用于治療代謝障礙、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝疾病和動脈粥樣硬化的新的膽固醇代謝物5 ...的制作方法
【專利摘要】已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5?膽甾烯?3β,25?二醇二硫酸酯(25HCDS)是可靠的PPARγ激動劑和LXR拮抗劑，并且被用于治療脂質障礙和炎性疾病，包括但不限于脂肪肝、炎性腸病和動脈粥樣硬化性疾病。
【專利說明】用于治療代謝障礙、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝疾病和動脈粥 樣硬化的新的膽固醇代謝物5-膽甾烯-3β, 25-二醇二硫酸酯 (25HCDS)
[00011 本申請是申請日為2013年3月15日、申請?zhí)枮?01380019476.3、發(fā)明名稱為"用于 治療代謝障礙、高脂血癥、糖尿病、脂肪肝疾病和動脈粥樣硬化的新的膽固醇代謝物5-膽甾 烯-3β，25-二醇二硫酸酯(25HCDS)"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求2012年4月12日提交的美國臨時專利申請61/623,203和61/623,414的 權益。兩篇臨時申請的完整內(nèi)容特此通過引用并入。
技術領域
[0004] 本發(fā)明一般地涉及一種新的膽固醇代謝物5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯（5_ cholesten-30，25_diol，disulfate) (25HCDS)及其用途。具體地，本發(fā)明提供了用于預防和 治療疾病諸如脂質代謝障礙（lipid metabolic disorder)和炎癥性障礙例如高脂血癥、糖 尿病、脂肪肝疾病和動脈粥樣硬化的25HCDS。
【背景技術】
[0005] 肝在脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持中起關鍵作用。脂質在肝組織中的積累會導致非酒精性 脂肪肝疾病(NAFLDhNAFLD影響一般美國群體的幾乎1/4,且可以進展成顯著的肝硬化和肝 細胞癌。NAFLD的范圍包括從簡單的非進行性皮脂腺病至導致肝硬化和肝細胞癌的進行性 非酒精性脂肪性肝炎(NASH) JAFLD的發(fā)病機制被視作兩步過程。第一步是甘油三酯和有關 的脂質在肝細胞中的積累。第二步是肝炎的發(fā)生。NAFLD的標志特征以增加的肝內(nèi)甘油三酯 積累為特征。降低脂質水平是成功的NAFLD治療的一個重要要素。在哺乳動物中，留醇調(diào)節(jié) 元件-結合蛋白-lc(SREBP-lc)優(yōu)先控制脂肪生成的基因表達;并調(diào)節(jié)脂肪酸和甘油三酯體 內(nèi)穩(wěn)態(tài)。適當?shù)赜涊d了它在脂肪酸生物合成和脂肪肝病的發(fā)展中的作用。但是，目前沒有經(jīng) 批準的NAFLD治療。
[0006] 氧化固醇(oxysterol)可以作用于膽固醇體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和脂質代謝中的多個點。氧化 固醇受體LXR是留醇調(diào)節(jié)的脂質代謝的轉錄因子。LXR的活化會通過ABCA1和ABCG5/8刺激膽 固醇流出和清除的表達，但是它也會增量調(diào)節(jié)SREBP-lc的表達，所述SREBP-lc又調(diào)節(jié)在脂 質生物合成和運輸中涉及的至少32個基因。因此，盡管合成的配體對LXR的活化可以降低血 清膽固醇水平以保護免于動脈粥樣硬化，但是由于通過SREBP-lc的活化而誘導脂肪酸和甘 油三酯合成，活化也會導致脂肪肝和高甘油三酯血癥。肝細胞具有有限的儲存甘油三酯形 式的脂肪酸的能力。一旦該能力被壓倒，就會發(fā)生細胞損傷。過量的細胞內(nèi)游離脂肪酸會觸 發(fā)活性氧類別(R0S)的產(chǎn)生，從而造成脂毒性和炎癥性信號傳遞途徑的活化，這最終導致細 胞凋亡。
[0007] 5-膽留烯-3β，25-二醇3-硫酸酯（25HC3S)是最近在原代大鼠肝細胞核中鑒別出的 氧化固醇。25HCDS公開在W0 2006/047022中。該氧化固醇可以由留醇磺基轉移酶SULT2Blb 從25-羥基膽留醇(25HC)通過氧化固醇硫酸化而合成。類似的膽固醇代謝物5-膽留烯-3β， 25-二醇3β-硫酸酯（25H03S)的外源施用會減少SREBP-1和SREBP-2表達；阻斷SREBP-lc加 工；和抑制在脂質代謝中涉及的關鍵酶（包括乙酰輔酶A羧化酶-l(ACC-l)、脂肪酸合酶 (FAS)和3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A還原酶(HMGR))的表達，隨后降低中性脂質和膽固醇 水平。
[0008] 結果指示，25HC3S會充當LXR拮抗劑和膽固醇飽滿信號，從而經(jīng)由LXR/SREBP信號 傳遞的抑制而抑制脂肪酸和甘油三酯合成途徑。此外，25HC3S會增加 ΙκΒβ表達;阻斷TNFa誘 導的ΙκΒβ降解;和降低細胞核NFkB水平。相比而言，25HC以相反方式起作用，從而誘導ΙκΒβ 降解和細胞核NFkB積累。這些結果指示，25HC3S也涉入炎癥應答，并且可能代表炎癥性途徑 和脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)之間的聯(lián)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 現(xiàn)在已經(jīng)鑒別出另一種調(diào)節(jié)性的膽固醇代謝物5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯 USHCDShSSHCDS的研究指示，該天然存在的代謝物的降低表達在肝細胞和巨噬細胞的脂 質積累和細胞損傷中起重要作用，由此促進代謝障礙的發(fā)病機制。25HCDS向肝細胞和巨噬 細胞的培養(yǎng)基中的添加會降低甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（SREBP)的mRNA水平，抑制SREBP加 工，并隨后下調(diào)在脂質生物合成中涉及的關鍵酶，從而導致肝細胞和巨噬細胞中降低的細 胞內(nèi)脂質水平。25HCDS也會增加過氧化物酶體增殖活化劑受體(PPAR)IkB的表達和過氧化 物酶體增殖活化劑受體共活化劑la(PGC_la) mRNA水平，降低細胞核NFkB水平，并降低促炎 細胞因子表達和分泌。重要的是，體內(nèi)研究表明，25HCDS施用會使肝中性脂質減少約20-35%，而不表現(xiàn)出毒性。
[0010]因而，新發(fā)現(xiàn)的膽固醇代謝物25HCDS作為可靠的PPAR γ激動劑和LXR拮抗劑起作 用，其除了經(jīng)由PPARy/IkB/NFkB信號傳遞途徑抑制炎癥應答以外，還在體外和在體內(nèi)抑制 肝細胞和巨噬細胞中的膽固醇和脂質生物合成。25HCDS(其已經(jīng)如在本文實施例部分中所 述化學合成）因而可以用作用于治療和預防脂質代謝的和炎癥性障礙(包括高脂血癥、動脈 粥樣硬化、糖尿病、脂肪肝疾病等)的藥物。
[0011] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在下面的發(fā)明描述中闡述，且將從所述描述部分地顯 而易見，或者可以通過本發(fā)明的實踐來獲知。本發(fā)明將由在書面描述及其權利要求中具體 指出的組合物和方法實現(xiàn)和達到。
[0012] 在一個方面，本發(fā)明提供了化合物作為藥物的用途，所述化合物是：（i)下式的5-膽甾烯-3β，25-二醇二硫酸酯(25HCDS)和/或其藥學上可接受的鹽
[0013] mu3^u ， '
6
[0014] 在某些方面，所述化合物是
[0015]
