Glp-1r/gcgr雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽治療脂肪肝病、高脂血癥和動(dòng)脈硬化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一類具有胰高血糖素樣肽?1受體(Glucagon?like peptide?1receptor，GLP?1R)和胰高血糖素受體(Glucagon receptor，GCGR)雙激動(dòng)效應(yīng)的多肽化合物的用途，其具有高酶解穩(wěn)定性、高生物活性、無不良反應(yīng)等特點(diǎn)，能夠降低因糖尿病以及高脂膳食誘發(fā)的血中總膽固醇和甘油三酯水平異常升高，降低肝酶水平，改善肝臟損傷和纖維化程度，并可用于預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化等疾病。
【專利說明】
GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽治療脂肪肝病、高脂血癥和動(dòng) 脈硬化
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多 肽。本發(fā)明還涉及上述雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽對(duì)非酒精性脂肪肝病、高脂血癥、動(dòng)脈硬化等疾病 的預(yù)防和/或治療用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種非酒精過量導(dǎo)致的漸進(jìn)性的復(fù)雜的肝臟疾?。?從脂肪變性，非酒精性肝炎（NASH)，進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化（Fibrosis)和肝硬化 (Cirrhosis)，甚至最終發(fā)展成肝細(xì)胞癌或肝衰竭。全球NAFLD患病率在過去30年中翻了一 番:其中，中國的NAFLD患者已達(dá)2.7億人。單純的脂肪變性與短期的發(fā)病率或死亡率增加并 沒有相關(guān)性，然而NASH患者最終進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。NASH所 引起的肝硬化是目前肝移植的主要原因之一。另外，在NASH患者中肝病所致的心血管疾病 發(fā)病率和死亡率較正常人群顯著增加。日益增長的NAFLD發(fā)病率勢(shì)必會(huì)造成有限醫(yī)療資源 的進(jìn)一步緊張和消耗。
[0003] NASH被廣泛認(rèn)為是諸如II型糖尿病、胰島素抵抗、中央性肥胖、高脂血癥和高血壓 等代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。糖脂代謝異?？梢砸鹛悄虿?、NASH和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。而 NASH的形成會(huì)進(jìn)一步加重糖尿病及其動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的血管并發(fā)癥等疾病，最終引起臟 器纖維化和功能衰竭。
[0004] 目前仍然缺乏有效的治療NAFLD/NASH的藥物，PPAR- γ類胰島素增敏劑、奧貝膽酸 等法尼酯衍生物X受體(FXR)激動(dòng)劑作為新型的在研藥物，其長期使用安全性以及治療有效 性均有待進(jìn)一步證明（Armstrong MJ，Gaunt P，Aithal GP，et al · Lancet，2015 · doi : 10.1016/S0140-6736(15)00803-X.)。多肽藥物具有如下的優(yōu)點(diǎn)：首先，它們多數(shù)源于內(nèi)源 性肽或其他天然肽，結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)制明確；其次，它們與一般小分子藥物相比，活性更 高、用藥劑量更小、毒副作用更低，而且代謝終產(chǎn)物為氨基酸，無毒副作用;第三，它們與外 源蛋白質(zhì)相比，免疫原性較低，可以化學(xué)合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控;第四，多肽藥物往往 能規(guī)避胃腸道消化，克服蛋白質(zhì)分子被消化酶破壞從而不能口服的弊端。
[0005] 胰高血糖素樣肽-1 (Glucagon-1 ike peptide-1，GLP-1)是一種葡萄糖依賴性腸促 胰島素。人GLP-1來源于胰高血糖素原(Proglucagon)。胰高血糖素原由158個(gè)氨基酸組成， 在不同的部位被切割成不同的肽鏈。GLP-1結(jié)合胰島辟田胞上的GLP-1受體(GLP-1R)后，激活 細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路，與葡萄糖協(xié)同刺激胰島素合 成和分泌。除此以外，GLP-1還具有保護(hù)和促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，改善胰島素敏感性，抑制胰 高血糖素分泌，抑制胃排空，降低食欲，抑制食物攝入，控制體重的藥理功能。由于天然人 GLP-1的半衰期很短，沒有成藥性，因此需要對(duì)天然GLP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和修飾，以提高這類 藥物的生物半衰期。這類的GLP-1衍生物在結(jié)構(gòu)上與GLP-1相似，并且在功能上和GLP-1相 似，能結(jié)合并激活GLP-1R，因此被稱作GLP-1類似物或者GLP-1R激動(dòng)劑。在NASH的嚙齒類動(dòng) 物模型中，GLP-1類似物能夠降低肝酶水平和氧化應(yīng)激、改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、抑制脂質(zhì) 氧化、并改善肝臟組織學(xué)損傷程度（Trevaskis JL，Griffin PS,Carrie W，et al.Ajp Gastrointestinal&Liver Physiology ,2012,302(8) :G762_72.) aLiraglutide(利拉魯 肽），一種長效GLP-1類似物，能顯著改善NAFLD和NASH患者的臨床癥狀，同時(shí)可以顯著降低 肥胖患者體重，改善血糖異常。（Armstrong MJ, Gaunt P，Aithal GP，et al. Lancet, 2015.doi:10.1016/S0140-6736(15)00803-X·)。
[0006] 然而，至今，GLP-1類似物的藥代動(dòng)力學(xué)及安全性均不明確，引入的外源化學(xué)基團(tuán) 究竟如何代謝、如何排泄、對(duì)人體有何影響，均不明確，尚待進(jìn)一步研究。
[0007] 胰高血糖素(Glucagon)是一種由胰島α細(xì)胞分泌的激素，由一條長度為29個(gè)氨基 酸的單鏈多肽組成。胰高血糖素通過特異性結(jié)合肝臟和肝腎上的靶細(xì)胞表面的胰高血糖素 受體(GCGR)，激活細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase)，提高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平， 發(fā)揮生理效應(yīng)。胰高血糖素是一種促進(jìn)分解代謝的激素，短期注射胰高血糖素能促進(jìn)糖原 分解和糖異生作用，使血糖升高。胰高血糖素與胰島素是一對(duì)作用相反的激素，在維持血 糖穩(wěn)態(tài)上構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。更為重要的是，動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射胰高血糖素 以長期激活GCGR能夠降低食欲，刺激脂肪酸分解，顯著提高脂肪組織的能量消耗(Campbell JE，Drucker DJ.Nature ReviewsEndocrinology，2015，11(6):329-338·)〇
[0008] 提高多肽的體內(nèi)半衰期，降低多肽給藥頻率的最常用的手段是綴合單甲氧基聚乙 稀二醇(methoxypoly ethylene glycol，mPEG)，通過增加多肽分子排阻體積，降低藥物分 子的腎臟過濾清除率，從而延長mPEG修飾后的藥物血漿半衰期，降低給藥頻率。然而這種方 法造成大部分蛋白質(zhì)的生物活性有不同程度的降低。更危險(xiǎn)的是，mPEG是一種人體不能代 謝的分子，由其衍生的多肽蛋白類藥物可導(dǎo)致腎臟的空泡化(Bendele A，Seely J，Richey C，et al · Toxicological Sciences，1998,42(2): 152-157 ·)。目前，mPEG的毒性往往被極大 限度地忽視。因而開發(fā)安全有效的多肽藥物對(duì)臨床治療非酒精性脂肪肝病這種需要長期用 藥的慢性疾病十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人在早先的中國專利申請(qǐng)?zhí)?01510237027.7中，通過對(duì)胃泌酸調(diào)節(jié)素 (0xyntomudulin，0XM)分子進(jìn)行了改造，獲得了作為胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物的一類GLP-1R/ GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑，其具有更長的半衰期，促胰島素活性，無不良反應(yīng)，可用于糖尿病等疾 病的治療。本發(fā)明繼續(xù)深入實(shí)驗(yàn)，并提供了該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽的新生物活 性及其治療和適應(yīng)癥用途。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽在抑制和改善非酒精 性脂肪肝炎和肝纖維化包括肝硬化方面的生物活性及治療用途。本發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn) 研究，證明該類GLP-1 R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽能夠顯著抑制體外人肝星狀細(xì)胞LX-2的活 化，提示活性多肽具有良好的體外抗肝纖維化效應(yīng)。同時(shí)該類多肽可以顯著抑制CC1 4誘導(dǎo) 的小鼠肝纖維化。此外，該類多肽可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝和db/db糖尿病 小鼠肝臟脂肪樣變性和非酒精性脂肪炎癥。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽在抑制和改善 脂肪肝合并的肝纖維化方面的生物活性及治療用途。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究，證明該 類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽能夠顯著有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂質(zhì)和膠原 沉積，提示該類多肽能夠抑制脂肪肝合并的肝纖維化。
