專利名稱：受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控UPA表達(dá)的載體及其建立四環(huán)素誘 導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
uPA(urokinase-plasminogen activator),艮口 尿激Bl型纖溶Bl原激 舌齊U，屬于 絲氨酸蛋白水解酶家族，uPA催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，啟動(dòng)纖維蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白溶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)。一般來說，uPA主要在生理、病理?xiàng)l件下參與細(xì)胞的分化、遷移、組織重 建、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過程。uPA纖溶途徑的主要成分包括uPA，uPA受 體(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)及其 I 型抑制齊[J (plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) (Nicholl SM, Roztocil E，Davies MG. Plasminogen activator system and vascular disease. Curr Vasc Pharmacol 2006 ;4 :101_116)0 石if 究發(fā)現(xiàn)，uPA纖溶途經(jīng)不僅與纖維化發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而且在固有性免疫和獲得性免疫系統(tǒng) 的形成中發(fā)揮作用(Mondino A, Blasi F. uPA and uPAR in fibrinolysis, immunity and pathology. Trends in Immunology, 2004, 25 (8) :450_455)。此外，uPA 在組織損傷及修復(fù) 過程中起重要作用，如uPA在肝臟修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是其在轉(zhuǎn)基因鼠中的過表達(dá)卻 導(dǎo)致新生鼠的嚴(yán)重肝損傷。Tet-On系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一，它利用大腸桿菌 TnlO轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素操縱子原理來實(shí)施調(diào)控外源基因在真核細(xì)胞中定量并特異地表達(dá)，具 有高效、無毒、開/關(guān)較嚴(yán)密等特點(diǎn)，已被成功地應(yīng)用于細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)表達(dá)外源基 因的研究。四環(huán)素操縱子(tet operon)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)利用細(xì)菌四環(huán)素操縱子的阻遏與去 阻遏作用，實(shí)現(xiàn)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)，由于該系統(tǒng)調(diào)控元件來自原核生物，對(duì)真 核細(xì)胞的基因表達(dá)不會(huì)有影響，具有高效和操作方便等優(yōu)點(diǎn)。Tet-On系統(tǒng)由兩部分組成 ①Tet反應(yīng)性元件(tetracycline responsive element, TRE)，由7拷貝的細(xì)菌四環(huán)素 耐藥操縱子的操縱基因序列(TetO)和人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子(PminCMV)組成；②融 合的轉(zhuǎn)錄活化因子 rtTA(reverse tet-controlled transcriptional activator)，是由 細(xì)菌的四環(huán)素阻遏物TetR和人類單純皰疹病毒(HSV)的毒粒蛋白VP16轉(zhuǎn)錄激活蛋白融 合而成的一個(gè)融合蛋白，能被強(qiáng)力霉素(Dox)所誘導(dǎo)和激活，并與TetO結(jié)合，通過VP16 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。此系統(tǒng)既有四環(huán)素阻遏物-操縱子相互作用的特異性，又具有VP16轉(zhuǎn) 錄活化因子的激活潛能，它們?cè)隗w外培養(yǎng)細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中能使目的基因的表達(dá)提高 約 IO5 倍(Urlinger S，Baron U，Thellmann M，et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators :novel mutations yield expanded range and sensitivity[J]. Pro Natl Acad Sci USA，2000，97 :7963_7968)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供本發(fā)明的目的是提供一種受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控UPA 表達(dá)的效應(yīng)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控UPA表達(dá)的效應(yīng)載體，其核苷酸序列 包括細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子和人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列、小鼠尿激酶原激活劑表 達(dá)框和小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框最后一個(gè)外顯子后的序列；所述小鼠尿激酶原激活劑 表達(dá)框的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為NM_008873. 3的5'端第 104-1405位核苷酸序列；所述小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框最后一個(gè)外顯子(第11外顯子) 后的711bp的序列的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為NM_008873. 3的 5'端第1363-2074位核苷酸序列，所述細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子序列為序列1的5'端第 7-300位核苷酸序列；所述人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列為序列1的5'端第301-438位 核苷酸序列。所述受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控UPA表達(dá)的效應(yīng)載體的出發(fā)質(zhì)粒為PTRE2質(zhì)粒。 