[0016] 在某些方面，本發(fā)明提供了所述化合物在以下方法中的用途:在有此需要的受試 者中減少脂質的方法;在有此需要的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成的方法;在有此 需要的受試者中減少炎癥的方法;在有此需要的受試者中治療糖尿病的方法;在有此需要 的受試者中治療高脂血癥的方法;在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化的方法;在有 此需要的受試者中治療脂肪肝病的方法;和/或在有此需要的受試者中治療炎性疾病的方 法。在其它方面，本發(fā)明提供了以下化合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于在有此需要 的受試者中減少脂質；在有此需要的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成;在有此需要的 受試者中減少炎癥;在有此需要的受試者中治療糖尿病;在有此需要的受試者中治療高脂 血癥;在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化;在有此需要的受試者中治療脂肪肝病;或 在有此需要的受試者中治療炎性疾病
[0020] 在其它方面，本發(fā)明提供了治療受試者的方法，所述方法包括:給所述受試者施用 有效量的化合物
[0021] ? · - -
[0022] 或者
[0023]
[0024] 其中所述方法選自：在有此需要的受試者中減少脂質的方法;在有此需要的受試 者中減少膽固醇和脂質生物合成的方法;在有此需要的受試者中減少炎癥的方法;在有此 需要的受試者中治療糖尿病的方法;在有此需要的受試者中治療高脂血癥的方法;在有此 需要的受試者中治療動脈粥樣硬化的方法;在有此需要的受試者中治療脂肪肝病的方法； 和在有此需要的受試者中治療炎性疾病的方法。在某些方面，基于所述受試者的體重，以在 0. lmg/kg至100mg/kg范圍內(nèi)的量施用所述化合物，或者基于所述受試者的體重，以在lmg/ kg至10mg/kg范圍內(nèi)的量施用所述化合物;和/或所述施用包括以下的至少一種：口服施用、 腸施用、舌下施用、透皮施用、靜脈內(nèi)施用、腹膜施用、胃腸外施用、注射施用、皮下注射和肌 肉內(nèi)注射。
[0025]在一個方面，本發(fā)明提供了一種化合物，其為（i)下式的5-膽留烯-3β，25_二醇二 硫酸酯(25HCDS)和/或其藥學上可接受的鹽。
[0026]
[0027] 在一個方面，提供了化合物本身和其藥學上可接受的鹽。在另一個方面，提供了化 合物及其藥學上可接受的鹽作為藥物的用途。
[0028] 在某些方面，所述化合物是
[0029 ^
θ
[0030] 在某些方面，所述化合物是分離的化合物。在其它方面，所述化合物是基本上純 的。在其它方面，所述化合物是呈固體形式。所述固體形式可以是呈散劑形式和/或冷凍干 燥形式。
[0031] 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含（i)為下式的5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯 (25HCDS)的化合物和（i i)生理學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
[0032]
[0033] 在某些方面，所述化合物是
[0034]
[0035] 在某些方面，將所述藥物組合物配制成單位劑型。在其它方面，所述藥物組合物是 呈固體形式。所述組合物的固體形式包括這樣的形式，其中：所述藥物組合物是呈散劑、片 劑、膠囊劑或錠劑的形式;或所述組合物包含冷凍干燥形式的化合物以及填充劑(bulking agent)，所述組合物任選地是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。在某些方面，所述藥物組 合物包含為液體的載體。在該方面，所述化合物可以溶解在所述液體中或分散在所述液體 中；和/或所述液體是水性的；和/或所述液體是無菌注射用水或磷酸鹽緩沖鹽水;和/或所 述組合物是在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。
[0036] 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)以下化合物的方法
[0037]
[0038]
[0039]
[0040] 所述方法包括:使25-羥基膽留醇與三氧化硫來源(source of sulfur trioxide) 反應，和，任選地，從得到的5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯（25HCDS)形成藥學上可接受的 鹽。在某些方面，所述三氧化硫來源是三氧化硫-胺復合物。在其它方面，所述方法包括:將 所述化合物與生理學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合。
[0041]如上面指出的，本發(fā)明尤其提供了用在以下方法中的指定化合物:在有此需要的 受試者中減少脂質的方法;在有此需要的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成的方法;在 有此需要的受試者中減少炎癥的方法;在有此需要的受試者中治療糖尿病的方法;在有此 需要的受試者中治療高脂血癥的方法;在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化的方法； 在有此需要的受試者中治療脂肪肝病的方法;或在有此需要的受試者中治療炎性疾病的方 法。為了避免疑惑，在該方面，本發(fā)明可以提供在指定方法中用作藥物的指定化合物。此外， 本發(fā)明可以提供在指定方法中用作活性治療成分的指定化合物。此外，本發(fā)明可以提供用 在通過療法來治療人或動物體的方法中的指定化合物，所述方法包括指定方法。
【附圖說明】
[0042]圖1.通過負離子-三重四極質譜法表征作為5-膽留烯-3β，25_二醇二硫酸酯的細 胞核氧化固醇。顯示了HPLC/MS負離子全掃描譜，即用質量離子80從m/z 583和m/z 561的產(chǎn) 物掃描譜分選的HPLC-MS洗脫特性。
[0043]圖2.化學合成的25HCDS的分析。產(chǎn)物的MS譜。
[0044]圖3.25HCDS的1Η匪R譜。箭頭指示在該化合物的3位的質子以及它在起始原料中 和在產(chǎn)物中的共振化學位移。
[0045]圖4.25HCDS的13C NMR譜。箭頭指示該化合物的3和25碳位置以及它在起始原料中 和在產(chǎn)物中的共振化學位移。
[0046]圖5A-D.25HCDS調(diào)節(jié)脂質生物合成基因表達。A，顯示了用指定濃度的25HCDS處理 的THP-1 細胞中 SREBP-1 c、ACC和FAS mRNA水平的實時RT-PCR分析;B，SREBP-2、HMG-CoA還原 酶和LDLR;在指定的時間（C)和在指定濃度(D)用25HCDS處理的THP-1細胞中的PPARg和IkB mRNA水平。將表達水平標準化|GAPDH。每個值代表3個單獨測量結果的平均值土標準偏 差。
[0047]圖6.25H⑶3S的施用會減少小鼠 NAFLD模型中肝組織的脂質積累。每3天1次地給動 物腹膜內(nèi)注射25HCDS，持續(xù)6周。如在實施例中所述確定肝甘油三酯、游離脂肪酸、總膽固 醇、游離膽固醇和膽固醇酯、游離脂肪酸和甘油三酯。通過蛋白濃度將每個單獨水平標準 化。將所有值表達為平均值土 SD;符號*代表p〈0.05，相對于ΗΠ )飼喂的媒介物處理的小鼠肝 臟。
[0048] 發(fā)明詳述
[0049] 現(xiàn)在已經(jīng)鑒別出一種新的膽固醇代謝物5 -膽甾烯-3β，2 5 -二醇二硫酸酯 (25HCDS)。在小鼠 NAFLD模型中，25HCDS的施用會大幅增加 PPARy、PPARy共活化劑la(PGC-la)和ΙκΒ的表達，并經(jīng)由體內(nèi)LXR-SREBP-lc信號傳遞途徑而降低肝甘油三酯和膽固醇水 平。這些發(fā)現(xiàn)證實，25HCDS是在脂質代謝和炎癥應答中涉及的一種有效調(diào)節(jié)劑。
