小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞株、及其產(chǎn)生的單克隆抗體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及犬?dāng)z熱病毒小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞株、其產(chǎn)生的單克隆抗體，含單克隆 抗體的檢測試劑盒和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬?dāng)z熱病毒(化nine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，病毒核 酸為單股RNA，病毒粒子呈圓形或不整形，有時(shí)呈長絲狀。CDV對熱和干燥敏感，在50-60°C溫 度下30分鐘即可滅活，在炎熱季節(jié)CDV在犬群中不能長期存活。在較冷的溫度下，CDV可存活 較長時(shí)間，在2-4°C可存活數(shù)周，在-60°C可存活超過7年。
[0003] 犬?dāng)z熱病是由犬?dāng)z熱病毒引起的，屬于犬科、綻熊科和關(guān)科動(dòng)物的一種急性、高度 接觸性傳染病，W雙相熱型發(fā)熱、結(jié)膜炎、上呼吸道與肺及胃腸道卡他性炎癥、皮炎、神經(jīng)炎 和足墊硬化為特征。染病犬的死亡率高達(dá)30%-80%，嚴(yán)重影響犬及其它易感染動(dòng)物的健 康，造成大批犬死亡，并可引起患病動(dòng)物的嚴(yán)重后遺癥，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 目前，國內(nèi)外犬?dāng)z熱病毒檢測方法包括電鏡觀察、親和素-生物素-復(fù)合物法 (ABC )、免疫巧光法(IFA )、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR )，檢測時(shí)需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的 技術(shù)人員，從而限制了其在大規(guī)模篩查方面的應(yīng)用，使得運(yùn)些方法偏向于實(shí)驗(yàn)室診斷，不適 合基層或現(xiàn)場快速檢測?；诖?，亟需發(fā)展一種快速、簡便、靈敏度高的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了犬?dāng)z熱病毒小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞株，其分 泌的抗犬?dāng)z熱病毒單克隆抗體，可W有效地診斷、預(yù)防和/或治療犬?dāng)z熱病毒所引發(fā)的感 染;含所述抗犬?dāng)z熱病毒單克隆抗體的檢測試劑盒，可快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測犬?dāng)z熱病毒 抗原。
[0006] 本發(fā)明設(shè)及一種小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)，保藏號為CCTCC N〇:C2015202,保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0007] 本發(fā)明設(shè)及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[000引本發(fā)明設(shè)及一種小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株巧ybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，s化ain 1G5)，保藏號為CCTCC N0:C2015201，保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0009]本發(fā)明設(shè)及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[0010] 本發(fā)明設(shè)及一種抗犬?dāng)z熱病毒藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含免疫量的 本發(fā)明的所述單克隆抗體或其可變區(qū)氨基酸序列制備的單鏈抗體，W及藥學(xué)上可接受的載 體。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及犬?dāng)z熱病毒檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括有效量的所述單克隆 抗體6E11和有效量的所述單克隆抗體1G5,還包括所述單克隆抗體和犬?dāng)z熱病毒的抗原抗 體反應(yīng)進(jìn)行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0012] 本發(fā)明還設(shè)及所述抗犬?dāng)z熱病毒藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療犬?dāng)z熱相關(guān)疾 病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還設(shè)及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬?dāng)z熱病毒檢測中的應(yīng)用，其中， 所述非診斷目的的犬?dāng)z熱病毒檢測包括流行病學(xué)分析、對離體組織進(jìn)行定性和定量檢測、 表位鑒定研究W及定性和定量鑒別檢驗(yàn)含犬?dāng)z熱病毒全病毒抗原和其他抗原的疫苗組合 物中的犬?dāng)z熱病毒全病毒抗原。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] (1)本發(fā)明通過使用特異性高的抗犬?dāng)z熱病毒單克隆抗體，制備的酶標(biāo)記的犬?dāng)z 熱病毒檢測試劑盒在硝酸纖維素膜上完成了化ISA檢測過程，實(shí)現(xiàn)了酶聯(lián)免疫級聯(lián)放大效 應(yīng)，因此其靈敏度可W達(dá)到化ISA水平，并且操作僅需30分鐘，較化ISA簡便、快速、省時(shí)；
[0016] (2)本發(fā)明使用金標(biāo)記的犬?dāng)z熱病毒檢測試劑盒敏感性高于市售進(jìn)口膠體金檢測 試紙條，提高了 CDV感染的檢出率。
【附圖說明】
[0017] 圖1為酶免疫層析檢測試紙條的側(cè)面示意圖，圖中：1-硝酸纖維素膜，2-酶標(biāo)墊，3-底物墊，4-吸水墊，5-展開液墊，6-檢測線，7-質(zhì)控線，8-底物緩沖液槽，9-底物緩沖液，10-支撐物，11-檢測樣品。
[0018] 圖2為小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞株6E11和1G5分泌單克隆抗體6E11和1G5的聚丙締酷胺 凝膠電泳鑒定圖，其中：泳道M為Marker;泳道1為單克隆抗體1G5,包括上端的重鏈和下端的 輕鏈;泳道2為單克隆抗體6E11，包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[0020] 本發(fā)明設(shè)及小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株化ybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,s1:rain 6E11)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為CCTCC No: C2015202,保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0021] 本發(fā)明的小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株由犬?dāng)z熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選制得。
