一種骨髓抑制小鼠模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨髓抑制是大多數(shù)化療、放療藥物共有的不良反應(yīng)，表現(xiàn)為外周血單系或全系血細(xì)胞減少等造血系統(tǒng)的改變。環(huán)磷酰胺導(dǎo)致骨髓抑制的研究已有不少報(bào)道，但是采用環(huán)磷酰胺復(fù)制骨髓抑制模型尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)磷酰胺的使用劑量及時(shí)間尚存在爭(zhēng)議，導(dǎo)致骨髓抑制動(dòng)物模型的成模率低、可重復(fù)性差，從而影響其發(fā)病機(jī)理及藥物防治骨髓抑制的療效研究。
[0003]如何建立一種明確的、可重復(fù)性的骨髓抑制動(dòng)物模型，對(duì)深入研究其發(fā)病機(jī)制及探討其有效防治方法，以及驗(yàn)證各種抗骨髓抑制藥物的療效和作用機(jī)理，都是一項(xiàng)至關(guān)重要的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了解決目前骨髓抑制動(dòng)物模型的成模率低、可重復(fù)性差的問(wèn)題，提供一種成模率高、可重復(fù)性好的骨髓抑制小鼠模型的建立方法。本發(fā)明公開(kāi)的建立骨髓抑制模型的方法，操作簡(jiǎn)單，成模率高，可重復(fù)性好，可以用于各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為骨髓抑制實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)，有利于客觀、準(zhǔn)確的驗(yàn)證各種藥物防治骨髓抑制的療效及作用機(jī)理，有利于進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療方案的選擇與評(píng)價(jià)，有利于指導(dǎo)治療骨髓抑制新藥的藥理實(shí)驗(yàn)與開(kāi)發(fā)研制。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0006]骨髓抑制小鼠模型的建立方法，選擇6周齡N0D/SCID雄性小鼠55只，隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組及模型I組、模型2組、模型3組、模型4組。除正常組外，其余各組再分為a組(連續(xù)給藥組)、b組(隔日給藥組)，共11小組，每組5只。模型組分別經(jīng)腹腔連續(xù)注射及隔日注射不同劑量環(huán)磷酰胺(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg)，對(duì)照組以生理鹽水代替，正常組不加任何干預(yù)措施，觀察15d，評(píng)價(jià)各組小鼠存活率、外周血細(xì)胞數(shù)、骨髓病理形態(tài)、骨髓造血干細(xì)胞陽(yáng)性率。
[0007]下面通過(guò)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明本發(fā)明一一骨髓抑制小鼠模型的建立方法。
[0008]I材料和方法
[0009]1.1材料
[0010]1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選用6周齡勵(lì)0/^10雄性小鼠55只，體重(23±4化，3??級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心室內(nèi)，室溫(27± I) °C，食用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為5大組(正常組、對(duì)照組、模型I組、模型2組、模型3組、模型4組)，除正常組外，每組再分為a組(連續(xù)給藥組)、b組(隔日給藥組)，共11小組，每組5只。
[0011]1.1.2藥物及試劑環(huán)磷酰胺注射液，購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。LineageCell Deplet1n Kit試劑盒，購(gòu)自德國(guó)美天旎Miltenyi公司。生物素化抗體(CD3e、B220、Grl、Terll9、Macl)，購(gòu)自BD Pharmingen公司。抗生物素微磁珠(Magnetic Beads)，購(gòu)自德國(guó)美天旎Miltenyi公司。Sca — 1、c 一Kit抗體，購(gòu)自eB1science公司。
[0012]1.1.3儀器設(shè)備LEICA—RM2135型切片機(jī)，LEICA—DME光學(xué)顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。RT-7300全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，中國(guó)深圳雷杜公司。BD Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。
[0013]1.2 方法
[0014]1.2.1給藥方法根據(jù)初始體重給藥，除正常組、對(duì)照組外，其余各組以環(huán)磷酰胺腹腔注射。
[0015]正常組:不加任何干預(yù)措施。
[0016]對(duì)照a組:生理鹽水腹腔注射，每日I次，連續(xù)3d。
[0017]對(duì)照b組:生理鹽水腹腔注射，隔日I次，連續(xù)3次。
[0018]模型Ia組:50mg/kg體重，每日I次，連續(xù)3d。
[0019]模型2a組:100mg/kg體重，每日I次，連續(xù)3d。
[0020]模型3a組:150mg/kg體重，每日I次，連續(xù)3d。
[0021 ] 模型4a組:200mg/kg體重，每日I次，連續(xù)3d。
[0022]模型Ib組:50mg/kg體重，隔日I次，連續(xù)3次。
[0023]模型2b組:100mg/kg體重，隔日I次，連續(xù)3次。
[0024]模型3b組:150mg/kg體重，隔日I次，連續(xù)3次。
