專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)方法，尤其是一種提高人的干細(xì)胞(HSCs)在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
NOD/SCID (Non-obese diabetic severe combined immunodeficiency)即非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠，是SCID (重癥聯(lián)合免疫缺陷)鼠與NOD (非肥胖性糖尿病)鼠反交產(chǎn)生的免疫缺陷鼠。是目前最為普遍使用的免疫缺陷鼠模型，該鼠既擁有SCID鼠的特征，缺乏功能性的T、B淋巴細(xì)胞，細(xì)胞和體液雙重免疫缺陷，同時(shí)又擁有NOD鼠具備的多種固有免疫缺陷，包括NK細(xì)胞及補(bǔ)體活性低下，髓系細(xì)胞的發(fā)展和功能受限等特點(diǎn)，因此適宜人源細(xì)胞的移植。N0D/SCID小鼠模型在人類(lèi)血液病以及干細(xì)胞移植研究中發(fā)揮了重要的作用，通過(guò)將人的干細(xì)胞移植于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的N0D/SCID小鼠體內(nèi)，來(lái)檢測(cè)移植成功與否，為臨床和科學(xué)研究提供了重要依據(jù)。但是，N0D/SCID鼠也有許多缺點(diǎn)(1)仍有低水平的NK細(xì)胞活性，不同的主要組織相容性位點(diǎn)，完整的融細(xì)胞功能如NK細(xì)胞穿孔素分子的功能表達(dá)，不到10%的N0D/SCID鼠會(huì)發(fā)生免疫逃逸，產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，這些殘存的免疫反應(yīng)將不利于人細(xì)胞的植入；(2)N0D/SCID小鼠中人造血干細(xì)胞移植的微環(huán)境并不清楚，大部分為小鼠源性的，人干細(xì)胞由于缺乏對(duì)小鼠細(xì)胞因子的交叉反應(yīng)不能利用小鼠的造血細(xì)胞因子，同時(shí)缺乏與合適的黏附分之間的相互作用將繼續(xù)阻礙人造血干細(xì)胞的植入和生存。這些因素都使得該小鼠模型中人干細(xì)胞的植入率較低，使其應(yīng)用受到了很多的局限性。近年來(lái)，為了提高人干細(xì)胞的植入率，研究者們做出了很多努力，包括(1)給受體小鼠注射CD122抗體減少N0D/SCID小鼠體內(nèi)殘留的NK細(xì)胞活性；(2)將較大劑量的人骨髓細(xì)胞和細(xì)胞因子同時(shí)移植；(3)采用髓腔移植的方法進(jìn)行移植。但是這些方法除了對(duì)小鼠的創(chuàng)傷較大以外，所用的抗體和細(xì)胞因子的價(jià)格都比較昂貴，僅能局限于一些科研實(shí)驗(yàn)室的研究，不適宜臨床和科研實(shí)驗(yàn)的廣泛應(yīng)用。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，N0D/SCID小鼠與其它普通品系的小鼠相比，骨髓細(xì)胞中的活性氧(Reactive Oxygen Species,R0S)水平較高(如圖I所示)?；钚匝跏茄醯哪承┐x產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧物，是體內(nèi)重要的自由基，主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(0H ·)和過(guò)氧化氫(H2O2)等。在細(xì)胞內(nèi)的一系列生理活動(dòng)如調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、衰老及凋亡中發(fā)揮信號(hào)分子的作用。近年來(lái)，大量的研究結(jié)果表明，過(guò)多聚積的活性氧可通過(guò)多途徑誘發(fā)膜脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成生物膜和DNA的損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HSCs能夠維持在細(xì)胞周期的靜止期(G0期)，保持其非分裂狀態(tài)，與其所處的微環(huán)境(niche)有重要的聯(lián)系。最近的研究報(bào)道顯示，HSCs大都位于低氧的微環(huán)境中，這對(duì)于·HSCs各種功能(如自我更新、GO期的維持)至關(guān)重要。N0D/SCID小鼠骨髓微環(huán)境中過(guò)多聚積的ROS不利于人HSCs的植入，因此，本發(fā)明在移植前對(duì)受體小鼠進(jìn)行抗氧化處理，降低其體內(nèi)的ROS水平，給人的HSCs的植入提供更多和更適宜的微環(huán)境以提高HSCs的植入率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)移植的受體小鼠(N0D/SCID)骨髓微環(huán)境中氧代謝的特征，采用抗氧化的方法建立了一種提高人干細(xì)胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠模型的構(gòu)建方法，這種方法明顯的提高了人HSCs的植入率，成功率高，小鼠受創(chuàng)較小，費(fèi)用低廉，簡(jiǎn)單易實(shí)施，降低了 N0D/SCID廣泛應(yīng)用于移植實(shí)驗(yàn)的各種障礙，為提高人造血干細(xì)胞移植的臨床效果提供了新的思路。