[0022] 術(shù)語"犬?dāng)z熱病毒"（caninediStempervirus，CDV)在分類上屬于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(MorbilIivirus)，是一種單鏈RNA病毒，可感染犬科、綻熊 科和關(guān)科動(dòng)物，感染后W雙相熱型發(fā)熱、結(jié)膜炎、上呼吸道與肺及胃腸道卡他性炎癥、皮炎、 神經(jīng)炎和足墊硬化為特征。
[0023] 本發(fā)明設(shè)及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨 基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守 性變異體。
[0024] 術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個(gè) 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質(zhì)不 是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價(jià)的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、犬源化抗體W及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多膚?？贵w為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因 子，因而，運(yùn)個(gè)術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、犬源化抗體W及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多膚，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w 的實(shí)例是免疫球蛋白亞型（如IgG, I姐，IgM, I曲和IgA)及其亞型亞類;也可W是包含抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的片段如化13、3。。￥^￥、(1413少(1;和雙鏈抗體((11曰130(1163)。融合至另一多膚的、包 含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述?？贵w可W通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn) 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。運(yùn)種技術(shù)可W包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)， 參見EP.A. 184187 ,GB2188638A或EP.A. 239400。還可W對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì) 胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，運(yùn)不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā)明的"單克隆抗 體"也可用基因工程方法制得，因?yàn)榫幋a本發(fā)明鼠源化抗體的DNA序列可用本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增得到，因而也可 用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達(dá)載體中。最后，在適 合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用熟知的 常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體?？贵w包含通過二硫橋連接在一起的多膚 鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多膚主鏈構(gòu)成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類別（同型物）。重鏈 和輕鏈都進(jìn)一步可分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個(gè)的可變區(qū)和=個(gè)不 同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個(gè)可變區(qū)（不同于重鏈的可變區(qū)）和單個(gè)恒定區(qū)（不同于重鏈的 恒定區(qū)）。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。
[0025] 術(shù)語"重鏈可變區(qū)"是指一種多膚，其長度為110至125個(gè)氨基酸，其氨基酸順序相 應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術(shù)語"輕鏈可變 區(qū)"是指一種多膚，其長度為95至115個(gè)氨基酸，其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從 輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然知曉，在本發(fā)明所具體 公開的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列基礎(chǔ)上，可W通過常規(guī)基因工程 和蛋白質(zhì)工程方法進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、刪除、替換等修飾，獲得其活性片段或保 守性變異體，而仍能夠保持與犬?dāng)z熱病毒特異性結(jié)合。本發(fā)明中的單克隆抗體還包括其活 性片段或保守性變異體。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單克隆抗體為單克隆抗體6E11，由所述小鼠骨 髓雜交瘤細(xì)胞6E11株分泌產(chǎn)生。
[0027] 所述單克隆抗體6E11重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列； 所述單克隆抗體6E11輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
[0028] 本發(fā)明的單克隆抗體6E11的相對親和力常數(shù)為1:5120,也就是說，其與抗原的抗 原決定簇的結(jié)合強(qiáng)度非常高;所述單克隆抗體6E11IPMA(免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn))效 價(jià)為1:12800,與犬?dāng)z熱病毒具有良好的反應(yīng)性。
[00巧]本發(fā)明設(shè)及小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株(Hybridoma-Ba化/c mouse spleen cells and Sp2/0，strain 1G5)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號為CCTCC N〇:C2015201， 保藏地址為中國武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0030] 本發(fā)明的小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株由犬?dāng)z熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠 后，取其脾細(xì)胞，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選制得。
[0031] 本發(fā)明設(shè)及一種單克隆抗體，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突 變獲得的保守性變異體;所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No.8所示的氨 基酸序列或該序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)