所述受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的效應(yīng)載體的核苷酸序列為序列表中序列1。上述載體可以受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中的rtTA誘導(dǎo)表達(dá)，上述載體轉(zhuǎn)入動(dòng)物中 可以構(gòu)建得到受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 作為動(dòng)物模型材料與不同組織特異性表達(dá)rtTA的動(dòng)物模型雜交形成也方便了受四環(huán)素或 其衍生物誘導(dǎo)在不同組織表達(dá)uPA的動(dòng)物模型的構(gòu)建。上述載體與表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體可以組成用于構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍 生物誘導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的組合載體。上述載體跟組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入動(dòng)物中可以由四環(huán)素 或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)組織特異性表達(dá)uPA。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體為肝組織特異性表達(dá) rtTA的真核表達(dá)載體。所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體，其核苷酸序列包括依次串連的小 鼠血清白蛋白增強(qiáng)子序列、小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白 蛋白增強(qiáng)子的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為AC140220. 4的5'端第 104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列為自GENBANK號(hào) (Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列；所述 rtTA 基因的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為U89930. 1的5'端第774-1781 位核苷酸序列。所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體的出發(fā)質(zhì)粒為pTet-on質(zhì)粒。所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體的核苷酸序列為序列表中序列2。上述的載體及組合載體在構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基 因小鼠模型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述應(yīng)用中，所述構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模 型，包括下述步驟1)將權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載體導(dǎo)入小鼠篩選獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；2)將權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠篩選獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；3)將步驟1)和步驟2)獲得的小鼠雜交，篩選轉(zhuǎn)入獲得權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng) 所述的載體和所述表達(dá)rtTA的載體的轉(zhuǎn)基因小鼠，即獲得受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘 導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型；所述四環(huán)素衍生物可為強(qiáng)力霉素。本發(fā)明通過構(gòu)建受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)uPA的效應(yīng)載體，構(gòu)建了四環(huán)素 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)uPA的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，這種轉(zhuǎn)基因小鼠可以與組織特異性表達(dá) rtTA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交得到組織特異性表達(dá)uPA的轉(zhuǎn)基因小鼠，從而方便不同組織特異性 表達(dá)uPA的動(dòng)物模型的構(gòu)建，為構(gòu)建組織特異性可調(diào)控表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，用于特定 組織中uPA功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。


圖1 為 pTRE2_uPAcDNA 質(zhì)粒 BamH I /Sal I 雙酶切鑒定圖 2 為 pTRE2-uPAcDNA-700 質(zhì)粒 Hind III /Sma I I 雙酶切鑒定圖3為TRE2-uPA_711轉(zhuǎn)基因載體元件及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定引物設(shè)計(jì)模式4為uPA體外表達(dá)的mRNA水平鑒定圖5為uPA體外表達(dá)的mRNA水平及蛋白生物學(xué)活性鑒定圖6為tetO-uPA轉(zhuǎn)基因首建小鼠PCR鑒定圖7為肝組織特異性表達(dá)rtTA的AlbumiiKrtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠鑒定引物設(shè)計(jì)示意 8為肝組織特異性表達(dá)rtTA的Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠PCR鑒定結(jié)果圖9為234號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測(cè)圖10為232號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測(cè)圖11為222號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測(cè)圖12為223號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA和GAPDH mRNA RT-PCR 檢測(cè)圖13為234號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠不同組織rtTA和GAPDH 蛋白Western