[0050] 本發(fā)明因而提供了使用25HCDS治療和預防脂質代謝的和炎癥性障礙的方法。在某 些方面，所述方法包括:給需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的25HCDS，以便升高所 述受試者中的25HCDS水平和/或實現(xiàn)脂質代謝的有益變化。所述方法的實現(xiàn)通常包括:鑒別 罹患脂質代謝障礙和與其有關的病癥或處于發(fā)展脂質代謝障礙和與其有關的病癥的風險 中的患者，和/或鑒別罹患異常炎癥或處于發(fā)展異常炎癥的風險中的患者，和通過適當?shù)耐?徑以可接受的形式施用25HCDS。合適的受試者的鑒別可以如下完成，例如，如本領域已知 的，通過使用各種血液試驗、肝活組織檢查結果、明顯疾病征狀的存在等。合適的待治療的 受試者包括被鑒別為罹患或可能罹患脂質代謝障礙和/或炎癥的那些受試者。根據(jù)本發(fā)明 還提供了 25HCDS和有關的藥物組合物。這些可以用在治療方法中。
[0051] 25H⑶S可以是呈藥學上可接受的鹽的形式。所述藥學上可接受的鹽可以是二加成 鹽或單加成鹽。二加成鹽由25HCDS分子的2個硫酸酯基團中的每一個丟失氫原子而形成。單 加成鹽由25HCDS分子的2個硫酸酯基團中的僅一個(在所述分子的3β位或25位)丟失氫原子 而形成。
[0052]所述藥學上可接受的鹽可以是，例如，堿金屬鹽(例如，鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽）、堿土金 屬鹽（例如，鈣鹽）或銨鹽。所述藥學上可接受的鹽可以是例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽或銨 鹽。
[0053] 這樣的鹽的一個例子是25HCDS的鈉鹽，例如25HCDS的單加成鈉鹽，諸如通過 25HCDS的25-位處的硫酸酯基團丟失氫原子而形成的單加成鹽，即具有下式的化合物 [0054]
[0055]為了避免疑惑，應當強調(diào)的是，貫穿本說明書提及的"25H⑶S"包括25HCDS的藥學 上可接受的鹽，除非另外明確指出。
[0056] 膽固醇含有8個手性中心，從而產(chǎn)生大量可辨別的立體異構的異構體。這8個手性 中心也存在于25HCDS中。一般而言，在本發(fā)明中使用的25HCDS可以是呈任何單一立體異構 形式，或可以是這些立體異構形式中的任意兩種或更多種的混合物。但是，至少50重量％、 優(yōu)選地至少90重量％和最優(yōu)選地至少95重量％的25!?1)3可以具有下式
[0057]
[0058] 鮮，彳土1次：1\ T ;L·、τ 母一亍'1土與彳土天然膽固醇中發(fā)現(xiàn)的 手性類似。因而，該立體異構體對應于體內(nèi)天然25HCDS代謝物的立體異構形式。
[0059]所述25H⑶S或其藥學上可接受的鹽可以是分離的25H⑶S或其藥學上可接受的鹽。 "分離的"是指，沒有被包含在組織材料中，所述組織材料被包含在人或動物受試者內(nèi)或者 提取自人或動物受試者。例如，分離的25HCDS或其藥學上可接受的鹽沒有被包含在細胞內(nèi)。 因而，分離的25HCDS或其藥學上可接受的鹽可與被包含在組織材料(例如，細胞）內(nèi)的天然 25HCDS明顯區(qū)分，所述組織材料本身被包含在人或動物受試者內(nèi)或者已經(jīng)提取自人或動物 受試者。
[0060] 所述25HCDS或其藥學上可接受的鹽可以是基本上純的。例如，25H⑶S或其藥學上 可接受的鹽可以以基本上純化的形式提供用在治療方法中。
[0061 ]當它是"基本上純的"或"基本上純化的"時，二硫酸化的氧化固醇（25H⑶S或其藥 學上可接受的鹽)可以是呈至少約75%、優(yōu)選地至少約80%、更優(yōu)選地至少約90%和最優(yōu)選 地至少約95%或更大程度地不含其它化學物質的形式。基本上純的25HCDS或其藥學上可接 受的鹽可以具體地包含至少約90重量％或至少約95%、和更優(yōu)選地至少約98重量％、至少 約99重量％、或甚至更優(yōu)選地至少約99.5重量％或至少約99.8重量％的25!?1)3或其藥學上 可接受的鹽。
[0062]所述25HCDS或其藥學上可接受的鹽可以是固體。例如，所述25HCDS或其藥學上可 接受的鹽可以是呈散劑形式。
[0063]所述25HCDS或其藥學上可接受的鹽可以是呈冷凍干燥形式。如眾所周知的，冷凍 干燥是通常用于保存易腐壞材料或使所述材料更便于運輸?shù)拿撍^程。該技術存在3個主 要階段，即冷凍、初步干燥和二次干燥。冷凍通常使用冷凍干燥機進行。在初步干燥過程中， 通過施加適當?shù)恼婵账絹砜刂茐毫?，同時供給足夠的熱以使存在的任何水升華。在二次 干燥過程中，通過進一步施加熱來除去水合的水。通常，還降低壓力來促進進一步干燥。冷 凍干燥過程結束后，可以在密封之前用惰性氣體(諸如氮)破壞真空，或可以在真空下密封 所述材料。
[0064]盡管可能從活細胞分離和純化25HCDS，本領域技術人員會認識到，為了產(chǎn)生足夠 量的二硫酸化的氧化固醇，通常通過合成化學方法，或通過包括使用重組DNA技術的方法 (例如通過使用克隆的酶進行膽固醇的合適修飾），合成所述化合物。在下面的實施例部分 中提供了一個示例性的合成方案。
[0065] 更一般而言，通過使25-羥基膽留醇與三氧化硫來源反應，和，任選地，從得到的產(chǎn) 物形成藥學上可接受的鹽，可以合成生產(chǎn)25HCDS或其藥學上可接受的鹽。
[0066]可以使用任意合適的三氧化硫來源將存在于25-羥基膽留醇中的2個羥基(-OH)轉 化成硫酸酯基團（-0S03H)。三氧化硫-胺復合物是三氧化硫來源的一個示例性集合。這樣的 復合物的例子包括三氧化硫三甲胺復合物(TMAS)、三氧化硫三乙胺復合物(TEAS)、三氧化 硫二甲基苯胺復合物(DMAS)、三氧化硫二甲基甲酰胺復合物(DMFS)、三氧化硫吡啶復合物 (PSS)和三氧化硫聚乙烯基吡啶復合物(PVPS)。通常，每摩爾的25-羥基膽留醇使用1-20摩 爾(例如2-10摩爾）的選定三氧化硫來源(諸如三氧化硫-胺復合物）。
[0067] 所述反應通常在惰性溶劑中進行。所述溶劑可以是例如無水溶劑。一種示例性的 這樣的溶劑是無水吡啶。
[0068] 還可以加入堿，例如以便從二硫酸酯產(chǎn)品制備期望的藥學上可接受的鹽。一種這 樣的堿是NaOH，其可以用于制備25HCDS的鈉鹽。將容易明白，可以使用替代性試劑(具有不 同的堿度和/或不同的陽離子)來制備其它藥學上可接受的鹽。
[0069] 反應溫度通?？梢允?0-100°C，例如20_80°C。反應時間通?？梢允?.1-24小時， 例如0.25-5小時。
[0070] 如果需要的話，在反應已經(jīng)發(fā)生以后，可以從反應混合物純化產(chǎn)物。如果需要的 話，在反應已經(jīng)發(fā)生以后，可以從反應混合物分離產(chǎn)物。
[0071] 25-羥基膽留醇起始原料是一種商購可得的產(chǎn)品?？商鎿Q地，它可以通過羥基化膽 固醇來制備(參見例如(^3￥3等人.3丨61'〇1(1874:81-87)。所述方法因此可以進一步包括羥基 化膽固醇以產(chǎn)生25-羥基膽留醇的初始步驟。
[0072]可以以純形式或在藥學上可接受的制劑中施用25H⑶S。這樣的制劑(組合物)通常 包括25HCDS或其藥學上可接受的鹽和生理學上可接受的（相容的）賦形劑、稀釋劑或載體/ 媒介物。所述25HCDS可以例如呈藥學上可接受的鹽(例如堿金屬鹽諸如鈉、鉀、鈣、鋰、銨等） 或其它復合物的形式。
[0073]所述藥物組合物是無菌的。無菌的是指，基本上不含有活微生物，例如如使用美國 藥典（USP)無菌度試驗（參見"The United States Pharmacopeia"，第30次修訂，The United States Pharmacopeial Convention:2008)所確定的。為了維持無菌度，所述藥物 組合物可以存在于密封包裝中，所述包裝能夠阻止活微生物的進入。例如，在液體藥物組合 物的情況下，所述組合物可以密封在小瓶或安瓿中。
[0074]應當理解，藥學上可接受的制劑(組合物)包括常規(guī)地用于制備可注射劑型和固體 劑型(諸如片劑、錠劑、散劑和膠囊劑）以及氣霧化劑型的液體和固體材料。可以用水性的或 基于油的媒介物配制所述化合物?？梢允褂盟鳛橛糜谥苽浣M合物(例如可注射的組合物） 的載體，所述組合物還可以包含常規(guī)緩沖劑和試劑，以使所述組合物等滲并維持生理學上 可接受的pH。其它可能的添加劑(優(yōu)選被公認為安全的[GRAS]那些)包括:著色劑；調(diào)味劑； 表面活性劑(TWEEN、油酸等）；溶劑、穩(wěn)定劑、酏劑和粘合劑或密封劑(乳糖、脂質體等）。固體 稀釋劑和賦形劑包括乳糖、淀粉、常規(guī)崩解劑、包衣劑等。還可以使用防腐劑諸如對羥基苯 甲酸甲酯或苯扎氯銨。
