專利名稱：用于膜電位測(cè)定的光遺傳學(xué)探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是涉及用于光學(xué)測(cè)定磷脂雙層間電位的方法，構(gòu)建體和組合物。
背景技術(shù)：
附膜的生物結(jié)構(gòu)可承受膜內(nèi)外電壓差。這種電壓，又被稱為膜電位，具有多種生物功能，包括傳送信息(例如，在神經(jīng)元中)，在產(chǎn)生ATP中作為媒介物(例如，在細(xì)菌和線粒體中)，為鞭毛電機(jī)提供動(dòng)力(例如，在細(xì)菌中)和控制營(yíng)養(yǎng)素、毒素和信號(hào)分子的跨膜運(yùn)輸(在細(xì)菌和真核細(xì)胞中)。盡管膜電位具有重要的的生物學(xué)作用，膜電位的測(cè)定還是非常困難的。電生理學(xué)是通過(guò)在膜兩側(cè)放置電極來(lái)直接記錄電位差。電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)定慢，每次僅能測(cè)定一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞，不能進(jìn)入深層組織(例如，體內(nèi))，不能作用于微小細(xì)胞(例如，細(xì)菌)、堅(jiān)固細(xì)胞壁包圍的細(xì)胞(例如，酵母)或活動(dòng)的細(xì)胞(例如，精子)，不能應(yīng)用于長(zhǎng)期測(cè)定，并且在測(cè)定中常會(huì)損壞或殺死細(xì)胞。因此，需要開(kāi)發(fā)膜電位的新型測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述的方法是使用細(xì)菌視紫紅質(zhì)作為光學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)磷脂層間的電壓。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該新系統(tǒng)可以光學(xué)測(cè)定細(xì)胞的膜電位或細(xì)胞腔隙的結(jié)合膜電位，如細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、人造細(xì)胞或其他類脂膜結(jié)合結(jié)構(gòu)。該方法包括在細(xì)胞或細(xì)胞器上表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)，將細(xì)胞暴露于光源下和檢測(cè)細(xì)菌視紫紅質(zhì)發(fā)射出的熒光，其中通過(guò)發(fā)射的熒光強(qiáng)度反應(yīng)膜電位。該方法無(wú)需使用電極就可以測(cè)定膜電位。該方法可進(jìn)一步監(jiān)測(cè)一個(gè)或多個(gè)外部刺激引起的細(xì)胞膜電位變化。這不僅有利于科研，并且，例如，在篩選影響膜電壓能力的候選試劑中也是很重要的，例如，在藥物篩選中。本發(fā)明還提供表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)和修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)的細(xì)胞，和編碼修飾的古細(xì)菌視紫紅質(zhì)的核酸構(gòu)建體，其在真核細(xì)胞中測(cè)定膜電位及其變化是有用的。在一些具體實(shí)施方式
中，在此描述的光學(xué)傳感器使其內(nèi)源性離子泵活性下降，或相比于天然細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白質(zhì)，部分或全部活性得以抑制。這樣光學(xué)感受器可測(cè)定電壓，但通過(guò)構(gòu)建的離子梯度不能參與改變電壓。電壓及其變化的檢測(cè)能夠可視化，并且使用光學(xué)系統(tǒng)及進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明是基于，至少部分上是基于下述發(fā)現(xiàn)，該發(fā)現(xiàn)是細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白如古細(xì)菌視紫紅質(zhì)或變形菌視紫紅質(zhì)以及其修飾的變型，具有降低的離子泵活性(與來(lái)自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比)，能夠被用作光學(xué)傳感器在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)跨膜電壓。也就是說(shuō)，細(xì)菌視紫紅質(zhì)和修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白可用于測(cè)定細(xì)胞的膜電位以及膜電位的變化。該構(gòu)建體和方法也可用于組織和器官的體內(nèi)成像，例如在斑馬魚(yú)上，由于電極尺寸的限制其不能用于研究。這不僅有利于科研，而且在篩選新型候選試劑在影響細(xì)胞的膜電壓能力也是很重要的。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了變形菌視紫紅質(zhì)光學(xué)質(zhì)子傳感器(PROPS)，其主要作用于細(xì)菌細(xì)胞，以及基于古細(xì)菌視紫紅質(zhì)的熒光電壓指示蛋白(VIPs)家族，其也作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括神經(jīng)元和人類干細(xì)胞源性的心肌細(xì)胞。VIPs是以來(lái)自于古細(xì)菌視紫紅質(zhì)3 (Arch)及其同系物的電壓指示器為基礎(chǔ)。這些蛋白以亞毫秒時(shí)間分辨率和亞微米空間分辨率指示電動(dòng)力學(xué)。利用VIPs，我們通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織使用電動(dòng)力學(xué)的光學(xué)檢測(cè)表明非接觸、高通量和高含量的測(cè)定方法。本文描述的光學(xué)傳感器不受電極使用的限制，使電生理學(xué)研究可以在例如亞細(xì)胞區(qū)室中(例如，線粒體)或在小細(xì)胞中(例如，細(xì)菌)中進(jìn)行。