促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨組織缺損是因外傷、感染、腫瘤等因素使機體喪失一些骨質(zhì)從而形成較大間隙，這一問題在臨床較為常見并且較難處理。如何促進骨組織缺損的修復(fù)，一直是該領(lǐng)域研究人員研究的重點。近年來，隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，這一問題得到了一定程度的解決。在骨組織工程中需要支架材料和種子細胞的相互結(jié)合才能發(fā)揮其應(yīng)有的作用，而種子細胞的選擇尤為重要，早期研究人員選用骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞，但是這些種子細胞取材困難，容易對患者造成二次傷害。因此，研究人員將種子細胞的目標(biāo)鎖定在了間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞有著低免疫原性的特性，并且具有多向分化的潛能，在一定的條件下可分化為成骨細胞、成脂肪細胞和成軟骨細胞等成熟的細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是間充質(zhì)干細胞的一種，具有多向分化的潛能，并且植入體內(nèi)后能進繼續(xù)產(chǎn)生成骨活動。在這一過程中決定骨再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RUNX和Osterix的基因表達均上調(diào)，以及骨再生早期的典型代表因子-骨橋蛋白基因(0ΡΝ)和堿性磷酸酶(ALP)亦會表達上調(diào)，但是要充分發(fā)揮骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨能力，首先在體外需要有成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)的情況下其才能向成骨細胞方向分化，并且細胞誘導(dǎo)這一過程需要至少14天的時間。因此，如何縮短成骨誘導(dǎo)時間或避免成骨誘導(dǎo)這一步驟，顯的尤為重要，本發(fā)明采用的一種新的培養(yǎng)體系，在骨髓間充質(zhì)干細胞正常培養(yǎng)時使用本發(fā)明的培養(yǎng)體系，骨髓間充質(zhì)干細胞在維持其原有干性的同時，決定成骨再生的相關(guān)因子的基因表達上調(diào)，為應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損提供了必要的種子細胞，也為骨組織工程治療骨缺損縮短了時間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生相關(guān)基因表達上調(diào)的培養(yǎng)體系，采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞不僅保持較高的干性，而且促進骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)成骨再生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表達。
[0004]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0005]—種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，步驟如下:
[000?]⑴骨髓間充質(zhì)干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內(nèi)，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)，以1 XlOVcm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0007]⑵骨髓間充質(zhì)干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質(zhì)干細胞長至80%時，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中。
[0008]而且，取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞進行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0009]而且，取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0ΡΝ和ALP的表達量。
[0010]一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達體系，a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]⑴本發(fā)明采用一種新的培養(yǎng)體系，從骨髓間充質(zhì)干細胞原代開始用該培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系相比較，本發(fā)明采用的培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)決定成骨再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(0SteriX、RUNX)的基因以及骨再生早期代表性因子的基因-骨橋蛋白(0ΡΝ)和堿性磷酸酶(ALP)明顯高表達。
[0013]⑵應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞不僅骨髓間充質(zhì)仍然保持較高的干性，而且其可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表達，這為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損提供了理想的種子細胞。
[0014]⑶采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了骨髓間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導(dǎo)的步驟，為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時間。
【附圖說明】
[0015]圖1為Osterix的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0016]圖2為RUNX的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0017]圖3為0ΡΝ的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
[0018]圖4為ALP的的mRNA表達水平(相對熒光強度)；
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖并通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0020]—種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，步驟如下:
[°021 ]⑴骨髓間充質(zhì)干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內(nèi)，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)，以1 X106/cm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ；
[0022]⑵骨髓間充質(zhì)干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質(zhì)干細胞長至80%時，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中；
[0023]⑶取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞進行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5% ;
[0024]⑷取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(Osterix、RUNX)基因和骨再生早期典型代表因子基因(0PN、ALP)的表達量。
【主權(quán)項】
1.一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，其特征在于:步驟如下: ⑴骨髓間充質(zhì)干細胞的分離:獲取無菌的骨髓，無菌條件下1500rpm離心5min;棄去上清液，使用無菌磷酸緩沖液反復(fù)沖洗，1500rpm離心5min，棄上清;磷酸緩沖液等倍稀釋混勾沉淀，緩慢添加到淋巴分離液上，2000rpm離心20min ；收集白膜層單核細胞于新的無菌的離心管內(nèi)，磷酸緩沖液清洗，1500rpm離心5min;棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)，以1 X 106/cm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1 ； ⑵骨髓間充質(zhì)干細胞的消化、傳代，待骨髓間充質(zhì)干細胞長至80 %時，采用0.05 %的胰蛋白酶+0.02%的EDTA對其進行消化，以1 X 104cells/cm2傳至新的培養(yǎng)瓶中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，其特征在于:取兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞進行流式鑒定，兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞陽性率均高于95%，陰性率均低于5%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，其特征在于:取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，提取RNA-反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA-進行Q-PCR，比較兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表達量。4.一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達體系，其特征在于: a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨再生關(guān)鍵基因高表達的方法，步驟如下：骨髓間充質(zhì)干細胞的分離：獲取無菌的骨髓，經(jīng)過前處理用培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)，以1×106/cm2接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別采用a-MEM+10％FBS和a-MEM+5％血小板裂解物+50mg/ml抗壞血酸+10nmol/L胰高血糖素樣肽-1。采用本發(fā)明的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞用于骨組織工程治療骨缺損，避免了骨髓間充質(zhì)干細胞體外成骨誘導(dǎo)的步驟，為臨床應(yīng)用骨組織工程治療骨缺損縮短了至少14天的時間。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105441389
【申請?zhí)枴緾N201510934333
【發(fā)明人】趙剛, 馬潔, 劉微微, 高偉瑋
【申請人】天津市康婷生物工程有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月15日