亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法

文檔序號:9628039閱讀:773來源:國知局
人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充 質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymai stem cells,MSCs),是在骨髓中的一種類似成 纖維細胞的一類細胞,具有多方向分化潛能,可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細胞及心肌細胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細胞還具有取材方便、無免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無致瘤性,具有其它干細胞不可比擬的優(yōu)勢, 因此,探討MSCs體外大量擴增具有深遠意義。
[0003]目前骨髓間充質(zhì)干細胞的體外擴增多采用二維培養(yǎng)方式進行的,也有部分采用三 維細胞培養(yǎng)支架進行培養(yǎng),但均是采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架,由于單一的三維細胞培 養(yǎng)支架存在機械性能弱,不穩(wěn)固,且生物相容性差等問題,因此,在培養(yǎng)過程中,容易從三維 細胞培養(yǎng)支架的三維培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變成二維培養(yǎng)方式,使得骨髓間充質(zhì)干細胞黏附性差,細 胞活性差,且擴增不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是,針對現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維支架培養(yǎng)骨髓間 充質(zhì)干細胞存在生物相容性較低、細胞黏附性能弱等造成骨髓間充質(zhì)干細胞擴增率不高、 細胞活性差等缺陷,提供一種能夠采用兩種及以上的三維支架組合來模擬骨髓微環(huán)境進行 骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,包括以下步驟:
[0006] 獲取骨髓間充質(zhì)干細胞,采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng);
[0007] 其中,所述三維細胞培養(yǎng)支架是由膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨三者 中的至少兩種組合制成的。
[0008] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟包括:采集骨髓,肝素抗凝,在percoll分離液中離心,取中層單核細 胞,PBS緩沖液離心洗滌,棄上清液,即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0009] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟還包括對原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)的過程,包括以下步 驟:將原代骨髓間充質(zhì)干細胞濃度調(diào)整至IX IO6~IX 10 8個/25ml,加入所述培養(yǎng)基進行 培養(yǎng);當(dāng)細胞生長到融合時,PBS漂洗,加入胰蛋白酶,見胞質(zhì)回縮,細胞間隙增大后,加入 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,按1 :2~1 :3比例接種進行傳代培養(yǎng)至細胞生長到融 合,繼續(xù)傳代至獲得第三代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0010] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,采用三維 細胞培養(yǎng)支架進行體外培養(yǎng)的步驟為:取三維細胞培養(yǎng)支架復(fù)溶,取第三代骨髓間充質(zhì)干 細胞,PBS清洗,胰酶-EDTA消化,以I X IO8~I X 10 wL 1細胞濃度與復(fù)溶后三維細胞培養(yǎng) 支架共同接種于所述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0011] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,三維細胞 培養(yǎng)支架復(fù)溶過程中,還添加有助溶劑。
[0012] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,所述助溶 劑為乙酸或乙醇,且所述助溶劑的質(zhì)量分數(shù)為5% -15%。
[0013] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,所述培養(yǎng) 基為血清培養(yǎng)基,且所述血清培養(yǎng)基中添加有10 6~10 smol/L的氫化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。
[0014] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,所述膠原 支架的制備過程,包括以下步驟:
[0015] 取膠原溶于乙酸溶液中,獲得膠原溶脹液;所述膠原溶脹液經(jīng)真空脫泡處理后, 于-5°c~-198°c溫度下冷凍0. 5~2小時,然后再進行凍干即可。
[0016] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,所述納米 晶膠原基骨的制備過程,包括以下步驟:
[0017] 制備鈣磷比為I. 0~2. 5的溶液,加入I型膠原溶液中,離心去上清,冷凍干燥,再 加入聚乳酸即復(fù)合形成納米晶膠原基骨三維框架材料。
[0018] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中,所述脫細 胞軟骨的制備過程,包括以下步驟:
[0019] 取關(guān)節(jié)軟骨浸泡于含有蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中,經(jīng)粉碎、梯度離心制成軟 骨微絲,經(jīng)脫細胞處理后,離心沖洗,加入DNA酶和RNA酶消化后,重復(fù)離心,收獲沉淀物即 脫細胞軟骨。
[0020] 實施本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,可以達到 以下有益效果:通過采用膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨中的兩種或兩種以上的 組合作為三維細胞培養(yǎng)支架,不僅能夠維持模擬骨髓微環(huán)境的三維多孔結(jié)構(gòu),而且提高了 三維細胞培養(yǎng)支架的生物相容性,提高了骨髓間充質(zhì)干細胞的吸附能力及生長增殖能力 等,且本發(fā)明提供的三維細胞培養(yǎng)支架還能夠釋放出有利于骨髓間充質(zhì)干細胞生長的細胞 因子及營養(yǎng)物等,從而提高了骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖率及細胞活性,解決了現(xiàn)有技術(shù)中, 采用單一三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞存在支架機械性能弱等缺陷造成細胞 增殖率低、易死亡等問題。
【具體實施方式】
[0021] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞存在細 胞活性差,增殖率低等缺陷,本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種采用兩種及以上的三維細胞培 養(yǎng)支架以人工模擬骨髓微環(huán)境進行培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,避免了單一的三維細胞 培養(yǎng)支架生物相容性差、細胞黏附性弱等問題,從而可真正實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的三維 培養(yǎng),不僅能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的活性,而且還能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的擴增 率。
[0022] 具體地,本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法,包括 以下步驟:
[0023] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細胞;
[0024] S2、采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng);其中, 三維細胞培養(yǎng)支架是由膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨三者中的至少兩種組合制 成;膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨均具有良好的機械性能,在體外培養(yǎng)過程中降 解率較低或無降解變形,能夠保留培養(yǎng)前的結(jié)構(gòu);但三者在單獨使用時,存在生物相容性較 低,細胞黏附率較低,生長增殖較緩慢,增值率較低的缺陷;本發(fā)明通過長期大量實驗證明, 將膠原支架、納米晶膠原基骨和脫細胞軟骨任意組合制成三維細胞培養(yǎng)支架,能夠促進三 維細胞培養(yǎng)支架的生物相容性,促進細胞黏附,增加細胞生長面積,從而提高了細胞生長增 殖速率,提高了細胞增值率。
[0025] 進一步地,步驟Sl中還包括原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取,及原代骨髓間充質(zhì)干 細胞的傳代培養(yǎng),具體為:
[0026] S11、原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲?。?br>[0027] 采集骨髓,肝素抗凝,在percoll分離液中離心,取中層單核細胞,加入PBS緩沖 液,離心洗滌,棄上清液,即
當(dāng)前第1頁1 2 3 4 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1