[0075]更詳細地，當所述組合物是呈固體形式時，它可以是呈散劑、片劑、膠囊劑或錠劑 的形式。當所述組合物是呈固體形式時，所述組合物可以包含與填充劑在一起的冷凍干燥 形式的25HCDS。填充劑是藥學上無活性的，且通常是可以加入組合物中以增加它的體積的 化學惰性物質。用于制備冷凍干燥的藥物組合物且在這里合適的常見填充劑包括甘露醇和 甘氨酸。當所述組合物是呈固體形式時，它可以任選地在密封的小瓶、安瓿、注射器或袋中。 [0076]當所述藥物組合物包含液體載體時，25HCDS可以溶解在所述液體中或分散在所述 液體中；和/或所述液體可以是水性的；和/或所述液體可以是無菌注射用水或磷酸鹽緩沖 鹽水。當所述藥物組合物包含液體載體時，所述組合物可以是在密封的小瓶、安瓿、注射器 或袋中。
[0077] 取決于制劑，預見到，活性劑25HCDS占所述組合物重量的約1 %至約99%，且媒介 物"載體"將占所述組合物重量的約1%至約99%。本發(fā)明的藥物組合物可以包括任意合適 的藥學上可接受的添加劑或佐劑，只要它們不會阻礙或干擾硫酸化的氧化固醇的治療效果 即可。
[0078]施用可以是以下的至少一種：口服施用、腸施用、舌下施用、透皮施用、靜脈內(nèi)施 用、腹膜施用、胃腸外施用、注射施用、皮下注射和肌肉內(nèi)注射。例如，施用可以是□服或胃 腸外，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射等，或通過其它途徑(例如透皮、 舌下、口服、直腸和含服遞送、氣霧劑的吸入等）。在一個優(yōu)選的實施方案中，施用是口服。此 外，化合物的施用可以作為單一治療模式來進行，或與其它療法(例如降低脂質或膽固醇的 藥物、鍛煉和飲食方案等，如上面關于在檢測脂質代謝障礙以后受試者可能采用的治療方 案所述)結合進行。25HCDS給患者的施用可以是間斷的，或以逐步的或連續(xù)的、恒定的或受 控的速率。另外，施用藥物制劑的天數(shù)和每天的次數(shù)可以變化，且由熟練的從業(yè)人員（諸如 醫(yī)師)最佳地確定。
[0079]要施用的25HCDS的確切劑量可以隨以下因素而變化：單個患者的年齡、性別、重 量、總體健康狀況等，以及疾病的精確病原學。但是，通常，對于在哺乳動物(例如人類）中施 用而言，治療上有效的劑量是在約0.1至約l〇〇mg或更多化合物/千克體重/24小時的范圍 內(nèi)，和經(jīng)常約0.5至約50mg化合物/千克體重/24小時的范圍內(nèi)，并且經(jīng)常約1至約lOmg化合 物/千克體重/24小時是有效的。
[0080] 可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成單位劑型，即，所述藥物組合物可以是呈不連 續(xù)部分的形式，每個部分含有單位劑量的25HCDS。在該背景下，單位劑量可以包含，例如，約 0 · lmg至約lOOmg、或約0 · 5mg至約50mg、或約lmg至約lOmg的25HCDS。
[0081] 通過將25HCDS與選擇的生理學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或載體組合，可以制 備所述藥物組合物。
[0082] 盡管受試者經(jīng)常是人類，也預見到該技術的獸醫(yī)應用。
[0083]在其它方面，通過增加25HCDS的內(nèi)源性表達/生產(chǎn)，在有此需要的受試者中升高 25HCDS的水平。用于這樣做的示例性方法包括：給所述受試者提供一種或多種負責合成 25HCDS的酶。在某些實施方案中，提供所述酶本身;在其它實施方案中，提供編碼所述酶的 核酸。在25HCDS的合成中涉及的酶是SULT2Bab和SULT2Bla，并且可以施用這些中的一種或 兩種，以便升高內(nèi)源性25HCDS水平。例如，可以提供含有和表達這些酶中的一種或兩種的載 體。示例性的載體包括、但不限于:腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、復制型載體、皰疹病毒載 體等。
[0084]如本文中所述通過升高受試者中的25HCDS水平可以預防或治療的脂質代謝障礙 包括、但不限于：主要由各種病毒造成、但是也由一些細菌感染、藥物或化學物質（例如毒 物、醇)造成的肝炎(肝炎），以及有關的并發(fā)癥諸如肝纖維化；自身免疫性病癥（自身免疫性 肝炎)或遺傳性病癥;非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，即與肥胖有關且以肝臟中的脂肪豐度為 特征的一系列疾病，以及與NAFLD有關的各種綜合征（例如肝炎、非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)、肝硬化、末期肝病等）；肝硬化，即由于替換死亡肝細胞而在肝臟中形成纖維瘢痕組 織（肝細胞的死亡可以由例如病毒性肝炎、酒精中毒或與其它肝毒性化學物質的接觸造 成）；血色素沉著癥，即一種造成鐵在體內(nèi)積累、最終導致肝損傷的遺傳性疾病;肝癌(例如 原發(fā)性肝細胞癌或膽管上皮癌和轉移性癌癥，經(jīng)常來自胃腸道的其它部分）；威爾森氏病， 即一種造成身體保留銅的遺傳性疾病;原發(fā)性硬化性膽管炎，即一種膽管炎性疾病，可能在 性質上是自身免疫性的；原發(fā)性膽汁性肝硬化，即一種小膽管自身免疫病;Budd-Chiari綜 合征(肝靜脈的阻塞）；吉爾伯特氏綜合征，即一種遺傳性膽紅素代謝障礙，存在于約5%的 人口中；II型糖原貯積病；以及各種兒科肝疾病，例如包括膽道閉鎖、α-l抗胰蛋白酶缺乏、 alagille綜合征和進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積等。另外，還可以治療由創(chuàng)傷引起的肝損傷， 例如由事故、槍彈傷等造成的損傷。此外，可以預防或治療由某些藥物治療造成的肝損傷， 例如，已知藥物諸如抗心律不齊藥胺碘酮、各種抗病毒藥(例如核苷類似物）、阿司匹林(罕 見地作為兒童的瑞氏綜合征的一部分）、皮質類固醇、甲氨蝶呤、他莫昔芬、四環(huán)素等會造成 肝損傷。在某些實施方案中，所述診斷和治療方法與受試者的肝外科手術結合進行(例如在 所述肝外科手術之前、過程中或之后）。例如，所述肝外科手術可以是肝移植外科手術，且治 療的受試者可以是供體或受體;或所述肝外科手術可以是除去患病的或損傷的肝組織的外 科手術，或除去癌性腫瘤等的外科手術。
[0085]在某些實施方案中，要預防或治療的疾病或病癥是高脂血癥或由其造成。"高脂血 癥"是指在血液中異常升高的任意或所有脂質和/或脂蛋白水平的病癥。高脂血癥包括原發(fā) 性和繼發(fā)性亞型，其中原發(fā)性高脂血癥經(jīng)常是由于遺傳原因（諸如受體蛋白中的突變），且 繼發(fā)性高脂血癥源自其它潛在原因諸如糖尿病。可能在受試者中升高且通過本文描述的治 療來降低的脂質和脂質復合物包括、但不限于:乳糜微粒、極低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、 低密度脂蛋白（LDL)和高密度脂蛋白（HDL)。具體地，已知升高的膽固醇（高膽甾醇血癥 (hypercholesteremia))和甘油三酯（高甘油三酯血癥)是血管和心血管疾病的危險因素， 因為它們會影響動脈粥樣硬化。脂質升高也可能使受試者易患其它病癥諸如急性胰腺炎。 因此，本發(fā)明的方法也可以用在升高的脂質與升高的脂質有關的病癥的治療或預防（例如 預防性處理）中。這樣的病癥包括，例如，但不限于:高脂血癥、高膽固醇血癥、高甘油三酯血 癥、脂肪肝(肝臟皮質腺病(hepatic steatosis))、代謝綜合征心血管疾病、冠心病、動脈粥 樣硬化（即動脈硬化性血管疾病或ASVD)和有關病、急性胰腺炎、各種代謝障礙，諸如胰島素 抗性綜合征、糖尿病、多囊卵巢綜合征、脂肪肝病、惡病質、肥胖、動脈硬化、中風、膽結石、炎 性腸病、遺傳性代謝障礙諸如脂質貯存障礙等。另外，與高脂血癥有關的各種病癥包括在授 權的美國專利8,003,795〇^11，等人)和8,044,243(51^^1 &，等人）中描述的那些，它們二者 的整個內(nèi)容通過引用整體并入本文。