[0025]模型4b組:200mg/kg體重，隔日I次，連續(xù)3次。
[0026]實(shí)驗(yàn)自給藥開(kāi)始起，連續(xù)觀察15天。
[0027]1.2.2觀察癥狀體征實(shí)驗(yàn)自開(kāi)始起，每周稱重I次，觀察小鼠的體形、毛色、步態(tài)、覓食及活動(dòng)情況，并記錄動(dòng)物每天死亡只數(shù)。
[0028]1.2.3外周血細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)自開(kāi)始起，每3日尾部取血I次，2mM EDTA/PBS稀釋50倍，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板數(shù)。
[0029]1.2.4觀察骨髓病理形態(tài)第15日用頸椎脫臼法處死小鼠，取右側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定24小時(shí)，10 %EDTA脫鈣液脫鈣28d，石蠟包埋，分別制成4張厚約4m連續(xù)石蠟切片，將石蠟切片置于37°C烤箱過(guò)夜后，經(jīng)二甲苯脫蠟后梯度乙醇復(fù)水，蘇木精染色5min，經(jīng)1%鹽酸乙醇分色，自來(lái)水充分沖洗藍(lán)化后，再用0.1 %伊紅復(fù)染5min，最后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，封片。普通光鏡下觀察骨髓組織切片病理形態(tài)的改變。
[0030]1.2.5骨髓造血干細(xì)胞陽(yáng)性率取左側(cè)股骨、雙側(cè)髖骨、雙側(cè)脛骨，置于5ml含2mMEDTA的PBS液中，用3ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，收集全部骨髓細(xì)胞，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分選BMNC細(xì)胞，MACS沖洗I遍，Lineage Cell Deplet1n免疫磁珠分選Lin—細(xì)胞(根據(jù)試劑盒操作)，加入SAV-FITC、Scal —PE、c 一Kit-APC熒光抗體，冰上孵育30min，MACS沖洗I遍，流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓造血干細(xì)胞(Lineage——Scal+—c-Ki t+，LSK細(xì)胞)陽(yáng)性率。
[0031 ] 2 結(jié)果
[0032]2.1癥狀表現(xiàn)
[0033]除正常組外，其它各組小鼠于造模后逐漸均出現(xiàn)體重、體溫下降，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，畏寒蜷臥，體毛疏松，失去光澤，進(jìn)食量、飲水量減少，尿量增多等表現(xiàn)，于造模后第9 一 12天左右，上述癥狀達(dá)到最高峰。造模后第15天開(kāi)始，上述癥狀逐漸減輕。
[0034]2.2存活率統(tǒng)計(jì)
[0035]與正常組相比，對(duì)照a組、對(duì)照b組、模型Ia組、模型Ib組、模型2a組、模型2b組及模型3b組未出現(xiàn)死亡，模型3a組出現(xiàn)少量死亡，模型4a組、模型4b組在觀察期間出現(xiàn)大量死亡或全部死亡(圖1)。
[0036]2.3外周血細(xì)胞數(shù)
[0037]我們將無(wú)小鼠死亡的組別一一正常組、生理鹽水a(chǎn)組、生理鹽水b組、模型Ia組、模型Ib組、模型2a組、模型2b組以及模型3b組外周血細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果如下:
[0038]2.3.1白細(xì)胞數(shù)
[0039]與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。模型2a組、模型2b組白細(xì)胞數(shù)自第3日起呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，第9日開(kāi)始逐漸上升，至15日時(shí)基本恢復(fù)正常。模型3b組在第6日時(shí)下降到最低點(diǎn)(P〈0.01),至15日時(shí)，仍保持在較低水平，與正常組比較，差異有非常顯著性意義(P〈0.01)(圖2)。
[0040]2.3.2紅細(xì)胞數(shù)
[0041 ] 與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時(shí)間點(diǎn)紅細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯差異。模型2a組、模型2b組、模型3b組紅細(xì)胞數(shù)自第3日起呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。其中，模型2a組在第9日時(shí)下降到最低點(diǎn)、模型2b組在第6日時(shí)下降到最低點(diǎn)，其后逐漸恢復(fù)。模型3b組在第12日時(shí)下降到最低點(diǎn)(P〈0.01)，至15日時(shí)仍保持在較低水平(P〈0.01)(圖
3)0
[0042]2.3.3血小板數(shù)
[0043]與正常組比較，生理鹽水Ia組、生理鹽水Ib組、模型Ia組、模型Ib組各時(shí)間點(diǎn)血小板計(jì)數(shù)未見(jiàn)明顯差異。模型2a組、模型2b組、模型3b組血小板數(shù)自第3日起呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，其中，模型2b組在第9日時(shí)下降到最低點(diǎn)，模型2a組、模型3b組在第12日時(shí)下降到最低點(diǎn)(Ρ〈0.01)(圖4)。
[0044]2.4普通光鏡觀察結(jié)果
[0045]普通光鏡觀察正常組、生理鹽水Ib組、模型3b組骨髓組織病理形態(tài)，結(jié)果如下:
[0046]正常組、生理鹽水Ib組:小鼠骨髓組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨核細(xì)胞，