blot檢測(cè)圖14為222號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠不同組織rtTA和GAPDH 蛋白Western blot檢測(cè)圖15為232號(hào)和223號(hào)肝組織特異性表達(dá)rtTA的轉(zhuǎn)基因陰性鼠不同組織rtTA 和 GAPDH 蛋白 Western blot 檢測(cè)圖16為可誘導(dǎo)肝組織特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織表達(dá)uPA免疫組化檢測(cè)圖17為可誘導(dǎo)肝組織特異性表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)圖18為特異性誘導(dǎo)肝組織表達(dá)uPA后轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT水平檢測(cè)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如下所示Huh7細(xì)胞系購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清(FCS)購(gòu)自Gibco公司， H印es、雙抗，谷氨酰胺等均購(gòu)自Clontech公司。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化 試劑盒購(gòu)自Promega公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol 試齊Ll為 Invitrogen 產(chǎn)品。E. coli DH5 α competent cells 禾口 DNA standard Marker 購(gòu)自 北京博邁德發(fā)展有限公司；QIAprep Spin Miniprep Kit 和 Gel Extraction Mini Kit 購(gòu) 自 Qiagen &司；T4 DNA polymerase^ Pyrobest DNA Polymerase^ T4 DNA Ligase> Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1、DNA Marker 購(gòu)自 Takara 公司。蛋白酶抑制劑 Aprotinin、 Pepstatin A、Leup印tin、PMSF均購(gòu)自Amresco公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司和Takara 公司；引物由上海生工合成，兔抗鼠uPA單克隆抗體購(gòu)自American diagnostica Inc，蘇木 素、伊紅購(gòu)自Sigma公司。凝血酶(Thrombin, Τ)和纖維蛋白原(Fibrinogen, F)購(gòu)自國(guó)家 生物制品檢定所。ALT采用Fuji DRI-CHEM 7000生化分析儀檢測(cè)(FUJIFILM Corporation, Tokyo, Japan)。Te-on 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Cat. No. 631108)購(gòu)自 Clontech 公司；Anti-GAPDH polyclonal antibody (Cat. No. G9545)購(gòu)自 Sigma 公司；DAB 顯色液、HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG 購(gòu)自中杉金橋公司；野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。四環(huán)素誘導(dǎo) 性真核表達(dá)載體pTet-on和PTRE2 (名稱或者為pTRE2)質(zhì)粒購(gòu)自Clontech公司。轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物載體DNA顯微注射由上海模式生物有限公司完成。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因載體pTRE2-uPA_711載體構(gòu)建及鑒定一、轉(zhuǎn)基因載體pTRE2-uPA_711載體構(gòu)建按常規(guī)分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠腎組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增小 鼠 uPAcDNA 編碼區(qū)序列 1302bp。引物為 uPAcDNA-F、uPAcDNA-R。uPAcDNA-F :cgggatccatg aaagtctggctggcgagcctg(弓丨入 BamH I )；uPAcDNA-R :cggtcgaccatcagaaggccagacctttctcttc (弓丨入 Sal I )。反轉(zhuǎn)錄條件為PCR條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分20 秒，2-4步30個(gè)循環(huán)；720C 10分鐘，4°C 5分鐘。 克隆至PTRE2載體得到重組載體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確 的重組載體命名為TRE2-uPAcDNA。TRE2-uPAcDNA的BamH I /Sal I雙酶切鑒定如圖1所示。 泳道1為Marker2000 (Takara)，泳道2為BamH I /Sal I雙酶切結(jié)果，可見插入的uPAcDNA 序列。按常規(guī)分子克隆方法提取野生型C57BL/6J小鼠基因組DNA并以此為模板PCR擴(kuò) 增uPA最后一個(gè)外顯子編碼區(qū)后711bp序列，為自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為 NM_008873 第 1363-2074 位核苷酸序列。引物為 uPA3' -F2, uPA3' -R2。uPA3' -F2 cggtcgacgccctcaggtagctgagggaag(弓丨入 Sal I )uPA3' -R2 cggtcgacgtgaaaccgacatttagtgctagtc(弓 I入 Sal I )
PCR條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分10 秒，2-4步30個(gè)循環(huán)；720C 10分鐘，4°C 5分鐘。將PCR產(chǎn)物鑒定正確后，用Sal I酶切PCR產(chǎn)物并連入用Sal I酶切的 TRE2-uPAcDNA中uPAcDNA的3'端，Hind III /Sma I雙酶切判斷插入方向，正向連接的克隆 酶切后可產(chǎn)生158bp，1027bp,966bp, 3594bp的4條片段，凝膠電泳大約可見3條帶(圖2)， 泳道1為Markerlkb (Takara)，泳道2為Hind III /Sma I雙酶切結(jié)果。將正向連接的克隆命 名為pTRE2-uPA-711，選擇該質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備。pTRE2-uPA_711的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3 所示，如圖3所示，pTRE2-uPA-711中包含依次串聯(lián)細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子(序列表中序列 1的第7-300位)、人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列(序列表中序列1的第301-438位)、 uPA cDNA(序列表中序列1的第439-1774位)、uPA第11外顯子后的序列(序列表中序列 1 的第 1775-2485 位)。