[0086]在某些實施方案中，要預防或治療的疾病和病癥包括炎癥、和/或與炎癥有關、以 炎癥為特征或由炎癥造成的疾病和病癥。這些包括作為許多人疾病的基礎的一大組障礙。 在某些實施方案中，所述炎癥是急性的，其源自例如感染、損傷等。在其它實施方案中，所述 炎癥是慢性的。在某些實施方案中，所述炎癥性障礙涉及免疫系統(tǒng)，如在變態(tài)反應和一些肌 病中所見。但是，也可以治療在炎癥性過程中具有病因學起源的各種非免疫疾病，包括癌 癥、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病、以及下面列出的其它疾病。
[0087]使用25HCDS可以預防或治療的與異常炎癥有關的障礙的例子包括、但不限于：尋 常痤瘡、哮喘、各種自身免疫疾病、乳糜瀉、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、各種超敏反應、炎性 腸病、骨盆炎性疾病、再灌注損傷、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、移植排斥、血管炎和間質性膀 胱炎。還包括由于使用合法地開處方的藥物和非法藥物而發(fā)生的炎癥障礙，以及由負面認 知或其后果觸發(fā)(例如由應激、暴力或剝奪造成)的炎癥。
[0088] 在一個方面，要預防或治療的炎癥性障礙是變態(tài)反應(1型超敏反應），即觸發(fā)炎癥 的不適當免疫應答的結果。一個常見的例子是枯草熱，其由皮膚肥大細胞對變應原的過敏 反應造成。嚴重的炎癥應答可以成熟為被稱作過敏反應的全身性應答。其它超敏反應(2型 和3型）由抗體反應介導，且通過攻擊白細胞(其損傷周圍組織）而誘導炎癥，且也可以如本 文中所述進行治療。
[0089] 在其它方面，預防或治療炎癥性肌病。這樣的肌病由不適當?shù)毓艏∪饨M分從而 導致肌肉炎癥征象的免疫系統(tǒng)造成。它們可以與其它免疫障礙(諸如系統(tǒng)性硬化癥)結合發(fā) 生，且包括皮肌炎、多肌炎和包涵體肌炎（inclusion body myositis)。
[0090] 在一個方面，本發(fā)明的方法和組合物用于預防或治療全身性炎癥，諸如與肥胖有 關的炎癥。在這樣的炎癥中，涉及的過程與組織炎癥相同，但是全身性炎癥不局限于特定組 織，而是涉及內(nèi)皮和其它器官系統(tǒng)。全身性炎癥可以是慢性的，且廣泛存在于肥胖中，在該 情況下觀察到許多升高的炎癥標志物，包括:IL-6(白介素-6)、IL-8(白介素-8)、IL-18(白 介素-18)、TNF_a(腫瘤壞死因子-c〇、CRP(C-反應蛋白）、胰島素、血糖和瘦素?？梢匀绫疚闹?所述預防或治療與升高的這些標志物水平有關的病癥或疾病。在某些實施方案中，所述炎 癥可以分類為"低級慢性炎癥"，其中觀察到細胞因子(諸如TNF-a、IL-6和CRP)的全身濃度 的2-3倍增加。腰圍也與全身性炎癥應答顯著相關;在該關聯(lián)中的一個突出因素是由于肥胖 觸發(fā)的自身免疫應答，由此免疫細胞將脂肪沉積物"誤認"為傳染性病原體諸如細菌和真 菌。全身性炎癥也可以由過量進食觸發(fā)。高飽和脂肪膳食以及高卡路里膳食已經(jīng)與炎癥性 標志物的增加關聯(lián)，且如果過量進食是長期的，所述應答可以變成慢性的。
[0091] 在下面的實施例中描述了本發(fā)明的不同方面。但是，在實施例中提供的信息不應 當視作以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0092] 新的膽固醇代謝物5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯（25HCDS)在體外和在體內(nèi)減少 脂質生物合成和抑制炎癥應答
[0093]前言
[0094]已經(jīng)證實，在非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)中存在廣泛的脂質代謝調(diào)節(jié)異常，并且 具體地，存在膽固醇代謝的較大紊亂。這樣的紊亂可以經(jīng)由核受體信號傳遞而導致NAFLD的 潛在機制仍然不明。在本研究中，在原代大鼠肝細胞中鑒別出新的膽固醇代謝物5-膽甾烯-3β，25-二醇二硫酸酯（25Η⑶S)。如本文中所述，現(xiàn)在已經(jīng)化學合成了 25Η⑶S并已經(jīng)研究了 它的生物學功能。2 5HCD S (2 5μΜ)給人ΤΗΡ-1巨噬細胞和HepG2細胞的施用和在體內(nèi)給小鼠 NAFLD動物模型的施用，會增加 PPAR γ和PPAR γ共活化劑la(PGC-la)表達并減少在脂質生 物合成和促炎癥應答中涉及的關鍵蛋白的表達。所述施用顯著地降低肝脂質水平并抑制炎 癥應答。定量RT-PCR和蛋白質印跡分析表明，25HCDS強烈地降低SREBP-l/2mRNA水平并抑制 它們的應答基因（包括ACC、FAS和HMG-CoA還原酶)的表達，以及增加 ΙκΒ和降低TNFa和IU3的 mRNA水平。結果提示，通過阻斷SREBP信號傳遞而發(fā)生脂質生物合成的抑制，并且通過增加 PPARy、PGC_la和ΙκΒ表達而發(fā)生炎癥應答的抑制。肝組織中的脂質譜的分析表明，每3天1 次施用25HCDS持續(xù)6周會使總膽固醇、游離脂肪酸和甘油三酯分別顯著降低30%、25%和 20 %。因此，25HCDS是脂質代謝和炎癥應答的有效調(diào)節(jié)劑。
[0095]材料和方法
[0096]材料：
[0097] 細胞培養(yǎng)試劑和輔助材料購自GIBCO BRL(Grand Island，NY);25-羥基膽留醇購 自New England燦(：1631(8〇8如11，]\^)。1'冊-1和!^口62細胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (Rockville,MD)。用于實時RT-PCR的試劑得自AB Applied Biosystems(Warrington WA1 4SR,UK)。在該研究中使用的化學物質得自Sigma Chemical Co. (St.Louis,M0)或Bio-Rad Laboratories(Hercules,CA)。針對 SREBPl、SREBP-2 和 HMG-CoA 還原酶的多克隆兔抗體購自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。除非另外指出，否則所有溶劑得自Fisher (Fair Lawn，NJ)。增強的化學發(fā)光（ECL)試劑購自 Amersham Biosciences(Piscataway， NJ)。睪酬和27-羥基膽留醇得自Research Plus Inc. (Bayonne，NJ)<3LK6 20X20cm薄層色 譜法（TLC)平板購自 Whatman Inc. (Cl if ton, NJ) 〇
[0098] 方法：
[0099] 5-膽留烯-3β，25_二醇二硫酸酯的化學合成
[0?00] -般規(guī)程:通過前面描述的方法(Ogawa等人.Steroids 74:81-87)，從膽固醇制備 25-羥基膽留醇。在JASC0 FT-IR 460plus波譜儀(Tokyo,日本)上在KBr盤中得到紅外波譜。 在Varian 500Inova(AS500)儀器上分別在499·62MHz和 125·64MHz得到1Η和13C NMR譜。通過 配備電噴射電離(ESI)探頭的Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra MS，在負離子模式 下記錄流動注射低分辨率質量(LR-MS)波譜。使用具有ESI探頭的Thermo Scientific LTQ Qrbitrap Discovery MS，在負離子模式下測量高分辨率質量(HR-MS)波譜。使用甲醇_水_ 乙酸混合物(90:10:1^八八)作為展開溶劑，在預涂布的1^-18?2545平板上進行反相11(：。 在110°C加熱下，用50%H 2S〇4使斑點顯影。將Bond Elute C18柱（10g;Varian)用于樣品純 化。OXONE? (過氧單硫酸鉀)和丙酮購自 Sigma-Aldri ch Co · (St · Loui s，MO，USA)，除了 HPLC級有機溶劑以外，使用的所有其它試劑是最高等級。