[0012] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽在糖脂代謝調(diào) 節(jié)、降血脂方面的生物活性及治療用途。發(fā)明人經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究證明：該類GLP-1R/ GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽能夠顯著降低db/db糖尿病小鼠血清甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC) 水平。
[0013] 本發(fā)明的再又一個(gè)目的在于提供該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽新的適應(yīng)癥 治療用途。
[0014] 該類GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽有望作為新一代高脂血癥、動(dòng)脈硬化、非酒精 性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪樣變性、非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝纖維化合并的肝 硬化)等疾病的預(yù)防或治療藥物。
[0015] 本發(fā)明中涉及含有以下氨基酸序列表示的母體肽的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多 肽：
[0016] His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal〇-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xaal6 -Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20-Xaa21 -Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu -Xaa27-Xaa28-Xaa29- Xaa30_Xaa31_Xaa32_Xaa33_Xaa34 _Xaa35_Xaa36_Xaa37_Xaa38 _Xaa39_Xaa40_C0Ri
[0017] 其中，心=-NH2 或-OH;
[0018] Xaa2=Aib，Ser或D_Ser;
[0019] XaalO = Lys 或 Tyr;
[0020] }(&&13 = 1^8或丁乂1';
[0021 ] Xaal6 = Ser，Aib，Lys 或 Glu;
[0022] Xaal7 = Lys 或 Arg;
[0023] Xaal8=Arg 或 Ala;
[0024] Xaa20 = His，Gln 或 Lys;
[0025] Xaa21 =Asp 或 Glu;
[0026] Xaa23 = lie，Leu或Val;
[0027] Xaa24=Glu 或 Gin;
[0028] Xaa27 =Met，Leu，NIe 或不存在；
[0029] Xaa28 = Ser，Asp，Asn，Arg 或不存在；
[0030] Xaa29=Ala，Gly，Thr 或不存在；
[0031 ] Xaa30=Gly 或不存在；
[0032] Xaa31 =Gly 或不存在；
[0033] Xaa32 = Pro 或不存在；
[0034] Xaa33 = Ser 或不存在；
[0035] Xaa34 = Ser 或不存在；
[0036] Xaa35=Gly 或不存在；
[0037] Xaa36=Ala 或不存在；
[0038] Xaa37 = Pro 或不存在；
[0039] Xaa38 = Pro 或不存在；
[0040] Xaa39 = Pro 或不存在；
[0041 ] Xaa40 = Ser 或不存在；
[0042] 所述氨基酸序列中，乂3310，乂3&16，乂3317或乂3320中至少一個(gè)為1^8，所述至少一個(gè) Lys或所述序列的第12位Lys的側(cè)鏈與親脂性的取代基相連，連接方式為所述親脂性的取代 基以其羧基與一個(gè)橋接基團(tuán)的氨基形成酰胺鍵，橋接基團(tuán)的氨基酸殘基的羧基與母體肽的 Lys的N-末端殘基上形成一個(gè)酰胺鍵連接到母體肽上；
[0043] 所述橋接基團(tuán)為Glu，Asp和/或(PEG)m，其中m為2-10的整數(shù);所述親脂性取代基為 選自CH 3(CH2)nC0-或H00C(CH2)nC0-的酰基，其中η是10-24的整數(shù)J尤選的橋接基團(tuán)可以為 Glu-(PEG)m或Asp-(PEG)m或(PEG)m，連接方式如圖16所示。
[0044] 本發(fā)明中優(yōu)選的化合物是含有下述氨基酸序列的母體肽：
[0045]
[0046] His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal〇-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xaal6 -Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20-Xaa21 -Phe-Xaa23-Xaa24-Trp-Leu -Xaa27-Xaa28-Xaa29- Xaa30_Xaa31_Xaa32_Xaa33_Xaa34 _Xaa35_Xaa36_Xaa37_Xaa38 _Xaa39_Xaa40_C0Ri
[0047] 其中，心=-順2;
[0048] Xaa2=Aib 或 D_Ser;
[0049] XaalO = Lys 或 Tyr;
[0050] Xaal3 = Lys 或 Tyr;
[0051 ] Xaal6 = Ser，Aib，Glu 或 Lys;
[0052] Xaal7 = Lys 或 Arg;
[0053] Xaal8=Arg 或 Ala;
[0054] Xaa20 = His，Gln 或 Lys;
[0055] Xaa21 =Asp 或 Glu;
[0056] Xaa23 = lie，Val;
[0057] Xaa24=Glu 或 Gin;
[0058] Xaa27 =Met，Leu 或 NIe;
[0059] Xaa28=Asn，Asp，Arg 或不存在；
[0060] Xaa29=Gly，Thr 或不存在；
[0061 ] Xaa30=Gly 或不存在；
[0062] Xaa31 =Gly 或不存在；
[0063] Xaa32 = Pro 或不存在；
[0064] Xaa33 = Ser 或不存在；
[0065] Xaa34 = Ser 或不存在；
[0066] Xaa35=Gly 或不存在；
[0067] Xaa36=Ala 或不存在；
[0068] Xaa37 = Pro 或不存在；
[0069] Xaa38 = Pro 或不存在；
[0070] Xaa39 = Pro 或不存在；
[0071 ] Xaa40 = Ser 或不存在。
[0072]本發(fā)明中涉及的化合物基于理論分子內(nèi)橋可以穩(wěn)定分子的螺旋結(jié)構(gòu)，從而提高了 針對(duì)GLP-1R或GCGR的效力和/或選擇性。本發(fā)明化合物在序列中攜帶一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)橋。 這樣的橋是由兩個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈之間形成，所述兩個(gè)氨基酸殘基通常被線性序列中的 三個(gè)氨基酸所分隔。例如所述橋可在殘基對(duì)12與16、16與20、17與21或者20與24側(cè)鏈之間形 成。兩個(gè)側(cè)鏈可通過離子相互作用或通過共價(jià)鍵彼此相連接。因此，這些殘基對(duì)可包含帶相 反電荷的側(cè)鏈，從而通過離子相互作用形成鹽橋。例如，一個(gè)殘基可以是Glu或Asp，而另一 殘基可以是Lys或Arg，Lys與Glu配對(duì)以及Lys與Asp配對(duì)分別還能夠反應(yīng)形成內(nèi)酰胺環(huán)。 [0073]本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽的藥物組合物，以所 述GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽作為活性成分添加藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料制成 藥物組合物。
[0074]本發(fā)明的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽具有調(diào)節(jié)糖脂代謝，降血脂(顯著抑制甘 油三酯和總膽固醇）的作用，可用作預(yù)防或治療高脂血癥的藥物。
[0075]本發(fā)明的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽具有顯著地抑制和改善肝臟脂肪樣變性 和非酒精性脂肪肝病的作用，可用作治療肝臟脂肪樣變性和非酒精性脂肪肝炎的藥物。 [0076]本發(fā)明的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽也具有顯著地抑制和改善脂肪肝合并 的肝纖維化及肝硬化的作用，可用作治療肝纖維化、肝硬化等疾病的藥物。
[0077]本發(fā)明的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽還可以用作動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化或 冠心病藥物的潛在用途。
[0078] 本發(fā)明多肽對(duì)肝臟脂肪樣變性、非酒精性脂肪肝炎、脂肪肝合并的肝纖維化及肝 硬化等非酒精性脂肪肝病(NAFLD)具有改善和治療作用。本發(fā)明多肽可用于直接或間接治 療由非酒精性脂肪肝病所引起的或者以其為特征的病癥。本發(fā)明多肽對(duì)肝纖維化及肝硬化 具有改善和治療作用。本發(fā)明多肽可用于肝纖維化及肝硬化所引起的或者以其為特征的病 癥。本發(fā)明所述多肽對(duì)循環(huán)膽固醇水平，甘油三酯具有有益調(diào)節(jié)作用。因此，本發(fā)明多肽還 可用于直接或間接治療由高脂血癥所引起的或者以其為特征的相關(guān)血管病癥，例如治療或 預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化或冠心病。
[0079] 本發(fā)明多肽在這些病癥中的治療作用可以是由多肽對(duì)肝腎、血液循環(huán)系統(tǒng)的作用 所致或與之相關(guān)，或者可以獨(dú)立于其對(duì)肝腎、血液循環(huán)系統(tǒng)的作用
