專利名稱：樹鼩非酒精單純性脂肪肝動物模型的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物模型的建立方法，具體涉及利用動物構建非酒精性脂肪肝動物模型的方法。
背景技術：
脂肪肝的發(fā)病率近幾年在歐美和中國迅速上升，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。在白領人士、政府官員、高級知識分子等職業(yè)人群中脂肪肝的平均發(fā)病率約為25% ；在肥胖人群與II型糖尿病患者中脂肪肝的發(fā)病率約為50% ;在嗜酒和酗酒者脂肪肝的發(fā)病 率約為58% ;在經(jīng)常失眠、疲勞、不思茶飯、胃腸功能失調(diào)的亞健康人群中脂肪肝的發(fā)病率約為60%。非酒精性脂肪肝病是指除酒精外和其他明確的肝臟損傷因素所致的以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合癥。依據(jù)病變肝組織是否伴有炎癥反應和纖維化，非酒精性脂肪肝病可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化。理想的非酒精性脂肪肝動物模型應該具有(I)模擬人類非酒精性脂肪肝的演變過程，具有人類脂肪肝病變特征。(2)形成率高，可控性強，重復性好，死亡率低。(3)方法簡便易行，價格低廉。在誘導不同類型的非酒精性脂肪肝動物模型的建立中，肝炎和肝硬化兩種動物模型較為常見，而單純性脂肪肝還少見報道。另一方面，由于人體肝臟功能的復雜性與實驗動物種族差異性、動物年齡的選擇、飼料的控制、造模時間以及模型判定指標尚缺乏統(tǒng)一標準等因素的影響，使任何一種實驗動物模型都不能全面、準確地反映人類脂肪肝的本質(zhì)，尤其是單純性脂肪肝的本質(zhì)。因此，利用與人類遺傳關系更接近的實驗動物建立單純性脂肪肝模型就顯得尤為重要，更能反映和研究人類單純性脂肪肝本質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用親緣關系更接近于人類的動物——樹駒，建立造模時間短、造模成功率及造模效率高的非酒精單純性脂肪肝動物模型的方法。本發(fā)明通過以下方式實現(xiàn)其目的
隨機選取成年雄性和雌性樹駒作為模型動物，雄性成年體重120 140克，雌性成年體重110 130克，用高脂飼料供樹駒自由采食，高脂飼料成分為每公斤普通飼料加20g膽固醇和200g豬油，并提供純凈水自由飲用，持續(xù)飼養(yǎng)14周，該期間為造模期。所述方法是在造模期內(nèi)樹駒普通飼料的營養(yǎng)成分為19%〈粗蛋白質(zhì)〈21%、4%〈粗脂肪〈5%。所述方法進一步是隨機選取成年雄性和雌性樹駒各10只作為模型動物的對照動物，雄性體重120 140克，雌性體重110 130克，自由采食普通飼料。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果I、提供了一種利用親緣關系較接近于人類的樹駒，建立非酒精單純性脂肪肝動物模型的方法。相對于大、小鼠，兔子等嚙齒類動物而言，樹駒的親緣關系更接近于人類。因此，本發(fā)明用樹駒誘導的脂肪肝動物模型更能反映人類脂肪肝的本質(zhì)。2、本發(fā)明單純性脂肪肝動物模型的建立方法安全可靠，所需的造模時間短，造模成功率和造模效率高，具有良好的應用前景。3、通過建立單純性脂肪肝動物模型，可以用來研究脂肪肝的發(fā)生機制，篩選保肝藥物，探索保肝作用原理，甚至評價相關藥物對該種疾病的藥效評估，具有十分重要的意義。


圖I和圖2是DIASUS超聲儀10-22 MHz凸陣探頭掃描正常樹駒肝組織超聲圖，肝組織回聲均勻，肝臟內(nèi)管道結構分布清晰。圖3為中度脂肪肝超聲圖，回聲不均勻。圖4和圖5為重度脂肪肝超聲圖，回聲不均勻，肝臟內(nèi)管道結構分布不清晰，肝臟腫大，肝前緣變鈍。圖6和圖7分別為HE染色正常肝切片(200X )、(100X )圖。圖8為HE染色輕度脂肪樣(200 X )病變圖。圖9為HE染色中度脂肪樣(200X )病變圖。圖10為HE染色重度脂肪樣(200 X )病變圖，肝細胞約有75%脂肪變。圖11 (100X)、圖12 (200X)和圖13 (400X )為HE染色重度脂肪樣病變圖，肝細胞約有95%脂肪變。以下結合附圖對本發(fā)明做進一步說明，本發(fā)明包括但不限于實施例列舉的內(nèi)容，如簡單地擴大建立的動物數(shù)量也應當視為本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式(一)本發(fā)明模型的建立 實施例I :
隨機選取成年雄性和雌性樹駒各20只作為模型動物，雄性成年體重120 140克，雌性成年體重110 130克，用高脂飼料由樹駒自由采食，高脂飼料的成分為每公斤普通飼料加20g膽固醇和200g豬油。在造模期內(nèi)，所有動物皆自由飲水。造模期共為14周。7周后，60%的樹駒呈明顯單純性脂肪肝癥狀，14周后，80%的樹駒呈明顯的單純性脂肪肝癥狀，其中20%的樹駒呈重癥單純性脂肪肝癥狀，部分樹駒約有95%的肝細胞脂肪化。在整個實驗過程中，無動物死亡。實施例2