[0101] 5-膽甾烯-3β，25-二醇二硫酸酯（25HCDS)的合成：向25-羥基膽甾醇（30mg， 0.07mmol)在無水吡啶(300yL)中的溶液中，加入三氧化硫-三甲胺復合物(45mg)，并將混懸 液在50°C攪拌lh。向反應混合物中加入0.1 N NaOH甲醇溶液（100yL)，并將混合物應用于已 經(jīng)用甲醇（10mL)和水（10mL)預處理的Sep Pak C18柱。將柱先后用roS(25mL)和水（25mL)洗 滌，然后將保留的25HCDS用60 %甲醇（10ml)洗脫。用乙腈10倍稀釋后，在犯氣流下在40°C以 下蒸發(fā)溶劑至干燥，并得到粉末的形式的25HCDS。收率:25mg(60 % )。
[0102]細胞培養(yǎng)
[0103] 人THP-1單核細胞和HepG2細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，馬納薩斯， VA)，并根據(jù)供應商的方案維持。通過加入100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，使 THP-1單核細胞分化成巨噬細胞。當細胞達到約90 %匯合時，加入在乙醇中的25HCDS (乙醇 在培養(yǎng)基中的終濃度為〇. 1 % )。在指定的時間收獲細胞用于蛋白、mRNA和脂質分析。
[0104] 為了研究HMG CoA表達調(diào)節(jié)，在有或沒有美維諾林(50μΜ)和甲羥戊酸鹽(0.5μΜ)存 在下，在如上所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HepG2或ΡΗΗ。培養(yǎng)48小時以后，加入氧化固醇，并培養(yǎng)另 外6小時，然后收獲細胞用于確定mRNA和蛋白水平。
[0105] 通過TLC和HPLC確定膽固醇生物合成
[0106] 在含有指定的不同25H⑶S濃度的培養(yǎng)基中溫育THP-1巨噬細胞或HepG2細胞6小時 以后，給60mm培養(yǎng)皿中的細胞施加3ml含有5yCi的[卜14C]乙酸鹽的相同新鮮培養(yǎng)基。在37°C 溫育2小時以后，除去培養(yǎng)基，并將細胞用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌2次，按照描述用橡膠 刮棒收獲，并收集進微量離心管中。通過離心使細胞沉淀，并通過重懸浮和沉降將沉淀物洗 滌3次。如以前所述(2)，分離亞細胞級分(微粒體、胞質溶膠和細胞核）。將細胞的或亞細胞 的沉淀物再懸浮于0.3ml PBS中。向每個樣品中加入1.5yg睪酮作為內(nèi)部標準品。通過加入3 體積的氯仿：甲醇（1:1)，提取和分離總脂質。將[ 14C]膽固醇和羥基膽留醇分離進氯仿相中， 并在TLC(甲苯：乙酸乙酰酯，2/3，v/v/)上分離。如以前所述（1)，用Image Reader，F(xiàn)u jif ilm BAS-1800II使[1-14C]乙酸鹽衍生物顯影。
[0107] 為了分析未標記的留醇產(chǎn)物，將提取的脂質與2單位的膽固醇氧化酶一起在37°C 溫育20min。通過加入1.5ml甲醇，隨后加入0.5ml飽和KC1，終止氧化反應。使用3ml己烷提取 甾醇2次。收集己烷相，并在氮氣流下蒸發(fā)。如以前所述(3)，將殘余物溶解在流動相溶劑中 進行HPLC分析。
[0108] 使用HP Series 1100溶劑遞送系統(tǒng)(Hewlett Packard)，以1 · 3ml/min流速，在娃 膠(silica)柱(5μχ 4·6_ X 25cm;Beckman，USA)上通過HPLC分析氯仿相中的[1_14C]乙酸 酯衍生物。將柱平衡，并在作為流動相的己烷:異丙醇:冰醋酸(965:25:10， v/v/v)的溶劑系 統(tǒng)中運行。除了指定的情況以外，每0.5min(0.65ml/級分)收集流出物。通過閃爍計數(shù)確定 [14C]乙酸鹽衍生物中的計數(shù)。用[14C]膽固醇、[3H]25-羥基膽留醇和[ 14C]27-羥基膽留醇校 準柱。
[0109] 通過實時RT-PCR確定mRNA水平
[0110]用SV Total RNA Isolation Kit(Promega,Madison,WI)分離總RNA，其包括DNA酶 處理。如生產(chǎn)商（111￥；[1：1'08611，031'18&3(1，04)所推薦的，將2以8總1?熟用于第一鏈cDNA合成。使 用合適的染料作為指不劑，在ABI 7500Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City,CA)上進行實時RT-PCR。用于實時PCR的所有引物/探針集合是 TaqMan基因表達測定(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。使用β-肌動蛋白和甘油醛 3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的擴增作為內(nèi)部對照。用比較周期閾值(Ct)方法定量相對信使RNA (mRNA)表達，并表達為。用于擴增的合適引物的序列描述在例如Ren等人，2007(1)中。
[0111] 蛋白質印跡分析
[0112] 如以前所述(4)，分離微粒體級分。在7.5%SDS_聚丙烯酰胺變性凝膠上分離得自 經(jīng)處理的細胞的微粒體蛋白或總提取蛋白。在SDS-PAGE以后，通過電泳將蛋白轉移至聚偏 氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)。然后將膜在封閉緩沖液[PBS，pH 7·4,0·1%ΤΜΕΕΝ?20 (使膜蛋白增溶的非離子型表面活性劑，C58H114026)，5%脫脂奶粉]中在25°C封閉60分鐘。然 后將蛋白與針對人SREBPl、SREBP-2或HMG-CoA還原酶的兔多克隆IgG-起在4°C溫育過夜。 用含有0.05%的TWEEN?20的PBS(pH7.4)洗滌以后，加入在洗滌溶液中的山羊抗-兔 IgG-辣根過氧化物酶綴合物（1:2500)，并溫育60分鐘。使用Amersham ECL plus Kit，檢測 蛋白帶。通過Advanced Image Data Analyzer(Aida Inc.，Straubenhardt,德國）定量陽性 帶。
[0113] 動物研究
[0114] 動物研究經(jīng)過Institutional Animal Care and Use Committee of McGuire Veterans Affairs Medical Center批準，并根據(jù)赫爾辛基宣言（Declaration of Helsinki)、實驗動物護理和使用指南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)和所有適用規(guī)章進行。為了檢查25HCDS對血清和肝中飲食誘導的脂質積累的影 響，給8-周齡雌性C57BL/6J小鼠 （Charles River，Wi lmington，MA)飼喂含有42 %千卡脂肪、 43%千卡碳水化合物、15%千卡蛋白和0.2%膽固醇的高脂肪飲食(HFD) (Harlan Teklad， Madison，WI)持續(xù)10周。將所有小鼠在相同條件下圈養(yǎng)在無菌設備中，并自由獲取水和食 品。在每個階段結束時，每3天1次地給小鼠腹膜內(nèi)地注射媒介物溶液(乙醇/PBS;媒介物)或 25H⑶S(25mg/kg)持續(xù)6周，并禁食過夜;并收集血液樣品。使用標準酶技術在位于McGuire Veterans Affairs Medical Center的臨床實驗室中測量血清甘油三酯、總膽固醇、高密度 脂蛋白-膽固醇、葡萄糖、堿性磷酸酶(ALK)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移 酶(AST)。如下所述，通過HPLC分析血清中的脂蛋白譜。
[0115] 肝脂質的定量