在此描述的光學(xué)傳感器可用于藥物篩選中，裝置研究，以及真核和原核細(xì)胞電壓變化的體內(nèi)、體外成像中。我們描述電壓指示器蛋白和表達(dá)此蛋白的構(gòu)建體。該構(gòu)建體具有任意的細(xì)胞型的特異性啟動(dòng)子，當(dāng)細(xì)胞分化時(shí)啟動(dòng)子開(kāi)啟，例如，分化為神經(jīng)元細(xì)胞，如神經(jīng)元，或分化為心肌細(xì)胞，例如心肌細(xì)胞，浦肯野細(xì)胞或竇狀細(xì)胞。該構(gòu)建體可進(jìn)一步包括靶信號(hào)如線粒體靶信號(hào)，其針對(duì)在所需膜位置的電壓指示器蛋白。我們提供細(xì)胞，以及瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)這些蛋白的細(xì)胞系，包括人類干細(xì)胞，如誘導(dǎo)多能細(xì)胞(iPSC)或胚胎干細(xì)胞(ESC)，神經(jīng)祖細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，心臟祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。我們還描述了采用描述的電壓指示器蛋白篩選藥物的方法。本發(fā)明方法使用的細(xì)胞，不管是原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞，都被典型的工程化表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)或修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)，而他們不能天然地表達(dá)用于本發(fā)明方法的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，發(fā)明提供一種測(cè)定表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白編碼的核酸細(xì)胞膜電位的方法，該方法包括步驟(a)，用至少一個(gè)波長(zhǎng)的光通過(guò)體外、離體或體內(nèi)激發(fā)至少一個(gè)包含編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的細(xì)胞，和步驟(b)體外、離體或體內(nèi)檢測(cè)來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞的至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)，其中和參考相比，由至少一個(gè)細(xì)胞發(fā)射的熒光強(qiáng)度水平指示細(xì)胞膜電位。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，與來(lái)自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比，其離子泵活性降低。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是變形菌視紫紅質(zhì)蛋白家族中的成員。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的成員。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)波長(zhǎng)在λ =594-645之間的波長(zhǎng)，波長(zhǎng)范圍在λ =630-645nm之間的波長(zhǎng)也是可以使用的。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞是原核細(xì)胞。原核細(xì)胞可以是革蘭陽(yáng)性或革蘭陰性。原核細(xì)胞可以是病原性的或非病原性的。
在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞是真核細(xì)胞。 在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是干細(xì)胞、多能細(xì)胞或祖細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是誘導(dǎo)多能細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是心肌細(xì)胞。這些細(xì)胞可以體外培養(yǎng)或離體培養(yǎng)，或者可以是器官或組織的部分。典型的細(xì)胞包括細(xì)菌，酵母，植物細(xì)胞，和來(lái)自脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，真核細(xì)胞是人類細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，真核細(xì)胞是非人類細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞不天然地表達(dá)方法中使用的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法進(jìn)一步包括將載體體夕卜，離體或體內(nèi)轉(zhuǎn)染給至少一個(gè)細(xì)胞的步驟，所述載體包含編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸。這些細(xì)胞可以被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸與細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子可操作地連接。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜靶向序列。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是質(zhì)膜靶向性序列。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，膜靶向序列是亞細(xì)胞區(qū)室靶向序列。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，亞細(xì)胞區(qū)室是選自于線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體和吞噬小體。