Ggpps基因在制備治療非酒精性脂肪肝藥物的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了GGPPS作為靶點治療非酒精性脂肪肝的應用。本發(fā)明的GGPPS拮抗劑能降低與肝臟脂質積累有關的基因表達。本發(fā)明的肝臟特異性敲除GGPPS可以減緩肝臟脂質積累和變性，降低血液中天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)水平，保護肝臟功能。
【專利說明】GGPPS基因在制備治療非酒精性脂肪肝藥物的用途

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及GGPPS基因在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的用途，肝臟特異性GGPPS敲除及GGPPS拮抗劑可降低肝臟脂質積累，對治療非酒精性脂肪肝有顯著作用。

【背景技術】
[0002]非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種無過量飲酒史，但病理學改變類似酒精性脂肪性肝病(AFLD)，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征。其疾病譜包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化四個從輕到重的病理階段。近年來由于生活方式、飲食結構等的改變，NAFLD亦隨著肥胖、2型糖尿病、血脂異常等代謝相關疾病的增加而越來越弓I起人們的重視。
[0003]NAFLD的臨床表現(xiàn)隨病因、肝臟的脂肪及炎癥浸潤程度、病程及伴隨的基礎疾病如肥胖、糖尿病、高血壓、冠心病等不同而不同。多數(shù)患者(48%?100% )無肝病癥狀，少數(shù)會有乏力、右上腹不適或隱痛等非特異性癥狀。肝腫大常是許多患者的唯一體征，肝功能多正?；蜣D氨酶輕度升高，并以ALT為主，且AST/ALT < I。部分患者進展為終末期肝病時，可出現(xiàn)黃疸、腹水、消化道出血等表現(xiàn)。
[0004]NAFLD在總人群中的患病率為20% (15%?39%)，NASH為2%?3%。日本NAFLD患者占非嗜酒者的14%，而美國成人中高達23%，是最常見的肝疾病。NAFLD可發(fā)生于任何年齡，兒童的發(fā)病率為2.6%，肥胖兒童可增加到52.8%。我國B超發(fā)現(xiàn)脂肪肝在一般人群中的患病率為10%?16%，肥胖患者的檢出率為38%。
[0005]目前已有大量的關于非酒精性脂肪肝及其治療的臨床報道，但導致NAFLD的具體機制并不清楚?，F(xiàn)今廣泛接受的關于NAFLD發(fā)病機制的理論是“二次打擊”假說:第一次“打擊”是脂肪醇和甘油三酯在肝臟沉積，引起的單純脂肪變性；在此基礎上引起慢性氧化應激，造成肝細胞線粒體和肝細胞本身的持續(xù)損傷和炎癥的形成即為第二次“打擊”?，F(xiàn)在研究表明，肝細胞內甘油三酯(TriglyCeride，TG)的積累是非酒精性脂肪肝病變的第一步，造成了肝臟組織的第一次損傷打擊。由于肝細胞內TG的積累是可以逆轉的，因而明確肝細胞內TG積累的具體調節(jié)機制對治療和預防NAFLD的發(fā)生有著重要的臨床意義。
[0006]ggpps基因即香葉基香葉基二憐酸合成酶(geranylgeranyl diphosphatesynthase I, ggpps I)基因。在蛋白質異戍二烯化修飾過程中起到關鍵作用，ggpps的底物GGPP是小G蛋白發(fā)生香葉基化的重要前體。香葉基化是蛋白質的翻譯后修飾之一，一般發(fā)生在蛋白質C末端保守的半胱氨酸。發(fā)生香葉基化的蛋白質包括Ras和Ras相關的小G蛋白如Rho，Rab，Rac，以及三聚體G蛋白的Y亞基，這些受調控的蛋白質都是信號傳遞通路中重要的分子開關調節(jié)蛋白。有研究報道，以GGPPS為藥物靶點對于成骨細胞分化與骨骼構建有改善作用(Weivoda and Hohl 2011)，也有研究闡述了 GGPPS可作為香煙煙霧引發(fā)的肺部疾病的治療靶點(Shen，Gong et al.2011)，但就GGPPS用于治療非酒精性脂肪肝之間的靶點藥物并沒有任何報道。


【發(fā)明內容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于通過考察肝臟特異性GGPPS敲除小鼠肝臟中脂質積累情況及肝臟中與脂質合成相關基因的表達量等指標，確認GGPPS能否作為非酒精性脂肪肝治療的藥物靶點，從而為治療非酒精性脂肪肝開辟新的道路，提高非酒精性脂肪肝患者的生命質量。