二、細(xì)胞水平鑒定轉(zhuǎn)基因載體uPA的表達(dá)及其生物學(xué)活性將pTRE2-uPA_711 與 Tet-on 共轉(zhuǎn)染 Huh7 細(xì)胞系，Dox 誘導(dǎo)(lug/ml)，誘導(dǎo) 后48小時(shí)分別收集細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，RT-PCR鑒定uPA的表達(dá)(誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)擴(kuò)增 出 316bp 的目的條帶)，擴(kuò)增引物為:RT-uPA-F :cttcgtctgtagaccaacaag，RT-uPA-R gtgcaagatgagctgctccac ；擴(kuò)增結(jié)果如圖4 :A和B。圖4中A為不同條件下細(xì)胞中uPA RT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果，泳道1為Marker2000 (Takara)，泳道2為以Tet-on共轉(zhuǎn)染但未誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組 細(xì)胞RNA為模板；泳道3為以Tet-on共轉(zhuǎn)染且誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞RNA為模板；泳道4為 以小鼠腎組織總RNA為模板PCR結(jié)果。圖4中B為與圖A對(duì)應(yīng)的內(nèi)參照GAPDH的RT-PCR 結(jié)果。內(nèi)參照 GAPDH 的擴(kuò)增引物為 GAPDH-F 5 ‘ -TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 ‘ ； GAPDH-R 5 ‘ -CCTCAGTGTAGCCCAAGATGC-3 ‘。該實(shí)驗(yàn)表明，pTRE2_uPA_711 與 Tet-on 共轉(zhuǎn)染 Huh7 細(xì) 胞系，在Dox誘導(dǎo)后能檢測(cè)到uPA RNA水平表達(dá)，即體外Dox誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了 uPA mRNA表達(dá)。溶圈法鑒定uPA的生物學(xué)活性。簡(jiǎn)述如下誘導(dǎo)后48小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。 IOml 瓊脂糖凝膠中加入凝血酶(Thrombin，Τ)和纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn))，混勻后 迅速倒板，凝固后打孔，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C濕盒中放置過夜。圖5為溶圈法鑒 定結(jié)果，其中1為uPA標(biāo)注品(0. 2IU)，2為正常細(xì)胞培養(yǎng)上清組，3為共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒但未誘導(dǎo) 組，4共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒加Dox誘導(dǎo)組。該實(shí)驗(yàn)表明，pTRE2-uPA-711與Tet-on共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞 系，在Dox誘導(dǎo)后能檢測(cè)到uPA蛋白表達(dá)，且具有生物學(xué)活性。實(shí)施例2、tetO-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定一、tetO-uPA轉(zhuǎn)基因首建鼠的制備及PCR鑒定將pTRE2-uPA_711質(zhì)粒用Pvu I酶切，瓊脂糖凝膠回收5739bp線性化片段，進(jìn)行 C57XCBA Fl小鼠受精卵(母本為CBA小鼠，父本為C57小鼠，均購(gòu)自北京華阜生物科技股 份有限公司)細(xì)胞原核DNA顯微注射，注射卵分別移植到假孕母鼠輸卵管中，轉(zhuǎn)基因小鼠出 生后第2周剪取約0. 5cm鼠尾，提取基因組DNA，在轉(zhuǎn)基因載體上下游各設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行 PCR鑒定，引物設(shè)計(jì)示意圖及序列如圖6所示，引物序列如下所述上游序列引物(陽(yáng)性小鼠應(yīng)擴(kuò)增得到465bp的片段)2-up-F :gtttagtgaaccgtcagatcgcctg ；2-up-R :ctaggct aatagcat caggtctgo下游序列引物(陽(yáng)性小鼠應(yīng)擴(kuò)增得到498bp的片段)
2-down-F ggtagcttgaggagtagagacact ；2-down-R :gacaatggttgtaacagagtag。PCR 反應(yīng)體系如下2· 5μ 1 10 XBuffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(2-up-F 和 2-up-R,或者 2-down-F 和 2-down-R)，1· 5 μ 1 上述提 取的基因組 DNA，17. 8μ 1 ddH20。PCR 反應(yīng)條件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S， 72°C 30S，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后720C 7min。PCR陽(yáng)性小鼠即為tetO_uPA轉(zhuǎn)基因首建小鼠。結(jié)果表明，顯微注射出生73只小鼠于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA，經(jīng)PCR篩選 發(fā)現(xiàn)5只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(3只$ 2只早)(部分PCR鑒定結(jié)果見圖6)，耳號(hào)標(biāo)記如下 yc-074 (早)，yc-075 (早)，yc-061 U )，yc-055 U )，yc-054 (古)。圖 6 中 A 為上游序列 引物鑒定結(jié)果，B為下游序列引物鑒定結(jié)果。圖6A和B中，泳道1為分子量MBI GenenRuler IOObp DNA Ladder marker，泳道2_6為不同首建鼠，泳道7為正常鼠，泳道8為空白對(duì)照，9 為陽(yáng)性對(duì)照。二、肝組織特異性表達(dá)rtTA蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及其鑒定1、肝組織特異性表達(dá)rtTA的載體pTet-on-albumin的構(gòu)建l)pTet-on質(zhì)粒的改構(gòu)為了將小鼠血清白蛋白基因啟動(dòng)子及增強(qiáng)子序列插入pTet-on啟動(dòng)子位置，以代 替pTet-on載體中的CMV啟動(dòng)子，合成link以引入合適的酶切位點(diǎn)，依次為SpeI、Ec0R V、 Spe I ,Kpn I、Apa I ,Not I、EcoR I ；具體方法如下所述合成 link弓丨物，序列為 tet-on-linker F 5' -ctaggatatcactagtggtaccgggcccg cggccgcg-3‘ ,tet-on-linker R 5‘ -aattcgcggccgcgggcccggtaccactagtgatatc-3‘,將 tet-on-linker F 和 tet-on-linker R 在 PCR 儀中 95°C退火 IOmin,獲得 PCR 產(chǎn)物。