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟移植前采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對(duì)受體小鼠(N0D/SCID)進(jìn)行腹腔注射，同時(shí)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的飲水，將人的干細(xì)胞移植后，繼續(xù)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸的飲水，即得該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。優(yōu)選地，所述對(duì)受體小鼠進(jìn)行腹腔注射的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸的使用濃度·為 50-200mg/kg，更優(yōu)選為 100mg/kg。優(yōu)選地，所述抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸腹腔注射處理的時(shí)間點(diǎn)為移植前14天，方
式為每隔一天一次。優(yōu)選地，所述含N-乙酰半胱氨酸的飲水中N-乙酰半胱氨酸的濃度為O. 5-5mg/ml,更優(yōu)選為lmg/ml。優(yōu)選地，所述的干細(xì)胞移植為將人的干細(xì)胞通過(guò)受體小鼠的尾靜脈或脛骨的髓腔進(jìn)行移植。更具體地，該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟在移植人的干細(xì)胞前14天用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對(duì)受體小鼠(N0D/SCID)進(jìn)行腹腔注射，N-乙酰半胱氨酸使用濃度為100mg/kg，每隔一天一次，同時(shí)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸lmg/ml的飲水，以降低受體小鼠骨髓中的活性氧水平；對(duì)受體小鼠進(jìn)行137Cs源亞致死劑量照射，劑量2. OGy，劑量率為0. 7Gy/min，照射后24小時(shí)內(nèi)將人的干細(xì)胞通過(guò)受體小鼠的尾靜脈或脛骨的髓腔進(jìn)行移植，移植后繼續(xù)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸lmg/ml的飲水，即得該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述方法構(gòu)建的人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型，該模型應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了上述人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型在人干細(xì)胞移植研究中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對(duì)移植的受體小鼠(N0D/SCID)骨髓微環(huán)境中氧代謝的特征(R0S水平較高)，采用抗氧化的方法優(yōu)化人干細(xì)胞植入的微環(huán)境，方法新穎，有針對(duì)性；采用的腹腔注射抗氧化劑和在小鼠飲水中加入抗氧化劑的方法降低小鼠體內(nèi)的活性氧水平，改善了以往人們?yōu)樘岣呷薍SCs植入率使用的一些過(guò)程比較復(fù)雜的方式。本發(fā)明成功建立了 N0D/SCID小鼠移植的優(yōu)化模型，通過(guò)本發(fā)明的方法，使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸適度清除N0D/SCID小鼠體內(nèi)的ROS，無(wú)論是在尾靜脈還是髓腔移植時(shí)都有效的提高了人干細(xì)胞的植入率，移植過(guò)程中小鼠死亡率低，狀態(tài)佳，可以長(zhǎng)期存活。該方法簡(jiǎn)單，新穎，易實(shí)施，對(duì)小鼠的創(chuàng)傷小，且該方法使用的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸價(jià)格低廉，該方法把人的造血干細(xì)胞的研究引入了更深的層次，從而更快的促進(jìn)人的造血干細(xì)胞移植方面的研究，也為今后NOD/SCID小鼠移植模型廣泛的應(yīng)用于臨床和科學(xué)研究提供了新的思路。


