yǎng)中死亡的問題。方法：一、選用4周齡的ICR雄性鼠，觀察飼養(yǎng)2周；二、飼養(yǎng)2周后，測定每只鼠的體重和每天飲水量；三、用體積濃度為75％的酒精棉對鼠腹部進(jìn)行消毒，腹腔注射DEN水溶液，12小時后開始讓鼠飲用含體積百分濃度0.15％DEN的水，飼喂4周；四、4周后，腹腔再次注射DEN水溶液，然后進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水，水中含DEN；五、從第一次注射DEN水溶液開始計(jì)算，飼養(yǎng)至第10周，即得到原發(fā)性肝癌小鼠模型。用于建立原位肝癌動物模型。
【專利說明】一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種肝癌小鼠模型的建立方法。

【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，近幾年來，肝癌的發(fā)病率呈上升狀態(tài)，已占我國惡性腫瘤的第2位。肝癌的發(fā)生發(fā)展過程是多因素作用的結(jié)果，目前肝癌的致病機(jī)理尚未研究清楚，沒有安全有效的治療手段，因此深入探討發(fā)病機(jī)理是治療肝癌的重要基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)動物癌癥模型是人類癌癥研究中建立的能夠模擬人類癌癥表現(xiàn)的模型。因此利用鼠模型研究肝癌的發(fā)病原因和致病機(jī)理，是對肝癌研究的重要手段。
[0003]原位肝癌動物模型的建立方法大致分為四類，即自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植性肝癌模型和轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型，模型動物最常選用的是鼠。自發(fā)性肝癌模型在發(fā)生學(xué)上與人相似，但發(fā)生率較低且不穩(wěn)定，發(fā)生時間較難預(yù)測；轉(zhuǎn)基因動物肝癌模型制作技術(shù)要求高，價格昂貴，操作復(fù)雜，因此開展較少。原位移植性肝癌模型操作繁瑣，成功率依賴于技術(shù)的成熟性，因此不易獲得。誘發(fā)性肝癌模型操作簡單、成本低、穩(wěn)定性強(qiáng)，并且簡單易得是生物醫(yī)藥研究中最常用的模型建立方法。
[0004]目前常用的方法有(I)DEN水溶液按10mg/kg體重用量0.25%的濃度灌胃每周一次，其余時間按0.025%的濃度飲水，約4個月可誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生，5?6個月80%以上可發(fā)生癌癥；亦可用濃度為0.05%的DEN飲水8個月誘發(fā)肝癌。(2) Solt-Farber誘癌模型的方法:第Id根據(jù)大鼠體重?fù)Q算按200mg/kg —次性腹腔注射DEN，2周后開始飼喂2-乙酰氨基荷(2-acetylaminof luorene, 2-AAF)飼料含有0.02%的DEN2周，在第3周末做2/3肝切除術(shù)，第4周末恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，在第4周顯微鏡下觀察可見肝內(nèi)出現(xiàn)變異肝細(xì)胞灶。(3)選用體重200g的雄性Wistar大鼠，根據(jù)體重?fù)Q算200mg/kgDEN腹腔注射，然后給予濃度為0.05%的DEN飲水，12周誘癌成功。(4)選用體重200g的雄性Wistar大鼠，通過應(yīng)用DEN自由飲水，16周誘癌成功。現(xiàn)有的方法雖能制備出鼠的原發(fā)性肝癌模型，但鼠的飼養(yǎng)時間長，飼養(yǎng)成本高，并且易出現(xiàn)飼養(yǎng)中死亡的現(xiàn)象，不適用于簡單快速制備模型的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法存在建立時間長、飼養(yǎng)成本高，并易出現(xiàn)飼養(yǎng)中死亡的問題，提供一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法。
[0006]本發(fā)明原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0007]一、選用4周齡的ICR雄性鼠，觀察飼養(yǎng)2周；
[0008]二、飼養(yǎng)2周后，測定每只鼠的體重和每天飲水量；
[0009]三、用體積濃度為75%的酒精棉對鼠腹部進(jìn)行消毒，腹腔注射DEN水溶液，12小時后開始讓鼠飲用含體積百分濃度0.15% DEN的水，飼喂4周；
[0010]四、4周后，腹腔再次注射DEN水溶液，然后進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水，水中含體積百分濃度0.15%的DEN ；
[0011]五、從第一次注射DEN水溶液開始計(jì)算，飼養(yǎng)至第10周，即得到原發(fā)性肝癌小鼠模型。
[0012]本發(fā)明的有益效果:用此方法建立的肝癌模型具有以下特點(diǎn):(I)肝癌的發(fā)生過程與人類原發(fā)性肝癌的發(fā)生相似；(2)生物學(xué)特性穩(wěn)定；(3)肝癌模型的建立周期短，發(fā)展快；(4)操作簡單、快捷，操作所致死亡率低，為0，動物模型穩(wěn)定性、重復(fù)性好、成功率高，可達(dá)到100% ; (5)模型動物飼養(yǎng)周期短，廉價易于飼養(yǎng)。因此本發(fā)明建立的模型是一種可以用于研究原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和抗肝癌藥物研究的動物模型。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為正常肝臟HE染色照片；圖2為注射DEN水溶液1_4周肝臟HE染色照片；圖3為注射DEN水溶液5-6周肝臟HE染色照片；圖4為注射DEN水溶液7-8周肝臟HE染色照片；圖5為注射DEN水溶液9-10周肝臟HE染色照片。

【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0015]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0016]—、選用4周齡的ICR雄性鼠,觀察飼養(yǎng)2周；
[0017]二、飼養(yǎng)2周后，測定每只鼠的體重和每天飲水量；
[0018]三、用體積濃度為75%的酒精棉對鼠腹部進(jìn)行消毒，腹腔注射DEN水溶液，12小時后開始讓鼠飲用含體積百分濃度0.15% DEN的水，飼喂4周；