[0080] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如口服 給藥、經(jīng)皮給藥、靜脈給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥方式，可 將本發(fā)明的多肽藥物組合物制成各種合適的劑型，其中包含至少一種有效量的本發(fā)明的多 肽和至少一種藥學(xué)上可接受的藥用載體。
[0081] 適當(dāng)劑型的實(shí)例為片劑、膠囊、糖衣片劑、粒劑、口服溶液和糖漿、用于皮膚表面的 油膏和藥貼、氣霧劑、鼻噴劑、以及可用于注射的無菌溶液。
[0082] 含有本發(fā)明多肽的藥物組合物可以制成溶液或者凍干粉以用于胃腸外給藥，在使 用前可加入適當(dāng)溶劑或其他可藥用的載體將粉末重新配制，液體配方一般是緩沖液、等滲 溶液和水溶液。
[0083] 本發(fā)明多肽在藥物組合物中的用量可以在較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)一些客觀的因素如疾病的種類、病情嚴(yán)重程度、患者體重、劑型、給藥途徑等因素很容 易地加以確定。
[0084]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0085] 1)與GLP-1類似物相比具有更好的生物學(xué)活性；
[0086] 2)在藥物的藥代實(shí)驗(yàn)中顯示出顯著延長的半衰期和穩(wěn)定性，穩(wěn)定性好，易于放大 生產(chǎn)，成本低；
[0087] 3)與小分子化合物相比具有更低毒性，安全窗口更大，用量更小。
[0088] 在具體的實(shí)施方案中，涉及下述GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽，其具有序列：
[0089] 化合物 1(涉及SEQ ID N0:1):
[0090] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2- γ Glu-C0 (CH2) 14CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0091] H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) 14CH3)-KLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0092] 化合物2(涉及SEQ ID NO:2):
[0093] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2_CO(CH2) i6C〇2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0094] H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG2-PEG2-CO( CH2)i6C02H)-KLD-A ib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0095] 化合物3(涉及SEQ ID NO:3):
[0096] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2_CO(CH2) i6CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0097] H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6CH3)-KLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0098] 化合物4(涉及SEQ ID NO:4):
[0099] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2_PEG2- γ Glu-⑶（CH2) i4CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0100] H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-SKYLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS
[0101] 化合物5(涉及SEQ ID NO:5):
[0102] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2_PEG2- γ Glu-⑶（CH2) i6C〇2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0103] H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ G lu-C0 ( CH2) i6C02H)-SKYLD-A i b-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0104] 化合物6(涉及SEQ ID NO:6):
[0105] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn- Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0106] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-yGlu-C0(CH2)i4CH 3)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0107] 化合物7(涉及SEQ ID NO:7):
[0108] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-CO(CH2)i6C〇2H)-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met_Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0109] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-Aib-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) i6C02H)-RAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0110] 化合物8(涉及SEQ ID NO:8):
[0111] Hi s-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2) 14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0112] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) 14CH3)-SKYLD-A i b-RRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0113] 化合物9(涉及SEQ ID NO:9):
[0114] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2_CO(CH2) i4CH3)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0115] H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG2-PEG2-C0(CH2)i4CH3)-KLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0116] 化合物10(涉及SEQ ID NO: 10):
[0117] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6C〇2H)-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0118] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-Aib-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6C〇2H)-RAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0119] 化合物11(涉及SEQ ID NO: 11):
[0120] His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-rGlu-CO(CH 2)i4C〇2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0121] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2) 14CO2H)-SKYLD-Aib-RRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0122] 化合物12(涉及SEQ ID NO:12):
[0123] His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)leCHs)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0124] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) 16CH3)-SKYLD-A i b-RRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0125] 化合物13(涉及SEQ ID NO:13):
[0126] His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-rGlu-CO(CH 2)i4C〇2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0127] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2 - γ Glu-C0(CH2)i4C02H)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0128] 化合物14(涉及SEQ ID NO: 14):
[0129] Hi s-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2) leCHs)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0130] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2 - γ G1u-C0(CH2)i6CH3)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0131] 化合物15(涉及SEQ ID NO:15):