圖I是實(shí)施例4中N0D/SCID小鼠經(jīng)NAC處理組與對(duì)照組N0D/SCID小鼠未經(jīng)NAC處理組、普通品系的小鼠B6. SJL和BALB/C，檢測(cè)到的小鼠骨髓細(xì)胞中的活性氧水平的對(duì)比圖。圖2是本發(fā)明采用尾靜脈移植的方法，對(duì)使用抗氧化劑處理后(NAC+)和不使用抗氧化劑處理(NAC-)的N0D/SCID小鼠檢測(cè)到的人干細(xì)胞在小鼠骨髓和脾臟中的植入率的流式圖。圖3是本發(fā)明采用髓腔移植的方法，對(duì)使用抗氧化劑處理后(NAC+)和不使用抗氧化劑處理(NAC-)的N0D/SCID小鼠檢測(cè)到的人干細(xì)胞在小鼠注射側(cè)脛骨骨髓(IT)，對(duì)側(cè)骨髓(BM)和脾臟(SP)中的植入率的流式圖。圖4是本發(fā)明采用極限稀釋的方法，在使用抗氧化劑處理N0D/SCID小鼠后檢測(cè)到的人干細(xì)胞在小鼠骨髓和脾臟中的植入率的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型的構(gòu)建方法(提高人干細(xì)胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的方法)，包括如下步驟I)取N0D/SCID小鼠8周齡，雌性，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌室內(nèi)，飼料、飲水及墊料均高壓滅菌，移植前14天用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔注射，每隔一天一次，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組小鼠的飲水中加入N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸的濃度為lmg/ml，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平，對(duì)受體小鼠進(jìn)行137Cs源亞致死劑量照射，劑量2. OGy，劑量率為O. 7Gy/min,小鼠照射后24小時(shí)內(nèi)將收集到的人⑶34+細(xì)胞通過(guò)小鼠的尾靜脈移植，移植細(xì)胞數(shù)量為5. 0-6.7X105個(gè)/只。移植后繼續(xù)給予實(shí)驗(yàn)組小鼠含N-乙酰半胱氨酸lmg/ml的飲水；即得人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型。移植后12至14周用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓和脾臟中人⑶45+、⑶45+⑶33+、⑶45+⑶19+細(xì)胞的百分比。對(duì)比例I實(shí)施例I的對(duì)照組N0D/SCID小鼠在移植前14天，腹腔注射磷酸鹽緩沖液，每隔一天一次，同時(shí)給予普通無(wú)菌水飲水，人干細(xì)胞移植后，仍給予普通無(wú)菌水飲水。其他條件同實(shí)施例I的條件。實(shí)施例I、對(duì)比例I尾靜脈移植后的檢測(cè)方法及結(jié)果如下移植后12至14周，將小鼠脫頸處死，分別收集小鼠骨髓和脾臟細(xì)胞I X IO6個(gè)，用染色緩沖液洗滌后重懸，加入人抗體CD45-PE-Cy7，CD33-Percp-Cy5. 5，CD19_PE，4°C避光孵育30分鐘，用2ml染色緩沖液洗滌I遍，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較兩組小鼠骨髓和脾臟中人⑶45+、⑶45+⑶33+、⑶45+⑶19+細(xì)胞的百分比。結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出，實(shí)施例I實(shí)驗(yàn)組(NAC+)小鼠骨髓和脾臟中人干細(xì)胞的植入率較對(duì)比例I對(duì)照組(NAC-)明顯提高骨髓(NAC-組11. 04±3· 11%, NAC+ 組23. 21 ±4. 0%, ρ=0· 0224 ；η=20);脾臟(NAC-組2. 63±0· 74%,NAC+:8. 56±1· 82%,ρ=0. 0055 ;η=20)，實(shí)驗(yàn)組小鼠骨髓和脾臟的植入率較對(duì)照組分別高2. I和3. 3倍，各組移植的人⑶34+細(xì)胞植入受體小鼠后均能夠多向分化為髓系細(xì)胞(⑶45+⑶33+)和淋巴系細(xì)胞(⑶45+⑶19+)，且大部分偏向B淋巴系分化。實(shí)施例2一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型的構(gòu)建方法(提高人干細(xì)胞在免疫缺陷鼠移植模型中植入率的方法)，包括如下步驟I)取N0D/SCID小鼠8周齡，雌性，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌室內(nèi)，飼料、飲水及墊料均·高壓滅菌，移植前14天用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔注射，每隔一天一次，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組小鼠的飲水中加入N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸的濃度為lmg/ml，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平，對(duì)受體小鼠進(jìn)行137Cs源亞致死劑量照射，劑量2. OGy,劑量率為O. 7Gy/min,小鼠照射后24小時(shí)內(nèi)采用腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)的方法麻醉小鼠，將流式分選的人Lin-CDSA+CDSS-aMSRA-CDgO+aMgf+Rho1 干細(xì)胞通過(guò)小鼠的脛骨進(jìn)行髓腔移植，移植細(xì)胞數(shù)量為100，50，20，10個(gè)/組。