[0116] 將肝組織勻漿化，并用氯仿和甲醇的混合物(2:1)提取脂質，并過濾。將0.2ml提取 物蒸發(fā)至干燥，并溶解于1〇〇μ1含有10%的ΤΚΙ??ΝΤΜΧ-ΙΟΟΚμΗμΟΚ^?^Ο^，一種非離子型 表面活性劑）（Wako Chemicals USA,Richmond，VA)的異丙醇中進行膽固醇測定，溶解于 NEFA溶液（0.5g EDTA-Na2,2g TRIT0N?X-100,0.76ml IN NaOH,和0.5g疊氮化鈉/1，ρΗ 6.5)中用于游離脂肪酸測定(Wako Chemicals USA,Richmond，VA)，或溶解于單獨異丙醇中 用于甘油三酯測定(Fisher Scientific，Pittsburgh,PA)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書分別進行 所有測定。將每種脂質濃度標準化至肝重量。
[0117] 統(tǒng)計學
[0118]將數(shù)據(jù)報告為平均值±標準差。在指出的情況下，對數(shù)據(jù)進行t-檢驗分析，并且如 果p〈0.05,那么確定為顯著不同的。
[0119] 結果
[0120]在原代大鼠肝細胞的細胞核中的新的膽固醇代謝物的檢測 [0121]為了確定新膽固醇代謝物在肝細胞核中的存在，從原代大鼠肝細胞分離細胞核級 分。通過LC-MS分析每個級分的甲醇/水相中的氧化固醇。結果表明，2種主要分子離子m/z 561和m/z 583(561+Na)與分子5-膽甾烯-3β，25-二醇二硫酸酯較好地配合（圖1)。所述分子 最可能由SULT2Blb和SULT2Bla合成。
[0122] 細胞核氧化固醇5-膽留烯-3β，25_二醇二硫酸酯的化學合成
[0123] 為了證實它的結構并研究它在細胞脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥應答中的作用，如上所述 化學合成25HCDS并純化。
[0124] 合成的化合物的MS分析顯示出與可靠的細胞核氧化固醇相同的分子質量離子m/z 561和m/z 583(+Na)，并且純化的產(chǎn)物沒有被起始原料25-羥基膽留醇(m/z 401)污染。LR-MS(ESI-陰性的），m/z:583.4(M+Na-2H，88%)，561.3(M-H，46%)，481.4(M-S〇3-H，ll%)， 463.4(M-H2S〇4-H，34% ),431.82(14%) ,381.27( 100%)(圖2) ,Η Mffi(CD3OD)S:〇.72(3H， s，18-CH3)，0.97(3H，d，J 5·0Ηζ，2卜〇13)，1.03(3!1，8，19-〇13)，1.14(6!1，8,26-和27-〇13)， 4.14(1!1，1^.111，3〇-!1)，5.39(1!1，1^.8,6-!1)(圖3)。 13〇匪1?(0)3〇0)3:12.45，19.37，19.90， 21.82,22.29,25.45,25.51,27.05,27.12,29.39,29.44,30.13,33.16,33.37,37.26, 37.32,37.50,38.60,40.52,41.27,43.65,51.78,57.71,58.37,79.98,85.93,123.44, 141.71 (圖4)。結果指示，合成的分子是5-膽留烯-3β，25-二醇二硫酸酯（25HCDS)，并且它 "配合"肝細胞細胞核級分中的指定分子。
[0125] 25HCDS通過經(jīng)由SREBP信號傳遞降低ACC、FAS和HMG-CoA還原酶mRNA水平而抑制脂 質生物合成
[0126] 為了研究25HCDS如何抑制脂質生物合成，從處理過的THP-1巨噬細胞分離總RNA。 通過實時RT-PCR，確定巨噬細胞和hepG2細胞中的ACC和FAS(用于甘油三酯合成）以及HMG-CoA還原酶（用于膽固醇合成）的mRNA水平。如在圖5中所示，在向培養(yǎng)的細胞添加25HCDS以 后，ACC和FAS (圖5A)以及HMG-CoA還原酶mRNA水平（圖5B)的下降是濃度依賴性的（如顯示 的）和時間依賴性的（數(shù)據(jù)未顯示）。這些下降與圖5A和5B中所示的SREBP 1 /2的表達的減少 一致。這些結果指示，25HCDS會減少SREBP信號傳遞，并隨后減少脂質生物合成。令人感興趣 的是，25HCDS線性地增加 PPARy的mRNA水平，并在早期階段和在低濃度一致地增加 ΙκΒα表 達。結果提示，25HCDS會如同25HC3S-樣經(jīng)由PPAR γ /ΙκΒα信號傳遞途徑抑制炎癥應答。
[0127] 25HCDS的施用對飼喂HFD的小鼠中的脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響
[0128] 為了研究25HCDS的長期治療對脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響，給8-周齡C57BL/6J雌性小鼠 飼喂HFD 10周，然后分成2組。一組用25Η⑶S治療，另一組用媒介物處理，每3天腹膜內(nèi)注射1 次，持續(xù)6周。在治療過程中，給小鼠飼喂HFD，并監(jiān)測體重和卡路里攝入。沒有觀察到這2種 參數(shù)的顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示）。注射6周以后，將小鼠禁食過夜并處死。無論飲食如何，小鼠 的肝重量沒有顯示顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0129]為了研究25HCDS對肝脂質代謝的影響，確定了肝脂質水平和有關的基因表達水 平。如以前所報道的，與飼喂食物的小鼠相比，飼喂HFD的小鼠顯示出肝中增加的甘油三酯、 總膽固醇、游離脂肪酸和甘油三酯水平(數(shù)據(jù)未顯示）。25!1⑶S施用顯著減少了這些增加，例 如分別減少了30%、20%和18% (p〈0.05)，如圖6所示。另外，基因表達分析表明，25H⑶S施 用顯著減少了在游離脂肪酸、甘油三酯和膽固醇合成中涉及的關鍵酶和受體的表達，如在 表1中所示。
[0130]脂質代謝的調(diào)節(jié)異常經(jīng)常與炎性病癥有關。25H⑶S治療分別將TNFa和IL10的表達 顯著地抑制了50%、36% (表2)。這些結果與肝功能測定相一致，所述肝功能測定表明， 25HC3S抑制肝炎應答，從而減輕肝損傷和血清中的堿性磷酸酶活性(數(shù)據(jù)未顯示）。令人感 興趣的是，25HCDS使肝中的PGC-la的表達增加了2倍。因而，25HCDS似乎經(jīng)由LXR、PPARy和 PGC-lyt信號傳遞來調(diào)節(jié)脂質代謝和炎癥應答。
[0131]表1.在有或沒有25HCDS的情況下，在飼喂HFD的小鼠中在脂質代謝中涉及的相對 肝mRNA表達
[0132]
[0134] 如上所述處理動物。將所有值表達為平均值土 SD; η = 6-7。*p〈0.05，相對于ΗΠ )小 鼠?？s寫:HFD，高脂肪飲食。
[0135] 表2.在有或沒有25HCDS的情況下，在飼喂ΗΠ )的小鼠中在炎癥應答中涉及的相對 肝mRNA表達
[0136]
[0137] 如上所述處理動物。將所有值表達為平均值土 SD; *p〈0.05，#p〈0.01，相對于HFD 小鼠?？s寫:HFD，高脂肪飲食。
[0138] 討論
[0139] 膽固醇和甘油三酯代謝密切相關。孤兒核受體是調(diào)節(jié)關鍵靶基因的表達的配體活 化的轉錄因子，所述關鍵靶基因是許多生物學事件的重要調(diào)節(jié)劑。脂肪酸(PPAR)、氧化固醇 (LXR)、視黃酸(RXR)和SREBP的受體充當細胞脂質水平的傳感器，從而引起基因表達變化， 以便維持脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和保護細胞免于脂質積累引起的損傷。但是，在受體活動之間的相 互溝通聯(lián)系仍然不明。如本文證實的，膽固醇代謝物25HCDS會在體外和在體內(nèi)抑制SREBP-lc表達、加工和活性，并增加 PPARy和PGC-la表達。確定記載了SREBP控制脂質生物合成， PPARy調(diào)節(jié)炎癥應答，并且PGC-la控制能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因而，結果表明，25H⑶S是這些過程 的有效調(diào)節(jié)劑，并且在肝脂質體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持和炎癥應答中起重要作用。25HC3S的施用會 增加細胞核PPAR γ蛋白水平和抑制炎癥應答，但是僅僅輕微增加 PPAR γ的mRNA。相比而言， 25HCDS以時間和濃度依賴性的方式顯著地增加 PPARy和PGC-la的mRNA表達，從而指示 25HCDS在脂質代謝和炎癥應答的調(diào)節(jié)中比25HC3S更有效。