[0132] His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-rGlu-CO(CH 2)i6C〇2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0133] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2 - γ G1u-C0(CH2)i6C02H)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0134] 化合物16(涉及SEQ ID NO: 16):
[0135] Hi s-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2) 14CH3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0136] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2 - γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-SKYLDERRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0137] 化合物17(涉及SEQ ID NO: 17):
[0138] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-rGlu-CO(CH 2)i6C〇2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ar g_Ala_NH2
[0139] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDS-K(PEG2-PEG2- γ Glu-⑶（CH2)i6C02H)-AAHDFVEWLLRA- nh2
[0140] 化合物18(涉及SEQ ID NO: 18):
[0141 ] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-yGlu-CO(CH2)i6C〇2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Ala-NH 2
[0142] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-CO(CH2)i6C02H)-EFIEWLLRA- nh2
[0143] 化合物19(涉及SEQ ID NO: 19):
[0144] His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-rGlu-CO(CH 2)i6C〇2H)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Leu-Asp-Gly- Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0145] H-Aib-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) i6C02H)-SKYLD-Ai b-RRAQDFVQWLLDGGPSSGAPPPS-NH2
[0146] 化合物20(涉及SEQ ID NO:20):
[0147] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys(PEG2-PEG2- γ Glu-CO (CH2)i6C〇2H)-Lys-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met_Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0148] H-(d-S)-QGTFTSDYS-K(PEG2-PEG2- γ Glu-CO(CH2)i6C02H)-KLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0149] 化合物21(涉及SEQ ID NO:21):
[0150] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2-PEG2-yGlu-CO(CH2)i6C〇2H)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0151] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDS-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i6C02H)-AAHDFV EWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0152] 化合物22(涉及SEQ ID NO:22):
[0153] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-CO(CH2)i6CH3)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu_Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0154] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDS-K(PEG2-PEG2 - γ Glu-CO (CH2)i6CH3 )_ AAHDFVEWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0155] 化合物23(涉及SEQ ID NO :23):
[0156] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys_Ala-Ala-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-CO (CH2)i4CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu_Arg-Ala-NH2
[0157] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-CO(CH2) 14CH3)-EFIEWLLRA-NH2
[0158] 化合物24(涉及SEQ ID NO:24):
[0159] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys_Ala-Ala-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-CO (CH2)i6CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu_Arg-Ala-NH2
[0160] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-CO(CH2)leCHs)-EFIEWLLRA-NH2
[0161] 化合物25(涉及SEQ ID NO :25):
[0162] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-CO(CH2)i6CH3)-Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu_Arg-Ala-NH 2
[0163] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDS-K(PEG2-PEG2- γ Glu-CO(CH2)leCHs)-AAHDFVEWLLRA-NH2
[0164] 化合物26(涉及SEQ ID NO:26):
[0165] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-yGlu-CO(CH2)i6C〇2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn- Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0166] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ G1u-C0(CH2)i6C02H)-EFIEWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0167] 化合物27(涉及SEQ ID NO :27):
[0168] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys(PEG2-PEG2-yGlu-CO(CH2)i4C〇2H)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0169] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4C02H)-EFIEWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0170] 化合物28(涉及SEQ ID NO:28):
[0171 ] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys_Ala-Ala-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-C0(CH2)i6CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu_Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0172] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0 ( CH2) leCHs)-EFIEWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0173] 化合物29(涉及SEQ ID NO:29):
[0174] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys_Ala-Ala-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu_Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0175] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLDEKAA-K(PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-EFIEWLLNGGPSSGAPPPS-NH2
[0176] 化合物30(涉及SEQ ID NO:30):