移植后繼續(xù)給予小鼠N-乙酰半胱氨酸飲水(lmg/ml)，即得人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(N0D/SCID)移植模型。移植后12至14周用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)小鼠骨髓和脾臟中人CD45+、CD45+CD33+、CD45+CD19+ 細(xì)胞的百分比。對(duì)比例2實(shí)施例2的對(duì)照組N0D/SCID小鼠在移植前14天，腹腔注射磷酸鹽緩沖液，每隔一天一次，同時(shí)給予普通無(wú)菌水飲水，人干細(xì)胞移植后，仍給予普通無(wú)菌水飲水。其他條件同實(shí)施例2的條件。實(shí)施例2、對(duì)比例2髓腔移植后的檢測(cè)方法及結(jié)果如下移植后12至14周，將小鼠脫頸處死，分別收集小鼠注射側(cè)脛骨骨髓(IT)，對(duì)側(cè)骨髓(BM)和脾臟(SP)細(xì)胞I X IO6個(gè)，用染色緩沖液洗滌后重懸，加入人抗體⑶45-PE-Cy7，CD33-Percp-Cy5. 5，CD19_PE，4°C避光孵育30分鐘，用2ml染色緩沖液洗滌I遍，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并比較兩組小鼠中人⑶45+、⑶45+⑶33+、⑶45+⑶19+細(xì)胞的百分比。結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出，采用髓腔移植的方法移植人的Lin-⑶34+⑶38-⑶45RA-⑶90+⑶49f+Rh01<)W干細(xì)胞，實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)組(NAC+)小鼠注射側(cè)脛骨骨髓(IT)，對(duì)側(cè)骨髓(BM)和脾臟(SP)中人干細(xì)胞的植入率較對(duì)比例2的對(duì)照組(NAC-)明顯提高IT(NAC-組2. 3±0· 89 %，NAC+ 組5· 85±1· 48 %，p=0. 0436 ；n=29) ；BM(NAC-組0· 78±0· 4 %，NAC+組2· 75±0· 8 %，ρ=0. 0352 ；n=29) ；SP(NAC-組0· 17±0· 11 %，NAC+ 組0· 96±0· 34 %，P=O. 0317 ;η=29)，實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)組小鼠IT，BM和SP中的植入率分別較對(duì)比例2對(duì)照組高2.5，3. 5 和 5. 7 倍，各組移植的人 Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+RholOT干細(xì)胞植入受體小鼠后均能夠多向分化為髓系細(xì)胞(⑶45+⑶33+)和B淋巴系細(xì)胞(⑶45+⑶19+)，且大部分偏向B淋系分化。實(shí)施例3 采用極限稀釋的方法，改變實(shí)施例2、對(duì)比例2中的移植細(xì)胞數(shù)量，其他條件不變，移植細(xì)胞數(shù)量為100，50，20，10個(gè)/組。如圖4所示，根據(jù)泊松分布的原理計(jì)算出在使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理后，N0D/SCID小鼠注射側(cè)脛骨骨髓(IT)，對(duì)側(cè)骨髓(BM)和脾臟(SP)中人SCID再植細(xì)胞(SCID-repopulating cell, SRC)出現(xiàn)的概率分別為1/36，1/50，1/57 ;對(duì)照組分別為1/108，1/203，1/448。說(shuō)明在使用抗氧化劑處理后的N0D/SCID小鼠對(duì)于檢測(cè)人SCID再植細(xì)胞的敏感度分別提高3. 0,4. I和7. 9倍。實(shí)施例4 N0D/SCID小鼠骨髓細(xì)胞活性氧水平檢測(cè)NOD/SCID、B6. SJL和BALB/C小鼠8周齡，雌性，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌室內(nèi)，飼料、飲水及墊料均高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)組(NOD/SCID NAC處理組)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(100mg/kg)對(duì)NOD/SCID小鼠進(jìn)行腹腔注射，每隔一天一次，同時(shí)在小鼠的飲水中加入N-乙酰半胱氨酸(lmg/ml)，以降低小鼠骨髓中的活性氧水平。對(duì)照組包括三組B6.SJL、BALB/C、NOD/SCID。對(duì)照組小鼠腹腔注射PBS緩沖液，每隔一天一次，小鼠給予普通無(wú)菌水作為飲水。