[0019]四、4周后，腹腔再次注射DEN水溶液，然后進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水，水中含體積百分濃度0.15%的DEN ；
[0020]五、從第一次注射DEN水溶液開始計(jì)算，飼養(yǎng)至第10周，即得到原發(fā)性肝癌小鼠模型。
[0021]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟三中每只小鼠的DEN注射劑量為每kg體重的小鼠注射200mg的DEN。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0022]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟四中每只小鼠的DEN注射劑量為每kg體重的小鼠注射200mg的DEN。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0023]實(shí)驗(yàn)1:
[0024]本實(shí)驗(yàn)原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0025]一、選用60只4周齡的ICR雄性鼠，觀察飼養(yǎng)2周；其中分為實(shí)驗(yàn)組53只和對照組7只；
[0026]二、飼養(yǎng)2周后，測定每只鼠的體重，并取體重的平均值，為30±2g，每只鼠的每天飲水量約為5mL ；
[0027]三、將7 μ LDEN溶液加水稀釋到lmL，得到DEN水溶液；
[0028]DEN溶液由東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，商品名稱是二乙基亞硝胺。DEN溶液的純度為99% (體積百分比濃度)。
[0029]四、用體積百分濃度為75%的酒精棉對鼠腹部進(jìn)行消毒，實(shí)驗(yàn)組每只鼠腹腔注射ImLDEN水溶液，12小時后開始讓實(shí)驗(yàn)組的鼠飲用含體積百分濃度0.15% DEN的水，飼喂4周；對照組的鼠飲用純水；
[0030]五、4周后，實(shí)驗(yàn)組每只鼠腹腔再次注射ImLDEN水溶液，然后進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水，水中含體積百分濃度0.15%的DEN ;對照組的鼠飲用純水；
[0031]六、從第一次注射DEN水溶液開始計(jì)算，每周斷頸處死2只小鼠，取肝臟，直到第10周。
[0032]將肝臟在福爾馬林溶液中固定保存后制作病理切片，進(jìn)行HE染色觀察。
[0033]輕度變性壞死(1-4周):肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，可見少數(shù)肝細(xì)胞水變性、壞死，并伴有輕度的脂肪變性，肝竇擴(kuò)張，匯管區(qū)周圍有輕度炎細(xì)胞浸潤。肝臟HE染色照片如圖2所示。
[0034]重度變性壞死(5-6周):肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞水變性嚴(yán)重，并有不同程度的脂肪變性。肝竇擴(kuò)張充血加重。炎細(xì)胞浸潤范圍擴(kuò)大，由匯管區(qū)向周圍組織浸潤，并逐漸出現(xiàn)纖維組織增生。肝臟HE染色照片如圖3所示。
[0035]結(jié)節(jié)性增生-肝硬變(7-8周):肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)大小不等的假小葉結(jié)構(gòu)，結(jié)節(jié)內(nèi)肝細(xì)胞異型增生明顯，病理性核分裂較多，并伴有不同程度的膽管上皮增生。肝臟HE染色照片如圖4所示。
[0036]肝癌(9-10周):主要是肝細(xì)胞癌，同時伴有膽管細(xì)胞癌。表現(xiàn)為細(xì)胞異型，核圓形或卵圓形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，細(xì)胞排列為索狀、腺狀，向周圍組織浸潤。肝臟HE染色照片如圖5所示。
[0037]對照組:細(xì)胞間界限清晰，肝細(xì)胞大小基本一致，胞質(zhì)均勻，核仁清晰。正常肝臟HE染色照片如圖1所示。
[0038]本實(shí)驗(yàn)選擇60只4周齡的ICR雄性鼠，其中7只作為對照組，實(shí)驗(yàn)過程中非病理性死亡的小鼠為8只，病理性死亡的為5只，除去對照、病理性死亡和非病理性死亡的小鼠，成功建立40只原發(fā)性肝癌小鼠，此方法建立的模型小鼠肝癌發(fā)生率為100%。操作致死率為O。
[0039]其中所述非病理性死亡是指被同伴咬死；病理性死亡是指第一次注射DEN水溶液4周后由于個體體質(zhì)原因?qū)膊〔荒褪芏劳觥?br> 【權(quán)利要求】
1.一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行: 一、選用4周齡的ICR雄性鼠，觀察飼養(yǎng)2周； 二、飼養(yǎng)2周后，測定每只鼠的體重和每天飲水量； 三、用體積濃度為75%的酒精棉對鼠腹部進(jìn)行消毒，腹腔注射DEN水溶液，12小時后開始讓鼠飲用含體積百分濃度0.15% DEN的水，飼喂4周； 四、4周后，腹腔再次注射DEN水溶液，然后進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水，水中含體積百分濃度0.15%的DEN; 五、從第一次注射DEN水溶液開始計(jì)算，飼養(yǎng)至第10周，即得到原發(fā)性肝癌小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，其特征在于步驟三中每只小鼠的DEN注射劑量為每kg體重的小鼠注射200mg的DEN。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原發(fā)性肝癌小鼠模型的建立方法，其特征在于步驟四中每只小鼠的DEN注射劑量為每kg體重的小鼠注射200mg的DEN。
【文檔編號】A61K31/15GK104352484SQ201410553718
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】曹滌非, 黃鑫華, 吳瓊, 王雷, 王東凱, 孫堯, 薛佳瑩, 李瑤, 黃國慶, 趙金海, 侯婉瀅, 邢言 申請人:黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院