[0177] Hi s- (D-Ser) -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Ly s (PEG2-PEG2-CO( CH2) 16CO2H) -S er-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0178] H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6C〇2H)-SKYLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0179] 化合物31(涉及SEQ ID NO:31):
[0180] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-C0(CH2)i4CH 3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0181] H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-C0(CH2)i4CH3)-SKYLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0182] 化合物32(涉及SEQ ID NO:32):
[0183] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6CH 3)-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0184] H-(d-S)-QGTFTSD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6CH3)-SKYLD-Aib-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0185] 化合物33(涉及SEQ ID NO :33):
[0186] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Lys(PEG2 -PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met_Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0187] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-Aib-K(PEG2-PEG2- γ G1 u-CO ( CH2) 14CH3)-RAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0188] 化合物34(涉及SEQ ID NO:34):
[0189] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2-yGlu-⑶（CH 2)i6 ⑶ 2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
[0190] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2 - γ G 1 u-CO ( CH2) i6C02H )-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0191] 化合物35(涉及SEQ ID NO :35):
[0192] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2-CO(CH2)i6C〇2H)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0193] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-CO(CH2)i6C〇2H)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0194] 化合物36(涉及SEQ ID NO:36):
[0195] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i6CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0196] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2-yGlu-CO(CH2)i6CH 3)-RRAQDFVQWLMNTGGPSSGAPPPS-NH2
[0197] 化合物37(涉及SEQ ID NO :37):
[0198] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-NIe-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0199] H-(d-S)-QGTFTSDYSKYLD-K(PEG2-PEG2- γ Glu-⑶（CH2)i4CH3)-RRAQDFVQWL-NIe-NTGGPSSGAPPPS-NH2
[0200] 在上述序列中，Lys的修飾結(jié)構(gòu)可以是：

[0205] 本發(fā)明中所用縮寫具體含義如下：
[0206] Boc為叔丁氧羰基，F(xiàn)moc為荷甲氧羰基，t_Bu為叔丁基，ivDDe為1_(4,4-二甲基-2， 6_二氧代亞環(huán)己基)-3-甲基-丁基的脫除與親脂取代基，resin為樹脂，TFA為三氟乙酸，EDT 為1，2-乙二硫醇，Phenol為苯酚，F(xiàn)BS為胎牛血清，BSA為牛血清白蛋白，HPLC為高效液相， GLP-1R為胰高血糖素樣肽1受體，GCGR為胰高血糖素受體，GLP-1為胰高血糖素樣肽，mPEG為 單甲氧基聚乙稀二醇，0ΧΜ為胃泌酸調(diào)節(jié)素，His為組氨酸，Ser為絲氨酸，D-Ser為D-型絲氨 酸，Gin為谷氨酰胺，Gly為甘氨酸，Glu為谷氨酸，Ala為丙氨酸，Thr為蘇氨酸，Lys為賴氨酸， Arg為精氨酸，Tyr為酪氨酸，Asp為天冬氨酸，Trp為色氨酸，Phe為苯丙氨酸，lie為異亮氨 酸，Leu為亮氨酸，Cys為半胱氨酸，Pro為脯氨酸，Val為纈氨酸，Met為蛋氨酸，Asn為天冬酰 胺，HomoLys為高賴氨酸，Orn為鳥氨酸，Dap為二氨基庚二酸，Dab為2，4-二氨基丁酸，NIe為 正亮氨酸，Aib為2-氨基異丁酸。
【附圖說明】
[0207] 圖1為顯示通過將化合物2、6和22施用于CC14誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠后的肝組織切 片的免疫組化染色結(jié)果。
[0208] 圖2為顯示通過將化合物2、6和22施用于CC14誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠，采用天狼猩紅 染色面積反應(yīng)肝纖維化嚴(yán)重程度變化的圖（###:表示注射CC1 4與只注射橄欖油組相比在 99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著升高；:表示與注射CC14組相比在99.9 %置信度內(nèi)（p〈 0.001)顯著降低）；*:表示與注射0：14組相比在95%置信度內(nèi)（？〈0.05)顯著降低）。
[0209] 圖3為顯示通過將化合物2、6和22施用于CC14誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠而引起的血清 ALT變化的圖（###:表示注射CC14與只注射橄欖油組相比在99.9 %置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著 升高;**:表示與注射CC14組相比在99%置信度內(nèi)（p〈0.01)顯著降低;*:表示與注射CC14組 相比在95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著降低）。
[0210] 圖4為顯示通過將化合物2和6或Liraglutide施用于高脂肪膳食誘導(dǎo)的高脂血癥 小鼠而引起的體重變化的圖（###:表示與普通膳食組相比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯 著升高;##:表示與普通膳食組相比在99%置信度內(nèi)（p〈0.01)顯著升高;***:表示與高脂肪 膳食組相比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著降低;**:表示與高脂肪膳食組相比在99%置 信度內(nèi)（P〈〇.01)顯著降低;表示與高脂肪膳食組相比在95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著降 低)。
[0211]圖5為顯示通過將化合物2和6或Liraglutide施用于高脂肪膳食誘導(dǎo)的高脂血癥 小鼠的肝組織切片的免疫組化染色結(jié)果。
[0212]圖6為顯示通過將化合物2和6或Liraglutide施用于高脂肪膳食誘導(dǎo)的高脂血癥 小鼠而引起的由天狼猩紅染色顯示的纖維化結(jié)節(jié)面積變化的圖（###:表示與普通膳食組相 比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著升高;***:表示與高脂肪膳食組相比在99.9%置信度 內(nèi)（p〈0.001)顯著降低;表示與高脂肪膳食組相比在95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著降低）。 [0213]圖7為顯示通過將化合物2和6或Liraglutide施用于高脂肪膳食誘導(dǎo)的高脂血癥 小鼠而引起的由油紅〇(〇il Red 0)染色顯示的肝臟脂質(zhì)沉積面積變化的圖（###:表示與普 通膳食組相比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著升高；***:表示與高脂肪膳食組相比在 99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著降低；林：表示與高脂肪膳食組相比在99%置信度內(nèi)（p〈 0.01)顯著降低;*:表示與高脂肪膳食組相比在95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著降低）。
[0214]圖8為顯示通過將化合物2和6或Liraglutide施用于高脂肪膳食誘導(dǎo)的高脂血癥 小鼠而引起的肝臟甘油三酯TG變化的圖（###:表示與普通膳食組相比在99.9%置信度內(nèi)（p 〈0.001)顯著升高；***:表示與高脂肪膳食組相比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著降 低;**:表示與高脂肪膳食組相比在99%置信度內(nèi)（p〈0.01)顯著降低;*:表示與高脂肪膳食 組相比在95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著降低）。
[0215] 圖9為顯示通過將化合物2和6施用于db/db小鼠而引起的血清中糖化血紅蛋白 (HbAlc)變化的圖（林:表示與對(duì)照組相比在99%置信度內(nèi)（p〈0.01)顯著降低）。