[0008]為達上述目的，發(fā)明人通過高脂誘導建立非酒精性脂肪肝小鼠模型，并檢測其肝臟組織中GGPPS的表達水平。通過real time方法檢測發(fā)現(xiàn)，高脂誘導的非酒精性脂肪肝小鼠肝臟組織中GGPPS的表達量顯著增加。
[0009]為進一步證實GGPPS在非酒精性脂肪肝的發(fā)生中起到重要的調控作用，發(fā)明人在肝臟脂質代謝細胞模型原代肝細胞中過表達GGPPS，發(fā)現(xiàn):GGPPS可以顯著提高肝細胞內脂滴積累的效率以及PPAR Y的表達，并且很多PPAR Y負責激活表達的下游脂質合成相關基因FAS，SREBP-lc, ACCI, S⑶-1，PPAR Y的表達顯著增加。此外，發(fā)明人構建了小鼠肝臟特異性敲除的GGPPS模型，并對其與對照組進行高脂誘導。連續(xù)12周體重記錄顯示肝臟特異性GGPPS敲除減緩了高脂誘導的體重增加。高脂誘導后的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠和對照鼠肝臟切片油紅染色和HE染色分別顯示GGPPS肝臟特異性敲除緩解了高脂誘導產生的肝臟脂質積累和變性。解剖顯示肝臟特異性敲除GGPPS避免了高脂誘導后的過度增重及肝臟由于脂質積累產生的發(fā)白現(xiàn)象。而且肝臟特異性GGPPS敲除保護了肝臟的功能，緩解了高脂誘導后的血糖不耐受和胰島素抵抗。此外，GGPPS肝臟特異性敲除降低了肝臟脂質合成相關基因的表達。上述細胞水平和動物水平的實驗結果均證明了 GGPPS在非酒精性脂肪肝的發(fā)生中起到重要的調控作用。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的記載和本領域的公知常識，抑制GGPPS對于治療非酒精性脂肪肝有顯著作用。GGPPS基因重組表達載體例如本申請中構建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒可以單獨或與其他有功能活性基因重組表達載體聯(lián)合，再輔以藥學上可接受的載體，用以制備治療非酒精性脂肪肝的藥物。
[0011]本發(fā)明治療非酒精性脂肪肝的藥物施用方式可以是口服、肝臟特異性施用或全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)。本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進行制備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。
[0012]進一步，根據(jù)本發(fā)明的記載和本領域的公知常識可知，任何在轉錄和/或翻譯水平上抑制GGPPS基因的拮抗劑均可單獨或與其他具有功能活性的多肽、蛋白質、融合蛋白等聯(lián)合，再輔以藥學上可接受的載體，用于制備治療非酒精性脂肪肝的藥物。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明首次公開了 GGPPS基因和蛋白的拮抗劑可以用于制備治療非酒精性脂肪肝的藥物，肝臟特異性抑制GGPPS表達可以減緩肝臟脂質積累和性變，在非酒精性脂肪肝治療領域具有潛在、良好的應用前景。
[0014]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為肝臟特異性GGPPS敲除小鼠的敲除效率檢測。顯示肝臟特異性GGPPS敲除小鼠的肝臟中GGPPS的mRNA和蛋白質水平下降，表示兩者相比具有統(tǒng)計學顯著差異。
[0016]圖2為用正常飼料和高脂飼料喂養(yǎng)下，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與對照鼠12周的體重檢測。顯示了 GGPPS敲除減緩了正常飼料和高脂誘導下的體重增加。
[0017]圖3為正常飼料和高脂飼料喂養(yǎng)下，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與對照鼠肝臟切片HE染色后光鏡圖。顯示GGPPS肝臟特異性敲除緩解了高脂誘導產生的肝臟脂質變性。
[0018]圖4為正常飼料和高脂飼料喂養(yǎng)下的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與對照鼠肝臟切片油紅O染色后光鏡圖，顯示GGPPS肝臟特異性敲除緩解了正常飼料和高脂誘導下的肝臟脂質積累。
[0019]圖5為正常飼料和高脂飼料喂養(yǎng)下的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與對照鼠肝臟，顯示GGPPS肝臟特異性敲除保護肝臟的過度增重及肝臟由于脂質積累產生的發(fā)白現(xiàn)象。