將上述獲得的PCR產(chǎn)物同樣用EcoR I和Spe I雙酶切，回收純化后，插入到 pTet-on的EcoR I和Spe I酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體，將獲得的重組載體用EcoR V / Sal I雙酶切、EcoR V /BamH I雙酶切鑒定，然后測(cè)序鑒定，結(jié)果表明linker已插入 pTet-on載體中；將鑒定表明正確的含有上述PCR獲得的link序列的重組載體命名為 pTet-on-link。2)肝組織特異性表達(dá)rtTA的載體pTet-on-albumin質(zhì)粒的構(gòu)建將克隆并鑒定正確的增強(qiáng)子序列及啟動(dòng)子序列插入改構(gòu)以后的pTet-on載體中， 構(gòu)建pTet-on-albumin載體，具體方法如下所述按照分子克隆的方法提取C57BL/6J小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限 公司)肝組織基因組DNA，以此為模板PCR擴(kuò)增小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子序列(自GENBANK 號(hào)(Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5 ‘端第 104540-106528 位核苷酸序列)，上 游引物 F 5' -gccgagctcctgccggctagcttccttagcatg-3 ‘(引入 Sac I 位點(diǎn))，下游弓|物 R 5 ‘ -gggttaaggatcccaagctggag-3 ‘(存在 BamH I 位點(diǎn))，PCR 擴(kuò)增獲得 1993bp 的片 段，經(jīng)測(cè)序表明該片段具有自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為AC140220. 4的5'端 第104540-106528位核苷酸序列，即為小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子序列；將PCR獲得的片段用 Sac I和BamH I雙酶切，克隆至pGEM_7ZF載體Sac I和BamH I酶切位點(diǎn)之間，得到重組載 體，將該重組載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的含有小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子序列的 載體命名為 p7ZF-Up-promoter。
以小鼠C57BL/6J小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)基因組DNA 為模板PCR擴(kuò)增小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子序列(自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為 AC140220. 4 的 5'端第 115631-115832 位核苷酸序列)，上游引物 F 5，_cgggatccacagctcc agatggcaaacatac-3，(弓丨入 BamH I 位點(diǎn)),下游弓丨物 R 5，_tttgccagaggctagtggggttg_3，， 擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH I酶切，經(jīng)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化獲得小鼠血清白蛋白啟動(dòng) 子。 將p7ZF-up-promoter用BamH I和Sma I雙酶切，切膠回收作為載體，將純化 后的小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子連接入載體中，獲得重組載體，將獲得的重組載體用BamH I 酶切鑒定并測(cè)序，將酶切鑒定和測(cè)序表明正確的重組載體命名為p7ZF-Up-albUmin。將 p7ZF-up-albumin 用 Sac I 酶切，T4 DNA Polymerase 消平，Kpn I 酶切，切膠回收 2233bp 的片段，將回收的片段連接入EcoR V和Kpn I雙酶切后的pTet-on-link載體中，獲得重組 載體，將重組載體用BamH I酶切可見5022bp、1284bp、2689bp的條帶出現(xiàn)，與預(yù)測(cè)結(jié)果相 符；對(duì)重組載體的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子接頭處進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期相符。將該載體進(jìn)行酶切和 測(cè)序鑒定，將鑒定表明正確的載體命名為pTet-on-albumin。pTet-on-albumin的序列中小 鼠血清白蛋白增強(qiáng)子、小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子和rt TA基因(自GENBANK號(hào)(Accession. Version)為U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列)依次串連，該pTet-on-albumin 的序列見序列表中序列2。其中小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子、小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子和rt TA基 因分別是序列2中第115-2103位、第2109-2310位、第2370-3377位核苷酸序列。2、肝組織特異性表達(dá)rtTA的載體pTet-on-albumin的白蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的 活體鑒定l)Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建鼠制備及PCR鑒定pTet-on-albumin質(zhì)粒用XhoI酶切，瓊脂糖凝膠回收6034bp片段，進(jìn)行C57 X CBA Fl小鼠受精卵(母本為CBA小鼠，父本為C57小鼠，均購(gòu)自北京華阜生物科技股份有限公 司)細(xì)胞原核DNA顯微注射，注射卵分別移植到假孕母鼠輸卵管中，轉(zhuǎn)基因小鼠出生后第2 周剪取約0. 5cm鼠尾，提取基因組DNA，在轉(zhuǎn)基因載體上下游各設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定， 引物設(shè)計(jì)示意圖及序列如圖7所示，引物序列如下所述上游序列引物Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ；1-up-R :GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。下游序列引物Ι-down-F GACGCGCTAGACGAFTTCGATCTG ；1-down-R :ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC。PCR 反應(yīng)體系如下2· 5μ 1 10 X Buffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq, 0· 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(1-up-F 和 1-up-R,或者 l-down-F 和 1-down-R)，1· 5 μ 1 上述提 取的基因組 DNA，17. 8 μ 1 ddH20。PCR 反應(yīng)條件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S, 72V 30S,進(jìn)行 34 個(gè)循環(huán)； 最后 72 0C 7min。PCR陽(yáng)性小鼠即為Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因首建小鼠。結(jié)果表明，顯微注射出生49只小鼠于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA，經(jīng)PCR篩選發(fā)現(xiàn)9只轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(部分PCR鑒定結(jié)果見圖8)，耳號(hào)標(biāo)記如下yc-063(早)， yc-051(早)，yc-071(早)，yc-073(早)，yc-065 (早)，yc-068( $ )，yc-064( $ )， yc-056( $ ),yc-059( $ )。圖8中A為上游序列引物鑒定結(jié)果，B為下游序列引物鑒定結(jié) 果。圖8中A和B中，泳道1-9為不同首建鼠，泳道10為分子量marker，泳道11為正常鼠， 泳道12為陽(yáng)性對(duì)照。2) Albumin :rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代鼠的獲得與鑒定取步驟1)獲得的9只首建鼠，培養(yǎng)至8周齡性成熟首建鼠，將其與8周齡的野生 型小鼠C57BL/6J交配，2周齡仔鼠進(jìn)行耳號(hào)標(biāo)記，其中4只首建鼠共產(chǎn)仔8窩，yc-063和 yc-065分別產(chǎn)3窩，yc-064和yc-056分別產(chǎn)1窩，3周齡時(shí)剪尾按分子克隆提取基因組 DNA, PCR檢測(cè)陽(yáng)性Fl代小鼠，PCR體系及反應(yīng)條件同步驟1)。3、轉(zhuǎn)基因小鼠Fl代rtTA轉(zhuǎn)錄水平鑒定取不同首建小鼠所生Fl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基 因陽(yáng)性小鼠234和222)及陰性小鼠(yc-063及yc-065所生F 1代轉(zhuǎn)基因陰性小鼠232 和223)，斷頸處死后剪取腦、胸腺、心、肺、腎、腸、脾、肝等不同組織少許(不超過30mg)，于 1.5ml EP 管中剪碎，總 RNA 提取使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Cat. No. 74106)，提取的總 RNA經(jīng)Nanodrop 1000分光光度儀測(cè)定濃度及純度，各種組織總RNA取400ng，使用Takara RNA LA PCR Kit (AMV) Verl. 1 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系為2 μ 1 MgCl2 (25謹(jǐn)ol/L)，1 μ 1 10XRNA PCR Buffer, 1 μ 1 dNTP Mixture, 0. 25 μ 1 RNase Inhibitor, 0. 5 μ 1 AMV Reverse Transcriptase,0.5 μ 1 Random 9mers,0.5 μ 1 Oligo dT-Adaptor Primer,400ng RNA, 用 RNase Free dH20 補(bǔ)足至 10 μ 1 體系，反應(yīng)條件為30°C 10min，42°C 30min，99°C 5min, 5°C 5min，在 RT 反應(yīng)結(jié)束后加入以下 PCR 體系3μ 1 MgCl2 (25讓ol/L)，4 μ 110XLA PCR Buffer 11,31. 75 μ 1 dH20,0. 25 μ 1 Takara LA Taq，0. 5 μ 1 引物(10 μ mol/L，分別用引 物對(duì)rtTA-F和rtTA-R，或者GAPDH-F和GAPDH-R進(jìn)行擴(kuò)增)反應(yīng)條件如下94°C 2min， (94°C 30S，56°C 30S，72°C 30S) X32，72°C IOmin, RT-PCR 產(chǎn)物用 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 總RNA提取過程中勻漿操作使用TlO basic ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)5檔勻漿40S即可(購(gòu) 自IKA公司)。引物序列如下rtTA-F :5:GACGCGCTAGACGATTTCGATCTG_3—rtTA-R :5、-ACCTTGCACAGATAGCGTGGTC-3、GAPDH-F :5~_ACC ACC ATG GAG AAG GCT GC-3、GAPDH-R : 5 :CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3、Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代陽(yáng)性小鼠rtTA mRNA表達(dá)鑒定結(jié)果如圖9-圖12所 示，結(jié)果表明234號(hào)陽(yáng)性小鼠rtTA mRNA在肝組織特異性表達(dá)，222號(hào)陽(yáng)性小鼠除在肝組織 表達(dá)外，在肺和腎也有少量表達(dá)，232號(hào)和223號(hào)陰性小鼠各種組織均不表達(dá)。圖9-圖12 中左圖均為轉(zhuǎn)基因鼠不同組織rtTA RT-PCR檢測(cè)，右圖均為轉(zhuǎn)基因鼠不同組織GAPDH mRNA RT-PCR檢測(cè)。圖9-圖12中左圖的PC表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTet-on質(zhì)粒48h后Huh7細(xì)胞提取總 RNA RT-PCR 結(jié)果。4、Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠Fl代rtTA蛋白表達(dá)鑒定Fl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠234和222)及 陰性小鼠(yc-063及yc-065所生Fl代轉(zhuǎn)基因陰性鼠232和223)不同組織總蛋白的提取，使用以下配方的組織蛋白裂解液10mM IM Tris-HCl, 1% (V/V)Triton X-100,1% (V/V) 去氧膽酸鈉，0.1% (V/V) 10% (g/ml)SDS,0. 4% (V/V)NP-40，150mM NaCl,5mM EDTA，0.2mM 原釩酸鈉，蒸餾水定容。提取前分別在組織蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑Aprotinin、 P印statin A、Leup印tin、PMSF，使其終濃度分另Ij為 2 μ g/ml，0. 7 μ g/ml，0. 5 μ g/ml，ImM。