[0216] 圖10為顯示通過將化合物2和6施用于db/db小鼠而引起的血清中胰島素（INS)變 化的圖表示與對(duì)照組相比在99%置信度內(nèi)（p〈0.01)顯著升高;表示與對(duì)照組相比在 95%置信度內(nèi)（p〈0.05)顯著升高）。
[0217]圖11為顯示通過將化合物2和6施用于db/db小鼠而引起的血清中甘油三酯（TG) 變化的圖表示與對(duì)照組相比在99.9%置信度內(nèi)（p〈0.001)顯著降低。
[0218]圖12為顯示通過將化合物2和6施用于db/dM、鼠而引起的血清中總膽固醇(TC)變 化的圖（#*:表示與對(duì)照組相比在的"^置信度內(nèi)化⑶"仍彡顯著降低）。
[0219] 圖13為肝組織切片的免疫組化染色圖，示出通過將化合物2和6施用于db/db小鼠 而引起的肝組織脂肪樣空泡變性和脂肪炎癥變化。
[0220] 圖14為胰腺組織切片的免疫組化染色圖，示出通過將化合物2和6施用于db/db小 鼠而引起的胰腺組織中胰島變化。
[0221] 圖15為心、肺、脾組織切片的免疫組化染色圖，示出通過將化合物2和6施用于db/ db小鼠并未引起心、肺、脾組織學(xué)變化。 圖16示意性示出本申請(qǐng)的橋接基團(tuán)的示例性的連接方式。
【具體實(shí)施方式】
[0222] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。除非另有說明，否則所用試劑或儀器均可 以通過市購獲得。
[0223] 實(shí)施例1、多肽化合物的合成
[0224] 材料：
[0225] 所有的氨基酸購自NovaBiochem公司。如果沒有特別說明，其他所有試劑均為分析 純，購自Sigma公司。米用Protein Technologies PRELUDE 6通道多肽合成儀。Phenomenex Luna C18制備柱(46mm X 250mm)用來純化多肽。高效液相色譜儀為Waters公司產(chǎn)品。質(zhì)譜 分析采用Agilent質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。
[0226] 以多肽化合物6為例說明本發(fā)明多肽化合物的合成方法：
[0227] 結(jié)構(gòu)序列：
[0228] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0229] a)主肽鏈組裝：
[0230] 按照Fmoc/t-Bu策略在CS336X多肽合成儀（美國CS Bio公司）上合成0.25mmol規(guī) 模的如下多肽：
[0231 ] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe~Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp(0tBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t~Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (ivDde)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser(t_Bu)-rink amide樹脂
[0232] (1)第一步：將0.75克Rink amide MBHA-LL樹脂（Novabiochem，上樣0.34mmol/g) 在二氯甲烷(DCM)中溶脹一個(gè)小時(shí)，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂3次；
[0233] (2)第二步：以Rink amide樹脂為載體，以偶聯(lián)劑由6-氯苯并三氮唑-1，1，3,3-四 甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)，有機(jī)堿N，N-二異丙基乙胺(DIEPA)兩者按物質(zhì)的量比1:1，以N， N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接
[0234] Fmoc-Ser(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Pr〇-〇H(3x)，F(xiàn)moc-Ala-〇H，F(xiàn)moc-Gly-〇H，F(xiàn)moc-Ser(t-Bu)-〇H(2x)，F(xiàn)moc-Pr〇-OH，F(xiàn)moc-Gly_0H(2x)，F(xiàn)moc_Thr(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc_Asn(Trt)-〇H， Fmoc-Met-〇H，F(xiàn)moc-Leu-〇H，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Val-〇H，F(xiàn)moc-Phe-〇H，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-〇H，F(xiàn)moc-Ala-〇H，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-〇H(2x)， Fmoc_Lys(ivDde)-〇H，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Leu-〇H，F(xiàn)moc-Tyr(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc_Lys (Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Ser(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Tyr(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Ser(t_ Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Thr(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Phe-〇H，Thr(t-Bu)-〇H，F(xiàn)moc-Gly-〇H，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-D-Ser(t-Bu)-OH，Boc-His(Boc)-OH 得到：
[0235] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(0tBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe~Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp(0tBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t~Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (ivDde)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-P r〇-Ser(t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)，甲 醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂各3次。
[0236] 在反應(yīng)中，1)第一個(gè)氨基酸Fm〇C-Ser(t-Bu)-OH的用量與樹脂用量的物質(zhì)的量比 為1:1~6:1;2)接下來的每次縮合反應(yīng)中Fmoc保護(hù)氨基酸，6-氯苯并三氮唑-1，1，3,3-四甲 基脲六氟磷酸酯(HCTU)，有機(jī)堿N，N-二異丙基乙胺(DIEPA)的用量均過量2~8倍，反應(yīng)時(shí)間 為1~5個(gè)小時(shí)。
[0237] b)l-(4,4_二甲基-2,6_二氧代亞環(huán)己基)-3_甲基-丁基（ivDde)的脫除與親脂取 代基的引入：
[0238] 用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(DCM) = 1:1(體積比）的溶液中將樹脂洗滌 兩次，加入新鮮制備的3.0%的肼水合物N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，將該反應(yīng)混合物在 室溫下振蕩10~30分鐘進(jìn)行阱處理步驟，然后過濾。將肼處理步驟重復(fù)5次得到：
[0239] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(0tBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe~Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys-Arg (Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gin(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn (Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser(t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲烷（DCM)，甲醇 (Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂各3次。
[0240]加入FmocNH-PEG2_0H(Quanta BioDesign)，2-(7_偶氮苯并三氮唑）-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，二異丙基乙基胺(DIEPA)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合偶聯(lián) 液(均過量5倍），振蕩2小時(shí)后，過濾。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷(DCM)， 甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂各3次得到：
[0241 ] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (Fmoc-PEG2)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gin(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gin(Trt)-Trp (Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Se;r(t-Bu)-;rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲燒 (DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂各3次。
