人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充 質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成 纖維細胞的一類細胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細胞及心肌細胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細胞還具有取材方便、無免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無致瘤性，具有其它干細胞不可比擬的優(yōu)勢， 因此，探討MSCs體外大量擴增具有深遠意義。
[0003]目前骨髓間充質(zhì)干細胞的體外擴增多采用二維培養(yǎng)方式進行的，也有部分采用三 維細胞培養(yǎng)支架進行培養(yǎng)，但均是采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架，由于單一的三維細胞培 養(yǎng)支架存在機械性能弱，不穩(wěn)固，且生物相容性差等問題，因此，在培養(yǎng)過程中，容易從三維 細胞培養(yǎng)支架的三維培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變成二維培養(yǎng)方式，使得骨髓間充質(zhì)干細胞黏附性差，細 胞活性差，且擴增不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維支架培養(yǎng)骨髓間 充質(zhì)干細胞存在生物相容性較低、細胞黏附性能弱等造成骨髓間充質(zhì)干細胞擴增率不高、 細胞活性差等缺陷，提供一種能夠采用兩種及以上的三維支架組合來模擬骨髓微環(huán)境進行 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，包括以下步驟：
[0006] 獲取骨髓間充質(zhì)干細胞，采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)；
[0007] 其中，所述三維細胞培養(yǎng)支架是由膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨三者 中的至少兩種組合制成的。
[0008] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細 胞，PBS緩沖液離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0009] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟還包括對原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)的過程，包括以下步 驟：將原代骨髓間充質(zhì)干細胞濃度調(diào)整至IX IO6~IX 10 8個/25ml，加入所述培養(yǎng)基進行 培養(yǎng)；當(dāng)細胞生長到融合時，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，見胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，加入 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，按1 :2~1 :3比例接種進行傳代培養(yǎng)至細胞生長到融 合，繼續(xù)傳代至獲得第三代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0010] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，采用三維 細胞培養(yǎng)支架進行體外培養(yǎng)的步驟為：取三維細胞培養(yǎng)支架復(fù)溶，取第三代骨髓間充質(zhì)干 細胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以I X IO8~I X 10 wL 1細胞濃度與復(fù)溶后三維細胞培養(yǎng) 支架共同接種于所述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0011] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，三維細胞 培養(yǎng)支架復(fù)溶過程中，還添加有助溶劑。
[0012] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述助溶 劑為乙酸或乙醇，且所述助溶劑的質(zhì)量分數(shù)為5% -15%。
[0013] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述培養(yǎng) 基為血清培養(yǎng)基，且所述血清培養(yǎng)基中添加有10 6~10 smol/L的氫化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。
[0014] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述膠原 支架的制備過程，包括以下步驟：
[0015] 取膠原溶于乙酸溶液中，獲得膠原溶脹液；所述膠原溶脹液經(jīng)真空脫泡處理后， 于-5°c~-198°c溫度下冷凍0. 5~2小時，然后再進行凍干即可。
[0016] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述納米 晶膠原基骨的制備過程，包括以下步驟：
[0017] 制備鈣磷比為I. 0~2. 5的溶液，加入I型膠原溶液中，離心去上清，冷凍干燥，再 加入聚乳酸即復(fù)合形成納米晶膠原基骨三維框架材料。
[0018] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述脫細 胞軟骨的制備過程，包括以下步驟：
[0019] 取關(guān)節(jié)軟骨浸泡于含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中，經(jīng)粉碎、梯度離心制成軟 骨微絲，經(jīng)脫細胞處理后，離心沖洗，加入DNA酶和RNA酶消化后，重復(fù)離心，收獲沉淀物即 脫細胞軟骨。
[0020] 實施本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，可以達到 以下有益效果：通過采用膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨中的兩種或兩種以上的 組合作為三維細胞培養(yǎng)支架，不僅能夠維持模擬骨髓微環(huán)境的三維多孔結(jié)構(gòu)，而且提高了 三維細胞培養(yǎng)支架的生物相容性，提高了骨髓間充質(zhì)干細胞的吸附能力及生長增殖能力 等，且本發(fā)明提供的三維細胞培養(yǎng)支架還能夠釋放出有利于骨髓間充質(zhì)干細胞生長的細胞 因子及營養(yǎng)物等，從而提高了骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖率及細胞活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)中， 采用單一三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞存在支架機械性能弱等缺陷造成細胞 增殖率低、易死亡等問題。
【具體實施方式】
[0021] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞存在細 胞活性差，增殖率低等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種采用兩種及以上的三維細胞培 養(yǎng)支架以人工模擬骨髓微環(huán)境進行培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，避免了單一的三維細胞 培養(yǎng)支架生物相容性差、細胞黏附性弱等問題，從而可真正實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的三維 培養(yǎng)，不僅能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的活性，而且還能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增 率。
[0022] 具體地，本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，包括 以下步驟：
[0023] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細胞；
[0024] S2、采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)；其中， 三維細胞培養(yǎng)支架是由膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨三者中的至少兩種組合制 成；膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨均具有良好的機械性能，在體外培養(yǎng)過程中降 解率較低或無降解變形，能夠保留培養(yǎng)前的結(jié)構(gòu)；但三者在單獨使用時，存在生物相容性較 低，細胞黏附率較低，生長增殖較緩慢，增值率較低的缺陷；本發(fā)明通過長期大量實驗證明， 將膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨任意組合制成三維細胞培養(yǎng)支架，能夠促進三 維細胞培養(yǎng)支架的生物相容性，促進細胞黏附，增加細胞生長面積，從而提高了細胞生長增 殖速率，提高了細胞增值率。
[0025] 進一步地，步驟Sl中還包括原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取，及原代骨髓間充質(zhì)干 細胞的傳代培養(yǎng)，具體為：
[0026] S11、原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲?。?br>[0027] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細胞，加入PBS緩沖 液，離心洗滌，棄上清液，即