專利名稱：一種建立多形性腺瘤小鼠模型的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉基因技術領域。更具體地，涉及一種多形性腺瘤小鼠模型、建立該多形性腺瘤小鼠模型的方法，以及該多形性腺瘤小鼠模型的用途。
背景技術：
多形性腺瘤(pleomorphic adenoma)是口腔頜面外科最常見的唾液腺腫瘤，好發(fā)于腮腺及腭腺，界于良惡性腫瘤之間，是典型的臨界瘤(border-linetumor)，約占全部唾液腺腫瘤的53.9％。多形性腺瘤又名混合瘤(mixed tumor)，在組織病理學形態(tài)方面具有多樣性，可含有腫瘤上皮樣組織、軟骨樣組織及粘液樣組織等。
大量的細胞遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，多形性腺瘤中常出現(xiàn)異常核型。據(jù)統(tǒng)計，染色體核型正常的多形性腺瘤僅占總數(shù)的30％，其余70％均為異常核型，其中最常見的是8q12區(qū)發(fā)生重排。
1997年，Kas K等從t(3；8)(p21；q12)染色體異常的多形性腺瘤組織中克隆了一個新的約7.5Kb的轉錄物，命名為多形性腺瘤基因1(pleomorphicadenoma gene 1，PLAG1)。PLAG1位于人染色體8q12，cDNA(Gene Bank編號為U65002)全長為7313bp，包含5個外顯子，編碼框共1503bp，其表達產(chǎn)物為一鋅指蛋白，含七個C2H2鋅指結構。
多形性腺瘤中最常見的t(3；8)(p21；q12)染色體易位累及PLAG1和位于第3號染色體的β-連接素(β-catenin)基因。由于染色體易位導致兩個基因的調(diào)控序列相互交換(promoter swapping)，使PLAG1基因激活；而t(5；8)染色體易位的多形性腺瘤中PLAG1基因的高表達則是與位于第5號染色體的白血病抑制因子受體(LIFR)基因發(fā)生啟動子互換的結果。在一些核型正常的多形性腺瘤中，PLAG1和β-連接素、轉錄延長因子SII基因發(fā)生隱性重排，導致PLAG1表達升高。此外，在未檢測到染色體核型異常和隱性重排的多形性腺瘤中，也普遍存在PLAG1的異常表達。這提示PLAG1基因的表達激活與多形性腺瘤發(fā)生密切相關。PLAG1在脂肪母細胞瘤的高表達也佐證了PLAG1在腫瘤發(fā)生中的作用。
雖然研究暗示PLAG1是一種潛在的癌基因，然而PLAG1的生物學功能及其高表達與多形性腺瘤發(fā)病的關系尚缺乏直接證據(jù)，亦無整體動物水平的研究報道。此外，由于多形性腺瘤發(fā)生的分子機制的研究相對滯后，目前還沒有合適的多形性腺瘤動物模型，給多形性腺瘤的研究、治療、藥物篩選及防止術后復發(fā)等研究帶來諸多不便。
因此，本領域迫切需要開發(fā)多形性腺瘤動物模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種多形性腺瘤小鼠模型以及建立該多形性腺瘤小鼠模型的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供該多形性腺瘤小鼠模型的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種產(chǎn)生多形性腺瘤非人哺乳動物模型的方法，包括步驟(i)提供一線性化的轉基因構建物，該構建物從5’至3’依次含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子，并且在啟動子的上游以及密碼子下游還含有進行同源重組的同源區(qū)；(ii)用顯微注射技術將步驟(i)中的線性化的構建物基因引入非人哺乳動物受精卵；(iii)將步驟(ii)的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管；(iv)產(chǎn)生轉基因的非人哺乳動物，所述的非人哺乳動物的基因組中整合有FLAG1表達盒，所述表達盒含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(v)對步驟(iv)獲得的轉基因動物進行鑒定。
在另一優(yōu)選例中，所述的鑒定是通過PCR和Southern雜交法。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(vii)將獲得的轉基因哺乳動物與正常的哺乳動物雜交，以獲得子代。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動物是小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一優(yōu)選例中，所述的鑒定是對轉基因動物的組織用RT-PCR和Northern雜交進行表達譜分析。
在另一優(yōu)選例中，所述的PLAG1是人的PLAG1。
在本發(fā)明的第二方面，通過了用上述方法獲得的多形性腺瘤非人哺乳動物模型。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用本發(fā)明上述方法獲得的多形性腺瘤非人哺乳動物模型的用途，它被用于篩選治療多形性腺瘤的藥物。


圖1顯示了對MMTV-PLAG1轉基因陽性小鼠鑒定。
aPCR鑒定1轉基因陽性出現(xiàn)1.1K和610bp帶或只出現(xiàn)610bp帶，野生型或陰性小鼠可擴增出1.1K帶。
bPCR鑒定2轉基因陽性出現(xiàn)660bp帶，野生型或陰性小鼠無特異帶擴增。
c轉基因小鼠southern blot鑒定(基因組DNA用BamHI酶切)，陽性小鼠出現(xiàn)1.9K預期條帶。以質(zhì)粒DNA為陽性對照。
泳道M為分子量標記物，泳道9、41等為各轉基因小鼠的編號，Wt為野生型小鼠。
圖2顯示了對轉基因小鼠唾液腺PLAG1基因表達分析(Northern blot)。
圖3顯示了發(fā)生多形性腺瘤的轉基因小鼠。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，將人PLAG1基因克隆在MMTV表達載體中，經(jīng)顯微注射獲得了轉基因小鼠，從而首次建立了表型穩(wěn)定的多形性腺瘤動物模型。轉基因小鼠發(fā)生了自發(fā)唾液腺腫瘤，病理檢查表明腫瘤符合人多形性腺瘤的主要病理特征。在此基礎上完成了本發(fā)明。