隨機選取成年雄性和雌性樹駒各30只作為實驗動物，雄性成年體重120 140克，雌性成年體重110 130克，其中，用成年雄性和雌性樹駒各10只作為對照動物，自由采食普通飼料，普通飼料營養(yǎng)成分為19%〈粗蛋白質(zhì)〈21%、4%〈粗脂肪〈5%。其余20只雄性和20只雌性動物作為模型動物，用高脂飼料由樹駒自由采食，其成分為每公斤普通飼料加20g膽固醇和200g豬油。在造模期內(nèi)，所有動物皆自由飲水。在整個實驗過程中，無動物死亡。(二)樹駒脂肪肝診斷模式評價方法及結果 該方法包括血清生化標志物、影像學、病理組織學診斷。I、血清生化標志物主要包括血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、血清總蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IDBIL)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)和白球比(A/G)。造模過程中，每周采血一次，實驗樹駒禁食10小時，然后在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉條件下，尾靜脈采血0. 8毫升，3000rpm離心10分鐘，分離血清，測試血清ALT、TP、GLU、TBIL、DBIL、IDBIL、ALB、GLO濃度和A/G值，分析結果顯示
ALT和TBIL指標在脂肪肝病變模型樹駒與正常對照組樹駒差異極顯著(P〈0. OD5DBIL和IDBIL指標在脂肪肝病變模型樹駒與正常對照組樹駒差異顯著(P〈0. 05);而TP、GLU、ALB、GLO與A/G指標在模型組與對照組之間差異均不顯著(P>0. 05)。2、B 超檢查。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉條件下，采用DIASUS超聲儀10_22 MHz凸陣探頭對肝臟部位掃描，保存圖片進行分析。結果顯示
正常肝組織超聲圖(見圖I和圖2)。肝實質(zhì)光點微細、分布均勻；肝內(nèi)管道系統(tǒng)走行正常，紋理清楚，透聲良好。中度脂肪肝超聲圖(見圖3)?；芈暡痪鶆颍闻K內(nèi)管道結構不清晰。 重度脂肪肝超聲圖(見圖4和圖5 )?；芈暡痪鶆?，肝臟內(nèi)管道結構分布不清晰，肝臟腫大，肝前緣變鈍。3、病理組織學分析。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉條件下，活檢肝組織，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、4um切片，制備肝臟組織學切片，用于HE染色，采用Leica顯微鏡觀察肝細胞脂肪變性情況。病理切片分析結果
正常肝切片，肝細胞正常，明顯可見細胞核、胞質(zhì)和膜見圖6 (200X)和圖7 (100X),HE染色。輕度脂肪樣病變圖，明顯可見脂肪細胞，同時可見大量正常肝細胞見圖8(200X)，HE 染色。中度脂肪樣病變圖，明顯可見脂肪細胞，同時可見大量正常肝細胞。但脂肪細胞與正常肝細胞數(shù)量的比例明顯增加見圖9 (200X)，HE染色。重度脂肪樣病變圖，可見大范圍的脂肪細胞，正常肝細胞比例明顯減少，肝細胞約有75%脂肪變見圖10 (200X)，HE染色。同樣，重度脂肪樣病變圖，肝細胞約有95%脂肪病變見圖11 (100X)、圖12(200X)和圖 13 (400X )，HE 染色。
權利要求
1.樹駒非酒精單純性脂肪肝動物模型的構建方法，其特征是隨機選取成年雄性和雌性樹駒作為模型動物，雄性成年體重120 140克，雌性成年體重110 130克，用高脂飼料供樹駒自由采食，高脂飼料成分為每公斤普通飼料加20g膽固醇和200g豬油，并提供純凈水自由飲用，持續(xù)飼養(yǎng)14周，該期間為造模期。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征是在造模期內(nèi)樹駒普通飼料的營養(yǎng)成分為19%<粗蛋白質(zhì)〈21%、4%〈粗脂肪〈5%。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征是隨機選取成年雄性和雌性樹駒各10只作為模型動物的對照動物，雄性體重120 140克，雌性體重110 130克，自由采食普通飼料。
全文摘要
樹鼩非酒精單純性脂肪肝動物模型的構建方法。本發(fā)明以樹鼩為模型動物，用每公斤普通飼料加20g膽固醇和200g豬油為高脂飼料，供樹鼩自由采食，提供純凈水自由飲用。7周后，60%的樹鼩呈明顯脂肪肝癥狀，14周后，80%的樹鼩呈明顯的脂肪肝癥狀，其中20%的樹鼩呈重癥脂肪肝癥狀，部分樹鼩有約95%的肝細胞脂肪化。分析結果證明，本發(fā)明造模時間短，成功率高，安全可靠，可用于非酒精性脂肪肝，尤其是單純性脂肪肝的藥物研究與功效評價。
文檔編號A01K67/00GK102696535SQ20121010620
公開日2012年10月3日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權日2012年4月12日
發(fā)明者司晨洋, 司維, 張瓊書, 施桂英, 牛昱宇, 王宏, 王芳, 郭祥玉 申請人:中國科學院昆明動物研究所