組織蛋白提取的具體方法為取不超過30mg各種組織，加入上述組織蛋白裂解液 及4種蛋白酶抑制劑，TlO basic ULTRA-TURRAX分散機(jī)5檔勻漿40S后，冰浴30min，每5min 振勻1次，13000rpm 4°C離心15min，上清即為總蛋白溶液。總蛋白定量使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司，P0006)，各取50 μ g 總蛋白溶液，加入5 X SDS上樣緩沖液及1/20體積β -巰基乙醇，煮沸l(wèi)Omin，IOOOOrpm離心 5min，上清用于rtTA蛋白的Western檢測(cè)，其余置于-80°C保存。rtTA蛋白檢測(cè)一抗使用 TetR monoclonal antibody (Clontech，Cat. No. 631108)，稀釋度 1 1000，GAPDH 蛋白一抗 使用 Anti-GAPDH polyclonal antibody (Sigma, Cat. No. G9545)，二抗分別使用 HRP 標(biāo)記山 羊抗小鼠IgG及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司，Lot. No. 80259)，稀釋度1 5000， 顯影液使用 SuperSignal WestDura Trial Kit (Thermo SCIENTIFIC, Code #37071，Lot #KE132546)。Albumin:rtTA轉(zhuǎn)基因Fl代陽(yáng)性鼠rtTA蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果如圖13-圖15所示， 結(jié)果表明，234號(hào)和222號(hào)陽(yáng)性鼠rtTA蛋白在肝組織特異性表達(dá)，而232號(hào)和223號(hào)陰性 鼠則在各組織均不表達(dá)。圖13-14中左圖分別為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠234和222不同組織rtTA Western blot檢測(cè)結(jié)果，右圖均為左圖中相應(yīng)組織GAPDH蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果。圖 15為轉(zhuǎn)基因陰性鼠232 (左圖)和223 (右圖)不同組織rtTA Western blot檢測(cè)結(jié)果，圖 13-15中PC均表示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pTet-on質(zhì)粒48h后Huh7細(xì)胞提取總蛋白Western blot結(jié)^ ο取已鑒定rtTA蛋白在肝組織特異性表達(dá)的同窩Fl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠雌雄自交，所 生F2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠用于保種繁育。用于與步驟一獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。三、可誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性表達(dá)UPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及鑒定取步驟1獲得的5只首建鼠，培養(yǎng)至8周齡性成熟首建鼠，將其與8周齡的野生型 小鼠C57BL/6J交配，2周齡仔鼠進(jìn)行耳號(hào)標(biāo)記，剪尾按分子克隆提取基因組DNA，PCR檢測(cè) uPA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性Fl代小鼠，PCR體系及反應(yīng)條件同步驟一。將8周齡uPA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性Fl代 小鼠與步驟二構(gòu)建的8周齡rtTA蛋白在肝組織特異性表達(dá)的Albumin-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠雜 交，所生2周齡仔鼠進(jìn)行耳號(hào)標(biāo)記，剪尾按分子克隆提取基因組DNA，PCR檢測(cè)雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性 小鼠，tetO-uPA PCR體系及反應(yīng)條件同步驟一，Albumin-rtTA PCR檢測(cè)引物如下所述Ι-up-F GTGCAGCTTGGCTTGAACTCGTTC ；1-up-R GAGTATGGTGCCTATCTAACATCTC。PCR 反應(yīng)體系如下2·5μ1 10 X Buffer (含 MgCl2)，2 μ 1 dNTP,0. 2μ 1 Taq，0. 5 μ 1 (10 μ mol/L)引物(l-up-F 和 1-up-R)，1. 5 μ 1 上述提取的基因組 DNA, 17. 8 μ IddH2O0PCR 反應(yīng)條件如下先 5°C 5min ；再 4°C 30S，54°C 30S，72°C 30S，進(jìn)行 34 個(gè)循環(huán)； 最后 72 0C 7min。tetO-uPA和Albumin-rtTA PCR均為陽(yáng)性的小鼠即雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠
11(albumin-rtTA :TetO_uPA)。該實(shí)驗(yàn)原理為AlbUmin-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠在肝組織特異性表達(dá)rtTA蛋白，該小鼠 與tetO-uPA轉(zhuǎn)基因鼠雜交所生子代鼠在肝組織也會(huì)特異性表達(dá)rtTA蛋白，加入Dox誘導(dǎo) 時(shí)，rtTA表現(xiàn)為活性形式，與tetO-uPA中操縱基因序列TetO結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，實(shí)現(xiàn)肝 組織uPA特異性表達(dá)。3、雙轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織uPA表達(dá)鑒定鑒定陽(yáng)性的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(albumin-rtTA TetO-uPA)飼喂含Dox(0. 5mg/ml)的飲 水誘導(dǎo)uPA的表達(dá)，誘導(dǎo)十周后收集血清進(jìn)行ALT水平鑒定；處死小鼠并取各組織臟器進(jìn) 行uPA特異性表達(dá)的檢測(cè)。以未添加Dox的飲水為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見uPA在肝組織特異 性表達(dá)(圖16)，利用兔抗小鼠uPA單克隆抗體免疫組化檢測(cè)肝組織壞死灶有uPA特異性 表達(dá)；組織病理學(xué)檢測(cè)誘導(dǎo)小鼠肝組織中肝細(xì)胞胞漿疏松，肝組織灶狀壞死，枯否細(xì)胞增多 (圖17)。檢測(cè)血清中ALT水平增高，進(jìn)一步暗示肝組織受到一定損傷(圖18)。圖18中A 代表雙轉(zhuǎn)基因陰性小鼠組，B代表單轉(zhuǎn)基因陰性小鼠組，C代表雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠組。
權(quán)利要求