可用于本發(fā)明的PLAG1沒有特別限制，可以是人、小鼠、大鼠、豬或其他哺乳動物的PLAG1?？梢允且吧蚉LAG1，也可以是突變型PLAG1。一種特別優(yōu)選的PLAG1序列是GenBank編號為U65002的序列，其全長為7313bp(SEQID NO1)，包含5個外顯子，編碼框共1503bp，其表達產(chǎn)物為一鋅指蛋白，含七個C2H2鋅指結構。
可用于本發(fā)明的啟動子沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于)MMTV LTR啟動子、CMV啟動子、唾液淀粉酶基因啟動子等。
在本發(fā)明的產(chǎn)生轉基因動物的方法中，首先構建一構建物，該構建物從5’至3’依次含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子。此外，在啟動子的上游以及密碼子下游還含有進行同源重組的同源區(qū)。
在獲得了構建物之后，可用常規(guī)方法將線性化的構建物轉入受精卵中。待小鼠出生后用PCR檢測、Southern印跡法等方法鑒定PLAG1是否發(fā)生整合入其基因組，從而獲得轉基因小鼠。
本發(fā)明多形性腺瘤非人哺乳動物模型的主要用途包括多形性腺瘤的預防研究，多形性腺瘤的手術和藥物治療研究，多形性腺瘤術后復發(fā)的預防研究，多形性腺瘤發(fā)病機制的研究等。一種特定的用途是篩選治療多形性腺瘤的藥物，即將候選藥物施用于本發(fā)明的模型動物，并觀察多形性腺瘤的大小變化，從而確定有效的治療藥物。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)是國際上第一個符合人多形性腺瘤病理特征及其分子機制的唾液腺瘤動物模型。
(b)轉基因可以孟德爾規(guī)律穩(wěn)定遺傳。有多個不同發(fā)病率、不同發(fā)病時間的轉基因小鼠系，可根據(jù)研究目的選用。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1MMTV-PLAG1質(zhì)粒的構建用以下引物，引物PLAG3815’-TTACGACCACATGAAACTTGAG-3’(SEQ ID NO2)，引物PLAG20035’-TGAATCCATGTCCCAGAATCCT-3’(SEQ ID NO3)，以人唾液腺瘤或胎盤標本中總RNA經(jīng)逆轉錄獲得的cDNA為模板，通過常規(guī)的RT-PCR法獲得人的PLAG1基因。然后直接克隆入pGEM-Teasy載體(Promega)，得到質(zhì)粒pGEMT-PLAG1。
MMTV-EGFR-stop(Xie W，Paterson AJ，Chin E，et al.Targetedexpression of a dominant negative epidermal growth factor receptor inthe mammary gland of transgenic mice inhibits pubertal mammary ductdevelopment.Mol Endocrinol.1997；11(12)1766-81)含有MMTV LTR啟動子。將MMTV-EGFR-stop用EcoRI酶切，切除其中EGFR基因，回收載體片段后用CIAP(牛胰堿性磷酸酶)去磷酸化；用EcoRI酶切pGEMT-PLAG1，回收PLAG1基因片段；用連接酶連接兩個片段，形成質(zhì)粒MMTV-PLAG1，其中，PLAG1基因位于MMTV LTR下游。
實施例2PLAG1經(jīng)顯微注射引入小鼠受精卵以及轉基因陽性鼠的產(chǎn)生轉基因質(zhì)粒MMTV-PLAG1用XhoI線性化后，回收含有MMTV LTR和PLAG1基因的片段(4.3kb)。將線性化的DNA(約500拷貝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植給假孕小鼠。約20天后，小鼠出生。
小鼠出生3周后，剪尾提取DNA，分析是否有轉基因整合用兩套PCR反應檢測后，引物如表1所示。以MTV-PLAG1質(zhì)粒含有的β-球蛋白基因為探針做Southern印跡法確認。
表1

圖1顯示了對MMTV-PLAG1轉基因陽性小鼠鑒定。aPCR鑒定1轉基因陽性出現(xiàn)1.1K和610bp帶或只出現(xiàn)610bp帶，野生型或陰性小鼠可擴增出1.1K帶。bPCR鑒定2轉基因陽性出現(xiàn)660bp帶，野生型或陰性小鼠無特異帶擴增。c轉基因小鼠southern blot鑒定(基因組DNA用BamHI酶切)，陽性小鼠出現(xiàn)1.9K預期條帶。以質(zhì)粒DNA為陽性對照。
結果，共獲得轉基因陽性小鼠9只，這些小鼠經(jīng)交配繁育建系，共建立了6個轉基因小鼠系。
實施例3轉基因在小鼠唾液腺中的表達為了檢測MMTV LTR/PLAG1融合基因在小鼠體內(nèi)是否表達，用Trizol試劑按常規(guī)方法提取小鼠唾液腺總RNA。取20mg RNA電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用PLAG1基因片段為探針進行Northern blot雜交。
結果發(fā)現(xiàn)在其中5個轉基因小鼠系中存在PLAG1轉基因高水平表達(圖2)。