[0242] 20 %的哌啶（P i p er i d i ne) /N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脫除Fmo c基團(tuán)（30分鐘， 重復(fù)脫除兩次），加入Fmoc-PEG2-OH，2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷 酸酯(HATU)，二異丙基乙基胺(DIEPA)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合偶聯(lián)液(均過量5倍）， 進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)得到
[0243] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (Fmoc-PEG2-PEG2)-Arg(Pbf )-Arg(Pbf)-Ala-Gin (Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln( Trt)-Trp (Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Se;r(t-Bu)-;rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲燒 (DCM)，甲醇(Methanol)，二氯甲烷(DCM)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)充分洗滌樹脂各3次。 [0244] 20%的哌啶(Piperidine)/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脫除Fmoc基團(tuán)（30分鐘， 重復(fù)脫除兩次），然后按照常規(guī)條件依次偶聯(lián)Fmoc-yGlu-OtBu，加入十六酸(棕櫚酸)得到：
[0245] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-GIn (OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe~Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (PEG2-PEG2-C16)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gin(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp (Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Se;r(t-Bu)-;rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲燒 (DCM)，甲醇(Methanol )，二氯甲烷(DCM)充分洗滌樹脂各3次后，真空抽干。
[0246] c)多肽全保護(hù)的脫除：
[0247] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-GIn (OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe~Thr(t-Bu)-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu)-Lys (PEG2-PEG2-C16)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gin(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp (Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pr〇-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pr〇-Pro-Pro-Ser(t_Bu)-rink amide樹脂加入切割液TFA/Phenol/thioanisole/EDT/H2〇 (82.5:5:5:2.5:5，體積比）中，升溫，控制裂解液溫度25°C，反應(yīng)2.5小時(shí)。過濾，濾餅用少量 裂解液洗滌3次，合并濾液。濾液在攪拌下緩慢倒入冰乙醚中。靜置2小時(shí)以上，待沉淀完全， 離心，用冰乙醚洗滌沉淀3次，得到粗品化合物：
[0248] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Lys (PEG2-PEG2- γ Glu-C0(CH2)i4CH3)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0249] d)多肽化合物的精制純化：
[0250] 將所得粗品化合物溶于乙腈(40幻/!12〇=1:2(體積比）的溶液中，通過5.〇1111]1反相 C18填充的46mm X 250mm柱上進(jìn)行制備型HPLC純化。用30%乙腈（含0.05%三氟乙酸）/H20 (含0.05%三氟乙酸）為起始，以梯度（1.33%/min的速度增加乙腈的比例），流速為15mL/ min將該柱洗脫30分鐘，收集含有肽的組分，冷凍抽干，得到HPLC純度大于95 %的純品。用液 質(zhì)聯(lián)用分析分離出的產(chǎn)物。
[0251] 基于以上合成步驟，合成本發(fā)明的如下多肽化合物(表1):
[0252] 表1、本發(fā)明實(shí)施例中所合成的多肽化合物結(jié)構(gòu)：





[0259]
[0260] 實(shí)施例2、GLP_1R/GCGR雙激動(dòng)劑多肽對(duì)肝纖維化的體外抑制效應(yīng)
[0261] 選用人肝星狀細(xì)胞株LX-2,研究并觀察不同劑量受試物對(duì)LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)量的影響。
[0262] 將人肝星狀細(xì)胞LX-2鋪板于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用DMEM(高糖) + 10%FBS+l%雙抗培 養(yǎng)基(Thermo Fi sher)進(jìn)行培養(yǎng)，在37 °C，5 % C〇2條件下待細(xì)胞生長至70 %匯合時(shí)無血清過 夜，翌日早上，用上述化合物1-37(溶于PBS)處理48小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot，以β-actin為內(nèi)參，以Image J 1.50i灰度分析α-SM和β-actin的表達(dá)量。陰性對(duì)照僅 加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的PBS。
[0263] 采用0 . ΙμΜ、1μΜ、5μΜ的化合物2、5、16、19進(jìn)行處理，可見它們?cè)谒袧舛认拢?夠降低α-SM的表達(dá)，并有一定的量-效關(guān)系;而陰性對(duì)照對(duì)α-SM的表達(dá)沒有影響(表2)。
[0264] 下表2中示出選用ΙμΜ濃度的本發(fā)明的化合物1-37進(jìn)行肝纖維化體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。以陰性對(duì)照組中a-SMA/i3-a Ctin的整合灰度為100%，分析受試多肽的肝纖維化體外抑 制活性。
[0267]
[0268] 由以上表2可見，本發(fā)明的雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑多肽化合物1-37均顯示出優(yōu)異的體外抑 制LX-2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)。其中化合物2、5、6、16、19、20、35、36降低α-SMA的相對(duì)表 達(dá)的效果最為明顯。
[0269]實(shí)施例3、GLP-1R/GCGR雙激動(dòng)劑多肽對(duì)CC14誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的改善治療作用 [0270] SPF級(jí)健康C57小鼠，6~8周齡，體重20~25g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并在廣 東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。C57小鼠分為對(duì)照組、肝纖維化模型組和治 療組，每組各8只。將小鼠腹腔注射20 %CCl4(2mL/kg，用橄欖油1:4稀釋），每周2次，持續(xù)6 周，形成穩(wěn)定的肝纖維化動(dòng)物模型。治療組，同時(shí)分別以500yg/kg體重皮下注射化合物2、6 和22之一，隔天一次，持續(xù)6周。對(duì)照組等體積、等頻率給予橄欖油，直至6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)停止 給藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉小鼠，收集血清和肝臟標(biāo)本。肝臟用10%的福爾馬林固定，石蠟包 埋。
[0271] 小鼠經(jīng)CC14誘導(dǎo)6周后，HE染色顯示肝臟肝細(xì)胞損傷和炎性浸潤特別顯著，天狼猩 紅(Sirius Red)染色顯示肝臟形成顯著的纖維化結(jié)節(jié)和假小葉（圖1)。化合物2、6和22顯著 改善CC14誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷和纖維化程度（圖1，圖2)。同時(shí)，化合物2、6和22可以顯著降低 肝纖維化小鼠血清ALT水平（圖3)。
[0272]結(jié)果顯示:不同體外活性的化合物均能顯著改善CC14誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷和纖維化 程度，同時(shí)也能顯著降低肝纖維化小鼠血清ALT水平。
[0273]實(shí)施例4、GLP_1R/GCGR雙激動(dòng)劑多肽對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝和高脂血 癥的改善作用
[0274] SPF級(jí)健康C57小鼠，6~8周齡，體重20~25g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并在廣 東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。C57小鼠分為對(duì)照組、肝纖維化模型組和治 療組，每組各8只。小鼠喂以高脂飼料(HFD)12周，治療組，同時(shí)分別以500yg/kg體重皮下注 射化合物2和6隔天一次，持續(xù)12周。對(duì)照組等體積、等頻率給予PBS。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉小鼠， 收集血清和肝臟標(biāo)本。