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因可操作地連接于編碼附加熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)附加熒光蛋白是能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的蛋白。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)能夠指示離子濃度的附加熒光蛋白是鈣指示劑。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，能夠指示離子濃度的熒光蛋白是pH指示劑。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，熒光蛋白能夠進(jìn)行非放射性熒光共振，使能量轉(zhuǎn)移到細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，突光蛋白的亮度對(duì)膜電位和局部化學(xué)環(huán)境不敏感，因此，和細(xì)菌視紫紅質(zhì)的熒光相比可作為參考。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括如下步驟:采用至少第一和第二波長(zhǎng)的光體外、離體或體內(nèi)激發(fā)至少一個(gè)細(xì)胞；和體外、離體或體內(nèi)檢測(cè)至少第一和第二光學(xué)信號(hào)，該信號(hào)由至少第一和第二波長(zhǎng)的激發(fā)引起，其不同于來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞的至少第一波長(zhǎng)。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少第二波長(zhǎng)是在λ =447-594之間的波長(zhǎng)。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括如下步驟:計(jì)算細(xì)菌視紫紅質(zhì)的熒光發(fā)射與附加熒光蛋白的熒光發(fā)射的比率，以獲取不依賴于表達(dá)水平差異的膜電位測(cè)定。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括將至少一個(gè)細(xì)胞體外，離體或體內(nèi)暴露于能夠或預(yù)期能夠改變膜電位的刺激的步驟。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，刺激是候選試劑。在一些具體實(shí)施方式
中，給予至少一個(gè)候選試劑。在一些具體實(shí)施方式
中，同時(shí)或順序給予至少兩個(gè)候選試劑的組合。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，刺激是細(xì)胞培養(yǎng)基組分的變化。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，刺激是電流。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法還包括在至少第一時(shí)間點(diǎn)和至少第二時(shí)間點(diǎn)體外，離體或體內(nèi)測(cè)定，至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)的步驟。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少第一時(shí)間點(diǎn)是在將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之前，至少第二時(shí)間點(diǎn)是將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之后。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，本方法還包括測(cè)定來(lái)自于暴露在至少第一波長(zhǎng)和至少第二波長(zhǎng)的光學(xué)信號(hào)間的熒光比例的步驟。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該方法包含使用多個(gè)細(xì)胞。例如在高通量測(cè)定模式中。例如，在此具體實(shí)施方式
中，表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的多個(gè)細(xì)胞可以暴露于多個(gè)候選試劑中，例如候選藥物，和篩選候選試劑影響細(xì)胞膜電位的能力。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，真核細(xì)胞是人類細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，真核細(xì)胞是非人類細(xì)胞。在另外的具體實(shí)施方式
中，發(fā)明提供了分離和純化的核酸，其編碼古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的修飾成員，與來(lái)自于古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的天然成員相比，離子泵活性降低。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，與衍生源古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族天然成員相比，離子泵活性下降的古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的修飾成員包括鄰近希夫喊基的突變的質(zhì)子受:體。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接于編碼膜-靶向序列的核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，膜-靶向序列的核酸是亞細(xì)胞膜-靶向序列。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，亞細(xì)胞膜是線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接于細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子。