[0020]圖6為GGPPS肝臟特異性敲除小鼠血液中AST和ALT水平下降，顯示GGPPS的肝臟特異性敲除保護了肝臟的功能。
[0021 ] 圖7顯示GGPPS肝臟特異性敲除小鼠降低了 Erk/MAPK的激活。
[0022]圖8顯示GGPPS肝臟特異性敲除降低了肝臟脂質合成相關基因表達。
圖9顯示在原代肝細胞中過表達GGPPS可促進PPAR Y的表達及SREBP-1的成熟。
[0023]圖10顯示原代肝細胞中干擾GGPPS可降低PPAR Y和ADRP的表達。

【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0025]以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗指南New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件
一般材料和方法
材料:原代肝細胞由正常小鼠肝臟分離。Ant1-p-ERK抗體、ant1-ERK抗體購自上?？党巧锛夹g公司，GGPPS, PPAR Y，SREBP-1, β-actin’ a-tubulin 抗體購自 Santa Cruz公司。ECL發(fā)光液購自CST公司，Trizol購自TAKARA公司，反轉錄試劑盒購自TAKARA公司。熒光定量PCR試劑盒購自B1neer公司。油紅染料購自南京生興生物技術公司。肝臟特異性GGPPS敲除小鼠及對照小鼠購自南京大學模式動物研究所。
[0026]方法I小鼠肝臟細胞分離培養(yǎng)
小鼠用2%戊巴比妥鈉按(45mg/kg)麻醉后暴露腹腔，燈泡靠近小鼠保持體溫，在小鼠下腔靜脈處插管，用 Pl 灌流液(Krebs Ringer with glucose 40ml, 50mM EGTA 80 μ I) 2ml預灌流，見肝臟變色后剪開門靜脈，灌流速度加快，40ml在6分鐘左右灌流完畢。換20ml P2灌流液(Krebs Ringer with glucose 40ml, IM Cac12 54.88 μ I)灌流，完畢后肝臟呈土黃色。
[0027]在超凈臺中將肝臟整體摘下，在預冷培養(yǎng)皿中用PBS漂洗。在滅菌培養(yǎng)皿中加入1ml P2，將肝臟包膜除去、撕碎后用篩子和漏斗過濾。濾液置于50ml離心管中加4°C DMEM培養(yǎng)基(10%FBS加100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM) 20ml混勻，50gpm離心2分鐘。吸去培養(yǎng)液后加30ml預冷培養(yǎng)液重懸細胞，50gpm離心2分鐘，重復三次。吸去培養(yǎng)液后加15ml預冷培養(yǎng)液重懸檢測活率。
[0028]接種細胞于6孔板，調整密度為5 X 105，加入37°C DMEM培養(yǎng)基，與37°C、5% C02濃度下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0029]非酒精性脂肪肝小鼠模型建立及分組
受試動物適應性飼養(yǎng)I周后，分別稱重，空白組由12只肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與12只對照鼠組成，正常食物(含4%脂肪)及飲水。高脂誘導由12只肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與12只對照鼠組成，予以高脂飼料(含65%脂肪)，正常飲水，飼養(yǎng)12周，每周稱重一次。
[0030]方法2石蠟切片制備
取肝右葉組織約適量，用4%的多聚甲醛固定24?48h，逐級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，厚度為5 μ m。
[0031]方法3石蠟切片的HE染色將切片分別浸于二甲苯中10分鐘和5分鐘脫蠟，之后于梯度乙醇中附水。蘇木精染色4分鐘后單蒸水稍洗。用0.25% NA3.H20泛藍30s后單蒸水洗。用梯度濃度乙醇脫水至95%乙醇脫水后，0.5%伊紅液染色2-3s，之后100%乙醇中脫水，并在二甲苯中浸泡2分鐘。最后用中性樹膠封片。
[0032]方法4冰凍切片制備:各組實驗鼠于肝右葉相同部位取適量組織，多聚甲醛固定2hr，30%蔗糖脫水8-12hr，OCT包埋。放在_70°C冰箱保存。冰凍切片機切片，切片厚度為 15 μ m。
[0033]方法5油紅染色:取高脂誘導后的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠和對照鼠肝組織做冰凍切片，60%乙醇稍洗，浸染于油紅O染色液工作液中染色(60%油紅O原液加40%單蒸水)10-15分鐘，60%乙醇分化，水洗，Harris蘇木精染核I分鐘，水洗I分鐘，吸干水分，甘油明膠封片。