兩周后將小鼠脫頸處死，沖出骨髓細(xì)胞，收集IXlO6細(xì)胞用PBS洗滌后，加入雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)液，終濃度5 μ M，37°C避光孵育20分鐘，PBS洗滌3次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DCFH-DA自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在的情況下被氧化成DCF，DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平成正比，因此各組小鼠骨髓細(xì)胞中DCF的平均熒光強(qiáng)度，即為活性氧水平，DCF激發(fā)波長(zhǎng)488nm，吸收波長(zhǎng)525nm。 如圖I所示，在同等實(shí)驗(yàn)條件下，與B6. SJL和BALB/C小鼠相比，N0D/SCID小鼠骨髓細(xì)胞中的 ROS 水平要高(B6. SJL 38. 49±2. 78，BALB/C 55. 42±3. 26，N0D/SCID 566. 5±32· 47，N=6 ；p < O. 0001)。NOD/SCID小鼠用NAC處理后，N0D/SCID小鼠骨髓細(xì)胞中ROS水平明顯降低(對(duì)照組566. 5±32. 47，NAC 處理組:108. 2±7. 85，n=6 ；p < O. 0001)。實(shí)施例5人⑶34+細(xì)胞富集方法健康妊娠新生兒臍血，取自天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院，無(wú)菌操作采集，方法如下(I).將新鮮臍血分裝于無(wú)菌的血漿瓶中，以臍血HES(羥乙基淀粉)= (5:1)的體積比加入HES，充分混勻，室溫靜置40分鐘以沉降紅細(xì)胞。(2).將去除紅細(xì)胞的臍血液體30ml緩慢加到15ml的Ficoll液上，不要破壞界面,盡量多加。離心，20°C,2000rpm，20分鐘,去剎閘。(3).吸棄一部分上清后小心收集單個(gè)核細(xì)胞層(白膜層)于含有IOml的緩沖液(PBS+0. 2mM-EDTA+0. 5% FBS)的離心管中，充分混勻，離心，20°C，1600rpm，10 分鐘。(4).棄上清,每管用40ml的緩沖液重懸,充分混勻后計(jì)數(shù)。離心,20°C, 1200rpm,10分鐘。(5).棄上清，每IO8細(xì)胞用300 μ I的緩沖液重懸。
(6).每IO8細(xì)胞加入100 μ I的Fc-R阻斷劑，避光。(7).每IO8細(xì)胞再加入100 μ I的CD34+Microbeads，充分混勻后4°C避光孵育30分鐘。(8).孵育結(jié)束后，每IO8細(xì)胞用40ml緩沖液洗一遍，1500rpm, 10分鐘。(9).棄上清，每IO8細(xì)胞用500 μ I緩沖液重懸。安裝LS柱，3ml緩沖液潤(rùn)柱，3遍。(10).逐滴加入細(xì)胞懸液，梯度磁場(chǎng)中通過(guò),用3ml緩沖液洗柱，3遍。(11).將柱子移除磁場(chǎng)，放在收集管上，加入5ml緩沖液，用活塞快速推出細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 106/ml，凍存。實(shí)施例6 人 Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rhol231(W 干細(xì)胞的富集健康妊娠新生兒臍血，取自天津中心婦產(chǎn)醫(yī)院，無(wú)菌操作采集，方法如下·(I).將新鮮臍血分裝于無(wú)菌的血漿瓶中，以臍血HES(羥乙基淀粉)= (5:1)的體積比加入HES，充分混勻，室溫靜置40分鐘以沉降紅細(xì)胞。(2).將去除紅細(xì)胞的臍血液體30ml緩慢加到15ml的Ficoll液上，不要破壞界面,盡量多加。離心，20°C,2000rpm，20分鐘,去剎閘。(3).吸棄一部分上清后小心收集單個(gè)核細(xì)胞層(白膜層)于含有IOml的緩沖液的離心管中，充分混勻，離心，20°C，1600rpm，10分鐘。(4).棄上清，每管用40ml的緩沖液重懸，充分混勻后計(jì)數(shù)。離心，20°C，1200rpm，10分鐘。(5).棄上清，每IO8細(xì)胞用400 μ I的緩沖液重懸。(6).每 IO8 細(xì)胞加入 100 μ I 的 Biotin-Antibody Cocktail,充分混勻后 4°C避光
孵育10分鐘。(7).孵育結(jié)束后，每IO8細(xì)胞用IOml的緩沖液洗一遍，離心，1500rpm, 10分鐘。(8).棄上清，每IO8細(xì)胞用800μ I緩沖液重懸。每IO8細(xì)胞加入200 μ I的Anti-Biotin Microbeads,充分混勻后4°C避光孵育15分鐘。(9).孵育結(jié)束后，每IO8細(xì)胞用IOml緩沖液洗一遍，1500rpm, 10分鐘。(10).每IO8細(xì)胞用500 μ I緩沖液重懸，安裝LS柱，3ml緩沖液潤(rùn)柱，3遍。逐滴加入細(xì)胞懸液，梯度磁場(chǎng)中通過(guò),3ml緩沖液洗柱，3遍，收集Lin-細(xì)胞計(jì)數(shù)。(11).將分離好的人Lin-細(xì)胞進(jìn)行抗體標(biāo)記，方法如下收集Lin-細(xì)胞用500 μ I的緩沖培養(yǎng)基(MEM+20% FBS)重懸，加入500 μ I羅丹明(Rho, O. 2 μ g/ml) 37°C，避光孵育30分鐘。加入15ml預(yù)冷的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心1500rpm，5分鐘。再加入15ml緩沖培養(yǎng)基，37°C，避光孵育15分鐘，離心1500rpm，5分鐘，用100 μ I的染色緩沖液(PBS+0. 2mM-EDTA+2% FBS)重懸，加入如下抗體