一種載體，其核苷酸序列包括依次串連的細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子序列、人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列、小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框和小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框最后一個(gè)外顯子后的序列；所述小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)為NM_008873.3的5′端第104 1405位核苷酸序列；所述小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框最后一個(gè)外顯子后的序列的核苷酸序列為白GENBANK號(hào)為NM_008873.3的5′端第1363 2074位核苷酸序列，所述細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子序列為序列1的5′端第7 300位核苷酸序列；所述人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列為序列1的5′端第301 438位核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于構(gòu)建所述載體的出發(fā)質(zhì)粒為PTRE2質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體的核苷酸序列為序列表中序列1。
4.用于構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的組合載體， 由權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載體和組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合載體，其特征在于組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá) 載體為肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體；所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核表 達(dá)載體，其核苷酸序列包括依次串連的小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子序列、小鼠血清白蛋白啟動(dòng) 子序列和rtTA基因序列；所述小鼠血清白蛋白增強(qiáng)子的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)為 AC140220. 4的5'端第104540-106528位核苷酸序列；所述小鼠血清白蛋白啟動(dòng)子的核苷 酸序列為自GENBANK號(hào)為AC140220. 4的5'端第115631-115832位核苷酸序列；所述rtTA 基因的核苷酸序列為自GENBANK號(hào)為U89930. 1的5'端第774-1781位核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合載體，其特征在于所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核 表達(dá)載體的出發(fā)質(zhì)粒為pTet-on質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合載體，其特征在于所述肝組織特異性表達(dá)rtTA的真核 表達(dá)載體的核苷酸序列為序列表中序列2。
8.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載體在構(gòu)建受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)uPA的 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用，所述動(dòng)物優(yōu)選為小鼠。
9.權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載體或權(quán)利要求4-9中任意一項(xiàng)所述的一組載體在 構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中的應(yīng)用，所述動(dòng)物優(yōu)選 為小鼠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述構(gòu)建受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘 導(dǎo)uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括下述步驟1)將權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的載體導(dǎo)入小鼠篩選獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；2)將權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)rtTA的真核表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠篩選獲得轉(zhuǎn) 基因小鼠；3)將步驟1)和步驟2)獲得的小鼠雜交，篩選轉(zhuǎn)入獲得權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述 的載體和所述表達(dá)rtTA的載體的轉(zhuǎn)基因小鼠，即獲得受四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物誘導(dǎo)uPA 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型；所述四環(huán)素衍生物為強(qiáng)力霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的效應(yīng)載體，其核苷酸序列包括依次串連的細(xì)菌四環(huán)素耐藥操縱子和人類巨噬細(xì)胞的立早啟動(dòng)子序列、小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框和小鼠尿激酶原激活劑表達(dá)框最后一個(gè)外顯子后的序列。本發(fā)明通過上述載體創(chuàng)建受四環(huán)素或其衍生物誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控uPA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為進(jìn)一步構(gòu)建組織特異性可調(diào)控表達(dá)uPA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，用于特定組織中uPA功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101948860SQ20101025735
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者于虹, 周小軍, 周育森, 孫世惠, 肖文珺, 胡婧雅, 郭彥 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所