[0034]方法6小鼠組織蛋白提取:小鼠喂養(yǎng)第4周后，稱取小鼠體重，2%戊巴比妥鈉按45mg/kg麻醉，剪開腹腔，取全部肝臟稱量濕重，并取肝左葉制備肝臟組織勻漿。用電子天平稱取肝臟組織10mg,剪碎后加入蛋白裂解液300ul(20mmol/L Tris (pH 7.5), 4mmol/L EDTA (pH8.0)，2% SDS),組織勻漿，13，000 rpm、4 V、15min 離心，棄沉淀，取上清液。-70 V冰箱保存，99變性。
[0035]方法7培養(yǎng)細胞蛋白提取:細胞培養(yǎng)至可以進行蛋白抽提時，吸去培養(yǎng)基，用冰預冷的 PBS 洗兩遍，加入 300ul 裂解緩沖液(50.0 mmol/L Tris (pH 7.5), 150.0 mmol/L NaCl, 0.1% SDS, 1.0% NP-40, 0.5% 脫氧膽酸鈉，lmmol/L EDTA)冰浴 30 min，期間每隔5min混勻一次，刮取細胞，12 000 rpm離心15分鐘，收集上清，采用BCA法測定蛋白質濃度，99°C變性。
[0036]方法8免疫印跡分析:取50 Ug的總蛋白(組織或細胞中提取)進行SDS-PAGE膠電泳分離，按常規(guī)方法轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4°C孵育過夜，ant1-GGPPS(1:500)，ant1-PPARy (1:500)，ant1-SREBP-l (1:500)，ant1-β -actin (1:500)，ant1-a-tubulin (1:500)，HRP標記的二抗:孵育1.5小時，之后用ECL發(fā)光液曝光檢測結果O
[0037]方法8提取組織標本RNA:取50mg組織標本，懸浮于Iml Trizol，用組織勻漿器勻衆(zhòng)3-5 min,加1/5體積酹氯仿抽提蛋白，13000rpm,離心15分鐘,抽取上清,加等體積的異丙醇，-20 V，20分鐘沉淀RNA，13000rpm,離心15分鐘，棄上清，75ET0H沉淀溶于20ul DEPC(焦碳酸二乙脂)溶液，測定濃度。
[0038]方法9反轉錄PCR:通過反轉錄試劑盒，取Img總RNA反轉錄合成單鏈cDNA ,流程如下:Img總RNA,加入4 μ I pre-mix,補DEPC水至20ul。37° C反應30 min后，85° C 處理 5s。
[0039]-20°C 保存。
[0040]方法10實時熒光定量PCR:采用實時熒光定量PCR試劑盒(b1neer)，具體體系如下:20μ I 體系，SYBR(2*):10μ l，Rox 0.4ul 引物(上游)(10*):2 μ 1，引物(下游)(10*):2 μ I, cDNA 模板:2 μ I,加雙蒸水至 20 μ I。
[0041]ggpps實時定量PCR引物序列:
ggpsl(鼠)正向:5，- TTTTGCATACACTCGACACACT-3’
ggpsl (鼠)反向:5，- GGCCTCAATTTGTTTGTAGGCTT-3，
擴增條件:95°C預變性I分鐘，95°C變性15秒，60°C退火15秒，72°C延伸，收集熒光信號30秒，共40個循環(huán)，數(shù)據(jù)分析。
[0042]方法11 pATC-GGPPS/siRNA構建:根據(jù)siRNA設計的一般原則設計選取靶序列。本實驗選取的靶序列是5’ - GGUGUCCCAUCUGUCAUUA-3’ (GGPPS小干擾RNA靶向序列)(SEQ ID NO:1),將靶向上述序列的 siRNA 的編碼序列 5’-GGTGTCCCATCTGTCATTA-3’ (P1, SEQ ID NO:2)及其反義序列 5’- TAATGACAGATGGGACACC-3，(P2, SEQ ID NO:3)交由上海生工生物技術有限公司合成。
[0043]寡核苷酸退火:將合成的寡核苷酸溶解在ddH20中，終濃度為lyg/ Ul。依次按以下步驟操作:寡核苷酸P1，P2各取1.5μ I加入47 μ I的退火緩沖液(100 mmol/L乙酸鉀，30 mmol/L HEPES-KOH pH 7.4，2mmol/L 乙酸鎂)，94°C 孵育 4 min, 70°C 孵育 10min ,緩慢冷卻至4°C。
[0044]寡核苷酸磷酸化:取Iul退火的寡核苷酸，加I μ I Τ4 PNK緩沖液、I ul Immol/L AT P (儲存液 1mM) Uul T4 PNK,6 μ 1Η20,在 37°C 孵育 30 min，70°C孵育 10min (滅活 PNK)。
[0045]質粒酶切、去磷酸化與純化:按如下體系以Bgl II和Hind III 雙酶切穿梭質粒，37 V孵育4 h。85°C，加熱15 min以終止反應。直接向反應體系中加入0.1 μ?的小牛腸堿性磷酸酶(CIP)去磷酸化反應I h。用1%的瓊脂糖凝膠電泳。在長波紫外燈照射下，割取目的片段，用DNA膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收。