實施例4轉基因小鼠自發(fā)多形性腺瘤6個轉基因小鼠系中有3個轉基因小鼠系自發(fā)性地出現(xiàn)唾液腺腫瘤，經(jīng)病理檢查，腫瘤組織內(nèi)含有腺上皮樣組織、假軟骨樣組織、粘液樣組織及肌上皮細胞等；各種組織常出現(xiàn)與人多形性腺瘤中類似的排列方式。腫瘤具有人多形性腺瘤的主要病理特征(圖3)。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司中科院上海生命科學研究院上海第二醫(yī)科大學健康科學中心上海第二醫(yī)科大學上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院<120>一種建立多形性腺瘤小鼠模型的方法<130>033705<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7313<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ggcagcgcat acactacaat ggctgctgga aagaggcgta aggaaacaat ttccaggccc 60gccgcgtcca gcccgaaata tgagaaaaaa attattagaa attccgcggg cggtgtagag 120gcggcggacg ggccggaggg aggatgttaa agccccgcgg ttgcctcttg gtgctgcctt 180ggccgtattt ggcacccaga atgcttcatt ctgtgacggt ctattaataa ggttgccttg 240ctagagtttg gagcagggcc tcagattggc caaaatggga aggattggat tccactctct 300tccacgaaga gtcaatggga ctggctaaga tcaaagtctg aggctttttc catcagtaat 360cagtcccttt ttgctttctt ttacgaccac atgaaacttg agaagccacc taaagctata 420tcatttagtg gagttgggca gttcccaagt gtccaacaag aaggcctggt ttaggctgcg 480atggccactg tcattcctgg tgatttgtca gaagtaagag atacccagaa agtcccttca 540gggaaacgta agcgtggtga aaccaaacca agaaaaaact ttccttgcca actgtgtgac 600aaggccttta acagtgttga gaaattaaag gttcactcct actctcacac aggagagagg 660ccctacaagt gcatacaaca agactgcacc aaggcctttg tttctaagta caaattacaa 720aggcacatgg ctactcattc tcctgagaaa acccacaagt gtaattattg tgagaaaatg 780tttcaccgga aagatcatct gaagaatcac ctccatacac acgaccctaa caaagagacg 840tttaagtgcg aagaatgtgg caagaactac aataccaagc ttggatttaa acgtcacttg 900
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<221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>引物<400>3tgaatccatg tcccagaatc ct 2權利要求
1.一種產(chǎn)生多形性腺瘤非人哺乳動物模型的方法，其特征在于，包括步驟(i)提供一線性化的轉基因構建物，該構建物從5’至3’依次含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子，并且在啟動子的上游以及密碼子下游還含有進行同源重組的同源區(qū)；(ii)用顯微注射技術將步驟(i)中的線性化的構建物基因引入非人哺乳動物受精卵；(iii)將步驟(ii)的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管；(iv)產(chǎn)生轉基因的非人哺乳動物，所述的非人哺乳動物的基因組中整合有FLAG1表達盒，所述表達盒含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(v)對步驟(iv)獲得的轉基因動物進行鑒定。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鑒定是通過PCR和Southern雜交法。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，還包括步驟(vii)將獲得的轉基因哺乳動物與正常的哺乳動物雜交，以獲得子代。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動物是小鼠、大鼠、兔、猴。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鑒定是對轉基因動物的組織用RT-PCR和Northern雜交進行表達譜分析。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PLAG1是人的PLAG1。
8.一種用權利要求1所述方法獲得的多形性腺瘤非人哺乳動物模型的用途，其特征可用于篩選治療多形性腺瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多形性腺瘤動物模型，在該動物的基因組中轉入了外源性的FLAG1表達盒，所述表達盒含有(a)啟動子，(b)與啟動子操作性相連的PLAG1編碼序列，(c)終止密碼子。轉基因小鼠發(fā)生了自發(fā)唾液腺腫瘤，病理檢查表明腫瘤符合人多形性腺瘤的主要病理特征。本發(fā)明還提供了建立該多形性腺瘤小鼠模型的方法，以及該多形性腺瘤小鼠模型的用途。
文檔編號C07H21/00GK1580266SQ03142220
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權日2003年8月13日
發(fā)明者王鑄鋼, 張成平, 趙旭東, 楊雯郡 申請人:上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司, 中國科學院上海生命科學研究院上海第二醫(yī)科大學健康科學中心, 上海第二醫(yī)科大學, 上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院