在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接于編碼附加熒光蛋白或生色團(tuán)的至少一個(gè)核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸可操作地連接于編碼附加熒光蛋白的核酸，該蛋白可經(jīng)受熒光共振能量轉(zhuǎn)移成為細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分離純化的核酸還包括載體。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，該載體是病毒載體，如慢病毒載體或腺伴隨病毒載體(AAV)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種包括上述分離和純化的核酸的試劑盒。核酸可以通過(guò)在緩沖液中或以干燥的形式例如適宜容器中冷凍干燥形式提供。在一些具體實(shí)施方式
中，試劑盒還包括實(shí)施本發(fā)明中方法或測(cè)定的緩沖液和溶液。根據(jù)說(shuō)明書(shū)中提供的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可為該試劑盒挑選和選擇合適的試劑。該試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染試劑，一個(gè)或多個(gè)緩沖液，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基，一個(gè)或多個(gè)容器，例如細(xì)胞培養(yǎng)皿或陣列，從而進(jìn)行本發(fā)明中的方法或測(cè)定。該試劑盒中也可以包括進(jìn)行測(cè)定操作的說(shuō)明的說(shuō)明書(shū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供包括編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的分離細(xì)胞。該細(xì)胞典型地工程化表達(dá)細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，與來(lái)自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比，其離子泵活性下降。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，修飾細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白包括鄰近希夫堿基的突變的質(zhì)子受體。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)是變形菌視紫紅質(zhì)家族的成員。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)是古細(xì)菌視紫紅質(zhì)家族的成員。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞是真核細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞是原核細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，原核細(xì)胞是革蘭陽(yáng)性細(xì)胞。在一些具體實(shí)施方式
中，原核細(xì)胞是病原性細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因可操作地連接于啟動(dòng)子。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，啟動(dòng)子是細(xì)胞型特異性啟動(dòng)子。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，編碼修飾細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜靶向核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，編碼修飾細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)附加熒光蛋白是能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移，成為細(xì)菌視紫紅質(zhì)的蛋白，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，至少一個(gè)附加熒光蛋白是亮度對(duì)膜電位和局部化學(xué)環(huán)境不敏感的熒光蛋白。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞還包括編碼能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白的核酸。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，細(xì)胞是干細(xì)胞，多能細(xì)胞，或誘導(dǎo)多能細(xì)胞，或其分化的或其未分化的子代細(xì)胞。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分化細(xì)胞是神經(jīng)元。在發(fā)明的任一具體實(shí)施方式