[0275] 化合物6和2均能有效抑制高脂ΗΠ)引起的小鼠體重增加，且化合物6控制體重的 效果最為明顯。另外，化合物2與利拉魯肽對(duì)體重控制的效果相當(dāng)（圖4)。肝組織切片結(jié)果表 明，化合物6和2能夠抑制肝臟脂肪樣變性和非酒精性脂肪肝炎，同時(shí)可以有效抑制脂肪肝 合并的肝纖維化（圖5和圖6)?；衔?和2能夠有效降低小鼠肝臟脂質(zhì)沉積（圖7)和肝臟甘 油三酯TG的含量（圖8)，并且兩者的治療效果明顯優(yōu)于Liraglutide，提示化合物6和2對(duì)非 酒精性脂肪肝炎合并纖維化、高脂血癥具有較好的體內(nèi)活性。
[0276]以上結(jié)果表明：作為GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑的化合物6和2具有顯著預(yù)防和治 療高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝病的合并肝纖維化的效果。
[0277]實(shí)施例5、GLP_1R/GCGR雙激動(dòng)劑多肽對(duì)糖尿病小鼠糖脂代謝的影響 [0278]將12周齡的db/db糖尿病肥胖小鼠按血糖隨機(jī)分成3組(分組前禁食12小時(shí)），每組 6只。各組小鼠均按10yg/只進(jìn)行皮下注射給藥，其中空白組皮下注射等體積的PBS溶液，各 組給藥體積均為0.25ml/只，隔日單次給藥（間隔48小時(shí)），持續(xù)18天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠眼眶 靜脈叢取血，測(cè)量小鼠血清中糖化血紅蛋白（HbAlc)、胰島素（INS)、甘油三酯(TG)和總膽固 醇（TC)水平。同時(shí)取小鼠肝、胰、心、肺、脾等進(jìn)行HE病理染色。使用軟件GraphPad Prismversion6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0279]與空白糖尿病小鼠組相比，化合物2和6顯著降低db/db糖尿病小鼠糖化血紅蛋白 HbAlc水平，上調(diào)胰島素 INS水平，提示化合物2和6可通過促進(jìn)胰島分泌胰島素來達(dá)到降糖 作用。此外，化合物2和6可以顯著抑制db/db糖尿病小鼠甘油三酯（TG)和總膽固醇（TC)水 平，提示化合物2和6具有顯著的降脂效果。并且化合物6的糖脂代謝改善的效果更優(yōu)（圖8-12)〇
[0280]組織切片結(jié)果表明，空白PBS治療的糖尿病小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪樣空泡變性 和脂肪炎癥，而化合物2和6均能顯著抑制糖尿病小鼠肝臟脂肪樣變性和脂肪炎癥，尤其化 合物6抑制效果更佳(圖13)。
[0281]另外，空白糖尿病小鼠胰腺組織中胰島明顯萎縮，而化合物2和6均能顯著改善糖 尿病小鼠胰島的萎縮病變(圖14)。
[0282] 圖15顯示空白組和給藥組的糖尿病小鼠心臟、肺臟和脾臟均未見明顯的病理改 變，表明化合物2和6在治療劑量下皮下注射具有可靠的安全性。
[0283] 以上以實(shí)例方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，盡管未示出，但本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)的所有 多肽均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以本發(fā)明進(jìn)行修改和變形，只要 不脫離本發(fā)明的精神，均落入本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. GLP-1R/GCGR雙激動(dòng)劑多肽在制備用于預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝病、高脂血癥和 動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用，所述多肽具有以下氨基酸序列表示的母體肽： His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal〇-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xaal6-Xaal7 _Xaal8_Ala_Xaa20_Xaa21_Phe _Xaa23_Xaa24_Trp_Leu_Xaa27 _Xaa28_Xaa29_Xaa30_ Xaa31_Xaa32_Xaa33_Xaa34_Xaa35 _Xaa36_Xaa37_Xaa38_Xaa39 _Xaa40_C0Ri 其中，Ri = -NH2 或-OH; Xaa2=Aib，Ser或D_Ser; Xaa10 = Ly s 或Tyr; Xaal3 = Lys或Tyr; Xaal6 = Ser，Aib，Lys 或 Glu; Xaal7 = Lys或Arg; Xaal8=Arg 或 Ala; Xaa20 = His，Gln 或 Lys; Xaa21 =Asp 或 Glu; }(&&23 = 116，1^11或\^1; Xaa24 = Glu 或 Gin; Xaa27=Met，Leu，NIe 或不存在； Xaa28 = Ser，Asp，Asn，Arg 或不存在； Xaa29=Ala，Gly，Thr 或不存在； Xaa30 = Gly或不存在； Xaa31 =Gly或不存在； Xaa32 = Pro或不存在； Xaa33 = Ser或不存在； Xaa34 = Ser或不存在； Xaa35 = Gly或不存在； Xaa36=Ala或不存在； Xaa37 = Pro或不存在； Xaa38 = Pro或不存在； Xaa39 = Pro或不存在； Xaa40 = Ser或不存在； 其中，XaalO，Xaal6，Xaal7或Xaa20中至少一個(gè)為Lys，所述至少一個(gè)Lys或所述序列的 第12位Lys的側(cè)鏈與親脂性的取代基相連，連接方式為所述親脂性的取代基以其羧基與一 個(gè)橋接基團(tuán)的氨基形成酰胺鍵，橋接基團(tuán)的氨基酸殘基的羧基與母體肽的Lys的N-末端殘 基上形成一個(gè)酰胺鍵連接到母體肽上，所述橋接基團(tuán)為Glu，Asp和/或(PEG) m，其中m為2-10 的整數(shù);所述親脂性取代基為選自CH3(CH2) nC〇-或H00C(CH2)nC0-的?；?，其中n是10-24的整 數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述橋接基團(tuán)為 (PEG)m〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述橋接基團(tuán)在所述氨基酸序列的殘基對(duì) 12與16、16與20、17與21或者20與24側(cè)鏈之間形成分子橋。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于與所述親脂性取代基連接的Lys被HomoLys、 Orn、Dap或Dab代替。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述母體肽的氨基酸序列為：11^4&&2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal〇-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xaal6-Xaal7-Xaal8-Ala _Xaa20_Xaa21_Phe_Xaa23_Xaa24 _Trp_Leu_Xaa27_Xaa28_Xaa29 _Xaa30_Xaa31_Xaa32_ Xaa33_Xaa34_Xaa35_Xaa36_Xaa37 _Xaa38_Xaa39_Xaa40_C0Ri 其中，Ri = -NH2; Xaa2=Aib或D_Ser; Xaa10 = Ly s 或Tyr; Xaal3 = Lys或Tyr; Xaal6 = Ser，Aib，Glu或Lys; Xaal7 = Lys或Arg; Xaal8=Arg 或 Ala; Xaa20 = His，Gln 或 Lys; Xaa21 =Asp 或 Glu; Xaa23 = IIe?Val ； Xaa24 = Glu 或 Gin; Xaa27=Met，Leu 或 NIe; Xaa28=Asn，Asp，Arg 或不存在； Xaa29 = Gly，Thr 或不存在； Xaa30 = Gly或不存在； Xaa31 =Gly或不存在； Xaa32 = Pro或不存在； Xaa33 = Ser或不存在； Xaa34 = Ser或不存在； Xaa35 = Gly或不存在； Xaa36=Ala或不存在； Xaa37 = Pro或不存在； Xaa38 = Pro或不存在； Xaa39 = Pro或不存在； Xaa40 = Ser或不存在。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)所述氨基酸序列的第10、12、 16、17或20位為Lys時(shí)，與所述Lys側(cè)鏈連接的親脂性取代基為下述結(jié)構(gòu)之一：7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述母體肽的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID N0:9，SEQ ID N0:10，SEQ ID N0:11，SEQ ID N0:12，SEQ ID N0:13，SEQ 10^):14,5￡〇10^):15,5已〇10^):16,5￡〇10^):17和5￡〇10^):18,5￡〇10^):19， SEQ ID N0:20，SEQ ID N0:21，SEQ ID N0:22，SEQ ID N0:23，SEQ ID N0:24，SEQ ID NO: 25，SEQ ID N0:26，SEQ ID N0:27，SEQ ID N0:28，SEQ ID N0:29，SEQ ID N0:30，SEQ ID N0:31，SEQ ID N0:32，SEQ ID N0:33，SEQ ID N0:34，SEQ ID N0:35，SEQ ID N0:36和SEQ ID N0:37〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精性脂肪樣變性、 非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝纖維化合并的肝硬化。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述動(dòng)脈硬化包括動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK106046145SQ201610255395
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】蔣先興, 王銳
【申請(qǐng)人】深圳市圖微安創(chuàng)科技開發(fā)有限公司