[0140] 25HCDS生物合成和氧化固醇硫酸化的反應代表一種新的調(diào)節(jié)途徑，其介導肝細胞 中的核受體活性。該途徑的關鍵組分總結如下：1)當細胞內(nèi)膽固醇水平增加時，線粒體膽固 醇遞送蛋白StAR將膽固醇遞送進線粒體中，在此處由CYP27A1合成調(diào)節(jié)性的氧化固醇，諸如 25HC。這些氧化固醇又活化LXR，并隨后上調(diào)在脂肪酸和甘油三酯生物合成中涉及的它的靶 基因的表達。另外，25HC會活化LXR，通過抑制HMGR表達而下調(diào)新合成的膽固醇合成，并增加 ABCA1介導的來自細胞的膽固醇分泌（HDL形成）。2)25耶35和25HCDS會滅活LXR并抑制 SREBP-lc加工，從而指示這些硫酸化的氧化固醇會通過抑制合成而降低細胞內(nèi)脂質水平； 3) 25HC對脂質代謝的作用與25HC3S和25HCDS的作用相反。因而，細胞內(nèi)的氧化固醇硫酸化 代表在脂質代謝中和在NAFLD發(fā)展中涉及的一種新的調(diào)節(jié)機制。
[0141] 用25HCDS治療小鼠 NAFLD模型會降低肝脂質水平^已經(jīng)研究了對NAFLD的大量治 療。盡管許多治療似乎會改善生化標志物諸如丙氨酸轉氨酶水平，大多數(shù)沒有得到證實會 逆轉組織學異?；驕p少臨床端點。25HCDS通過阻斷核受體LXR和SREBP的活化而在轉錄水平 抑制在脂質生物合成中涉及的關鍵基因表達，從而抑制由HFD誘導的促炎性細胞因子和經(jīng) 由PGCla控制能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因而，25HCDS充當有效地降低肝脂質水平的有效調(diào)節(jié)劑，并因 此代表用于治療NALH)和其它脂質代謝的有關疾病的新藥劑。
[0142] 參考文獻
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[0147] 盡管已經(jīng)以它的優(yōu)選實施方案的方式描述了本發(fā)明，但是本領域技術人員會認識 至ij，在所附權利要求的精神和范圍內(nèi)做出修改的情況下，可以實踐本發(fā)明。因此，本發(fā)明不 應當限于如上所述的實施方案，而是應當進一步包括在本文提供的描述的精神和范圍內(nèi)的 所有修改方案及其等同方案。
【主權項】
1. 用作藥物的化合物，所述化合物為：（i)下式的5-膽醬締-3β，25-二醇二硫酸醋 (25HCDS)或（ii)其藥學上可接受的鹽。2. 用于根據(jù)權利要求1所述的用途的化合物，其中所述化合物是3. 用于W下方法中的如在權利要求1或2中定義的化合物:在有此需要的受試者中減少 脂質的方法;在有此需要的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成的方法;在有此需要的受 試者中減少炎癥的方法;在有此需要的受試者中治療糖尿病的方法;在有此需要的受試者 中治療高脂血癥的方法;在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化的方法;在有此需要的 受試者中治療脂肪肝病的方法;或在有此需要的受試者中治療炎性疾病的方法。4. 如在權利要求1或2中定義的化合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于:在有此需 要的受試者中減少脂質；在有此需要的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成;在有此需要 的受試者中減少炎癥;在有此需要的受試者中治療糖尿病;在有此需要的受試者中治療高 脂血癥;在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化;在有此需要的受試者中治療脂肪肝病； 或在有此需要的受試者中治療炎性疾病。5. 治療受試者的方法，所述方法包括:給所述受試者施用有效量的如在權利要求1或2 中定義的化合物，其中所述方法選自：在有此需要的受試者中減少脂質的方法;在有此需要 的受試者中減少膽固醇和脂質生物合成的方法;在有此需要的受試者中減少炎癥的方法； 在有此需要的受試者中治療糖尿病的方法;在有此需要的受試者中治療高脂血癥的方法； 在有此需要的受試者中治療動脈粥樣硬化的方法;在有此需要的受試者中治療脂肪肝病的 方法;和在有此需要的受試者中治療炎性疾病的方法。6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其中： -基于所述受試者的體重，W在0.1 mg/kg至lOOmg/kg范圍內(nèi)的量施用所述化合物，或基 于所述受試者的體重，W在Img/kg至lOmg/kg范圍內(nèi)的量施用所述化合物;和/或 -所述施用包括W下的至少一種：口服施用、腸施用、舌下施用、透皮施用、靜脈內(nèi)施用、 腹膜施用、胃腸外施用、注射施用、皮下注射和肌肉內(nèi)注射。7. 如在權利要求1或2中定義的化合物。8. 根據(jù)權利要求7所述的化合物，所述化合物是分離的化合物。9. 根據(jù)權利要求7或8所述的化合物，所述化合物是基本上純的。10. 根據(jù)權利要求7-9中的任一項所述的化合物，所述化合物是呈固體形式。11. 根據(jù)權利要求10所述的化合物，所述化合物是： -呈散劑形式;和/或 -呈冷凍干燥形式。12. 藥物組合物，其包含：（i)如在權利要求1或2中定義的化合物;和（ii)生理學上可接 受的賦形劑、稀釋劑或載體。13. 根據(jù)權利要求12所述的藥物組合物，其中所述組合物配制成單位劑型。14. 根據(jù)權利要求12或13所述的藥物組合物，其中所述組合物是呈固體形式。15. 根據(jù)權利要求14所述的藥物組合物，其中： -所述組合物是呈散劑、片劑、膠囊劑或錠劑的形式;或者 -所述組合物包含與填充劑在一起的冷凍干燥形式的化合物，所述組合物任選地是在 密封的小瓶、安飯、注射器或袋中。16. 根據(jù)權利要求12或13所述的藥物組合物，所述藥物組合物包含液體載體。17. 根據(jù)權利要求16所述的藥物組合物，其中： -所述化合物溶解在所述液體中或分散在所述液體中；和/或 -所述液體是水性的;和/或 -所述液體是無菌注射用水或憐酸鹽緩沖鹽水;和/或 -所述組合物是在密封的小瓶、安飯、注射器或袋中。18. 生產(chǎn)如在權利要求1或2中定義的化合物的方法，所述方法包括:使25-徑基膽醬醇 與Ξ氧化硫來源反應，和任選地，從得到的5-膽醬締-3β，25-二醇二硫酸醋（25HCDS)形成藥 學上可接受的鹽。19. 根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述Ξ氧化硫來源是Ξ氧化硫-胺復合物。20. 生產(chǎn)如在權利要求12-17中的任一項中定義的藥物組合物的方法，所述方法包括： 將所述化合物與所述生理學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合。
【文檔編號】A61P1/16GK106083976SQ201610412359
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2013年3月15日 公開號201610412359.9, CN 106083976 A, CN 106083976A, CN 201610412359, CN-A-106083976, CN106083976 A, CN106083976A, CN201610412359, CN201610412359.9
【發(fā)明人】S·任
【申請人】弗吉尼亞聯(lián)邦大學