[0046]Bgl II和Hind III雙酶切穿梭質粒反應體系:
1Xbuffer1.0 μ I
穿梭質粒8.0 μ I (?2.0yg)
Bgl II0.2 μ KlOU/ μ I)
Hind III0.2 μ I (1U/ μ I)
Η200.6 μ I
連接與轉化連接反應體系:
1XLigase buffer1.0 μ I
T4 DNA Ligase0.5 μ I
酶切過的載體5.0μ1
Pl0.5 μ I P20.5 μ I
H202.5 μ I
將5.0 μ I的酶切過的載體轉移到無菌微量離心管中，加Ρ1、Ρ2各0.5 μ I，加水至8.5 μ?，于45° C加溫5 min以使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻至(TC，再分別加入連接酶緩沖液1.0 μ1，Τ4 DNA連接酶0.5 μ?，混勻，于16°C孵育過夜。次日取5.0μ I轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。
[0047]重組質粒的鑒定:挑克隆，小量提取質粒，以EcoR I酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定。預期陽性克隆酶切產物會釋放一個300 bp的條帶，而陰性對照相應條帶只有240 bp ο
[0048]為了進一步從序列的準確性上得到驗證，選取EcoR I酶切后電泳出現(xiàn)300bp條帶的陽性重組質粒送至上海生工有限公司測序。
[0049]在重組包裝病毒之前，我們用磷酸鈣沉淀法將重組穿梭質粒瞬時轉染293A細胞對其基因沉默效率進行了檢測。
[0050]方法11 Ade-ggpps /siRNA重組腺病毒的構建:重組質粒pATC-GGPPS/siRNA經Pme I酶切線性化后，用電穿孔法將其與質粒pAdEasy-Ι共同轉化感受態(tài)菌BJ5183 (條件:電脈沖25 μ F，電壓2.5 kV,電阻200 Ω)，進行同源重組。用Pac I酶切鑒定同源重組的質粒，以電穿孔法將重組子轉化入大腸桿菌DHlO α內，大量制備重組腺病毒質粒DNA備用轉染。
[0051]重組腺病毒的包裝和收獲:將重組質粒用磷酸鈣法轉染ΗΕΚ-293Α細胞。轉染后7-10天，出現(xiàn)細胞病變效應(cytopathic effects, CPE),表現(xiàn)為貼壁細胞變圓、核濃縮、脫落，出現(xiàn)病毒空斑。收集細胞，反復凍融3次，離心，收集上清于-70 V保存?zhèn)溆谩?br> [0052]病毒顆粒濃度的測定:在24孔細胞培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)的4孔293細胞生長至90%匯合時，吸去培養(yǎng)液，加入0.5 mL無血清DMEM培養(yǎng)液，分別滴加入5、10、30及40 ul的病毒稀釋液(稀釋約500倍),小心混勻,置于含5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Ih后,小心加入
0.5 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，混勻、培養(yǎng)，觀察CPE ;3 d后，待加入5ul病毒稀釋液的孔完全出現(xiàn)CPE現(xiàn)象時，計數(shù)細胞并計算病毒顆粒的濃度。病毒顆粒的濃度=(細胞數(shù)X20/病毒稀釋液的體積)X病毒稀釋倍數(shù)。
[0053]實施例
實施例1肝臟特異性GGPPS敲除的工具小鼠的建立。
[0054]根據(jù)前面“一般材料與方法” 一節(jié)的方法，我們通過Cre-LoxP建立了肝臟特異性GGPPS敲除的工具小鼠。通過免疫印跡法和反轉錄PCR，熒光實時定量PCR檢測了敲除鼠和對照鼠肝臟組織中GGPPS mRNA和蛋白水平。如圖1A所示，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠的肝臟組織中GGPPS蛋白質水平下降。如圖1B所示，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠的肝臟組織中GGPPS mRNA水平下降。上述結果表明肝臟特異性GGPPS敲除的工具小鼠得以成功建立。
[0055]實施例2肝臟特異性敲除GGPPS緩解了肝臟脂質積累和變性