權(quán)利要求
1.一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟移植前采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對(duì)受體小鼠(NOD/SCID)進(jìn)行腹腔注射，同時(shí)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的飲水，將人的干細(xì)胞移植后，繼續(xù)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸的飲水，即得該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述對(duì)受體小鼠進(jìn)行腹腔注射的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸的使用濃度為50-200mg/kg。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述對(duì)受體小鼠進(jìn)行腹腔注射的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸的使用濃度為100mg/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸腹腔注射處理的時(shí)間點(diǎn)為移植前14天，方式為每隔一天一次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述含N-乙酰半胱氨酸的飲水中N-乙酰半胱氨酸的濃度為O. 5-5mg/mL·
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述含N-乙酰半胱氨酸的飲水中N-乙酰半胱氨酸的濃度為lmg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的干細(xì)胞移植為將人的干細(xì)胞通過(guò)受體小鼠的尾靜脈或脛骨的髓腔進(jìn)行移植。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟在移植人的干細(xì)胞前14天用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對(duì)受體小鼠(N0D/SCID)進(jìn)行腹腔注射，N-乙酰半胱氨酸使用濃度為100mg/kg，每隔一天一次，同時(shí)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸lmg/ml的飲水，以降低受體小鼠骨髓中的活性氧水平；對(duì)受體小鼠進(jìn)行137Cs源亞致死劑量照射，劑量2. OGy,劑量率為O. 7Gy/min,照射后24小時(shí)內(nèi)將人的干細(xì)胞通過(guò)受體小鼠的尾靜脈或脛骨的髓腔進(jìn)行移植，移植后繼續(xù)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸lmg/ml的飲水，即得該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。
9.用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法構(gòu)建的人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。
10.權(quán)利要求9所述人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型在人干細(xì)胞移植研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟移植前采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸對(duì)受體小鼠(NOD/SCID)進(jìn)行腹腔注射，同時(shí)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的飲水，將人的干細(xì)胞移植后，繼續(xù)給予受體小鼠含N-乙酰半胱氨酸的飲水，即得該人干細(xì)胞的免疫缺陷鼠移植模型。本發(fā)明成功建立了NOD/SCID小鼠移植的優(yōu)化模型，通過(guò)本發(fā)明的方法，無(wú)論是在尾靜脈還是髓腔移植時(shí)都有效的提高了人干細(xì)胞的植入率，移植過(guò)程中小鼠死亡率低，狀態(tài)佳，可以長(zhǎng)期存活。該方法簡(jiǎn)單，新穎，易實(shí)施，對(duì)小鼠的創(chuàng)傷小，且該方法使用的抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸價(jià)格低廉。
文檔編號(hào)A61D1/00GK102920522SQ20121036927
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者程濤, 胡林萍, 高瀛岱 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)