根據(jù)前面“一般材料與方法”一節(jié)的方法，我們對高脂誘導的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠與對照鼠肝臟切片HE染色和油紅O染色，顯示肝臟特異性GGPPS敲除緩解了肝臟脂質積累和變性。圖3顯示GGPPS肝臟特異性敲除緩解了高脂誘導產生的肝臟脂質變性。圖4顯示GGPPS肝臟特異性敲除緩解了高脂誘導產生的肝臟脂質積累。圖5顯示GGPPS肝臟特異性敲除保護肝臟的過度增重及肝臟由于脂質積累產生的發(fā)白現(xiàn)象。
[0056]實施例3肝臟特異性敲除GGPPS保護了肝臟的功能。
[0057]根據(jù)“一般材料和方法”一節(jié)的方法，我們分別檢測了高脂飼料和常規(guī)飼料喂養(yǎng)的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠和對照鼠血液中AST和ALT的水平。結果顯示肝臟特異性敲除GGPPS降低了高脂飼料喂養(yǎng)下小鼠的AST和ALT水平。說明了肝臟特異性敲除GGPPS可以保護肝臟功能的受損。如圖6所示，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠的AST和ALT水平在高脂飼料喂養(yǎng)下較對照鼠低。
[0058]實施例4肝臟特異性敲除GGPPS降低了肝臟脂質合成相關基因的表達水平。
[0059]根據(jù)“一般材料和方法”一節(jié)的方法，我們檢測了高脂飼料和常規(guī)飼料喂養(yǎng)的肝臟特異性GGPPS敲除小鼠和對照鼠肝臟中與肝臟脂質合成相關基因(FAS，SREBP-lc, ACC1,S⑶-1，PPAR Y )的mRNA水平，結果顯示肝臟特異性敲除GGPPS降低了高脂飼料喂養(yǎng)下小鼠的肝臟中FAS, SREBP-lc, ACCI, S⑶-1和PPAR Y的mRNA水平。如圖8所示，肝臟特異性GGPPS敲除小鼠肝臟的FAS, SREBP-lc, ACCI, SCD-1，和PPAR Y的mRNA水平在高脂飼料喂養(yǎng)下較對照鼠低。
[0060]實施例5原代肝細胞中過表達GGPPS促進PPAR Y的表達及SREBP-1的成熟。
[0061]根據(jù)“一般材料和方法” 一節(jié)的方法，我們在原代肝細胞中過表達GGPPS，并用免疫印跡法檢測了 PPARy蛋白、前體SREBP-1和核SREBP-1。結果顯示過表達GGPPS促進了PPARy的表達，同時也促進了 SREBP-1的成熟。如圖9所示，GGPPS過表達后，原代肝細胞中PPARy蛋白水平提高，成熟的SREBP-1蛋白水平提高。
[0062]實施例6干擾原代肝細胞中GGPPS的表達可以減緩肝細胞脂質積累
我們使用上節(jié)“一般材料和方法”中構建的Ade-ggpps/siRNA重組腺病毒干擾原代肝細胞中GGPPS的表達。并測定細胞中與肝臟脂質合成相關基因(PPAR Y，ADRP)的mRNA水平。結果顯示，原代干細胞中干擾GGPPS降低了培養(yǎng)基脂肪酸陽性條件下PPAR Y，和ADRP的表達。如圖10所示，培養(yǎng)基加入脂肪酸情況下，GGPPS干擾原代肝細胞中PPARy和ADRP的mRNA水平較對照組低。
【權利要求】
1.靶向抑制GGPPS基因的試劑在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的用途。
2.根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向抑制肝臟特異性GGPPS基因的試劑是任何在轉錄和/或翻譯水平上抑制GGPPS基因的拮抗劑，包括但不限于抑制GGPPS基因轉錄和/或翻譯的小干擾RNA。
3.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于所述靶向抑制肝臟特異性GGPPS基因的試劑是小干擾RNA。
4.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述小干擾RNA靶向以下序列:5’_GGUGUCCCAUCUGUCAUUA-3’ (SEQ ID NO:1)。
5.根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述小干擾RNA的編碼序列為5’-GGTGTCCCATCTGTCATTA-3’ (SEQ ID NO:2)。
6.根據(jù)權利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述小干擾RNA由重組腺病毒真核表達載體表達。
【文檔編號】A61K48/00GK104415349SQ201310401483
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權日:2013年9月6日
【發(fā)明者】李朝軍, 薛斌, 姜珊, 石夢月, 沈寧 申請人:南京大學