或方面的一些方面中，分化細(xì)胞是心肌細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供試劑盒，其包括上述描述的在適宜培養(yǎng)基或容器中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。該試劑盒可包括在適宜培養(yǎng)基中的冷凍細(xì)胞。該試劑盒包括其他試劑，如一個(gè)或多個(gè)緩沖液，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基，和一個(gè)或多個(gè)容器。該試劑盒還可包括在此描述的方法中使用細(xì)胞的方法說(shuō)明書(shū)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供用于膜電位光學(xué)測(cè)定的工程細(xì)胞的生產(chǎn)方法，包括用編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟。轉(zhuǎn)染可以是瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在一些具體實(shí)施方式
中，細(xì)胞是原核細(xì)胞。該原核細(xì)胞是革蘭陽(yáng)性或革蘭陰性。在一些方面中，原核細(xì)胞是致病菌。細(xì)胞還可以是干細(xì)胞，多能細(xì)胞，分化細(xì)胞或無(wú)限增殖化細(xì)胞或細(xì)胞株。細(xì)胞可以是器官或組織的分離細(xì)胞或一部分，如斑馬魚(yú)或非人類胚胎或人類胚胎。在此具體實(shí)施方式
的一方面，和該具體實(shí)施方式
的任一方面中，細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白。在此具體實(shí)施方式
的一方面，和該具體實(shí)施方式
的任一方面中，編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于分化的細(xì)胞型特異性啟動(dòng)子。在此具體實(shí)施方式
的一方面，和該具體實(shí)施方式
的任一方面中，編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于至少一個(gè)編碼熒光蛋白或生色團(tuán)的附加基因。在此具體實(shí)施方式
的一方面中，至少一個(gè)編碼熒光蛋白的附加基因是綠色熒光蛋白或其同系物。在此具體實(shí)施方式
的一方面，和該具體實(shí)施方式
的任一方面中，編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可選擇地連接于能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白。本說(shuō)明書(shū)提供了示例性核酸和核酸構(gòu)建體，它們的核酸序列在附帶的序列表中提供。具有代表性的是，通過(guò)突變?cè)摰鞍奏徑７驂A基的質(zhì)子受體進(jìn)行修飾，使修飾的視紫紅質(zhì)至少離子泵活性下降。然而，本發(fā)明意欲不受這些實(shí)施例的限制，因?yàn)轭愃乒鈱W(xué)測(cè)定用于許多現(xiàn)存細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是可能。任何該類蛋白可用于本發(fā)明的方法，且任何該類蛋白也可以修飾使其離子泵活性下降。


圖1顯示在綠色變形菌視紫紅質(zhì)的D97N突變體中的電壓靈敏度機(jī)理。左側(cè):綠色變形菌視紫紅質(zhì)(a)跨越磷脂雙層膜(b)。右側(cè):視黃醛(C)的生色團(tuán)放大圖，其通過(guò)希夫堿基(d)與蛋白骨架共價(jià)結(jié)合。在野生型結(jié)構(gòu)中的門(mén)冬氨酸97被突變?yōu)樘於０?e)，進(jìn)而降低希夫堿基的pKa，從野生型的>12降低為9.8值，以消除質(zhì)子泵的光循環(huán)。跨膜電壓降的變化改變局部電化學(xué)電位從而使質(zhì)子(f)位于希夫堿基上，從而改變酸堿平衡。視黃醛的吸收光譜和熒光取決于希夫堿基的質(zhì)子化狀態(tài):質(zhì)子化形式是有熒光，去質(zhì)子化形式則沒(méi)有熒光的。通過(guò)測(cè)定熒光確定跨膜電壓。圖2A-2D顯示GPR D97N是跨膜蛋白，其顯示強(qiáng)耐光和環(huán)境靈敏的熒光。表達(dá)GPR D97N的大腸桿菌細(xì)胞在633nm波長(zhǎng)下受激發(fā)且通過(guò)在660 - 760nm之間的GPR D97N發(fā)射的滅光成像。蛋白位于細(xì)胞外圍的蛋白可以作為跨 旲蛋白。圖2Α顯不ρΗ7和pHlI時(shí)GPR D97N在整個(gè)大腸桿菌的可見(jiàn)吸收光譜；圖2B顯示pH7和pHll時(shí)溶于辛基葡萄糖苷的純化GPR D97N蛋白的熒光發(fā)射光譜；圖2C顯示在相同光照條件下GPR D97N和有機(jī)染料Alexa647(分子探針)的光漂白作用曲線。圖2D顯示通過(guò)可見(jiàn)吸收監(jiān)測(cè)的野生型和GPRD97N突變體中希夫堿的pH滴定。D97N突變體的pKa是9.8，野生型蛋白的pKa是>12。圖3顯示GPR D97N發(fā)揮體內(nèi)和體外pH功能的熒光強(qiáng)度。在兩種情況下，由于希夫堿基的去質(zhì)子化在高PH時(shí)熒光減弱。測(cè)定大腸桿菌細(xì)胞的PKa值，其通過(guò)附加羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)使質(zhì)子可以滲透細(xì)胞膜。這樣的處理是有必要的，因?yàn)橘|(zhì)子從細(xì)胞質(zhì)一側(cè)連接于希夫堿基，·在沒(méi)有CCCP時(shí)，細(xì)胞在細(xì)胞外pH浮動(dòng)的情況下可維持穩(wěn)定的細(xì)胞質(zhì)pH。由于細(xì)胞內(nèi)的局部環(huán)境影響，細(xì)胞內(nèi)和純化蛋白內(nèi)的pKa不同。圖4A和圖4B顯示在表達(dá)GPRD97N的大腸桿菌中的熒光閃爍。圖4A顯示ρΗ7.5時(shí)3個(gè)大腸桿菌的攝影軟片。每次暴露100ms。單個(gè)細(xì)胞的亮度隨時(shí)間變化。圖4B顯示PH7.5時(shí)單個(gè)細(xì)胞的閃爍圖像。每個(gè)痕跡是50秒(s)的記錄強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的時(shí)間在右側(cè)顯示。在I小時(shí)的實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞持續(xù)閃爍。相同細(xì)胞顯示為快速閃爍(O和7分鐘)，緩慢閃爍(28分鐘)和‘鈴聲’行為(18分鐘)。圖5顯示含有古細(xì)菌視紫紅質(zhì)3 (Arch3，在一些情況下也稱Ar-3)的制粒的圖，如在合成生物學(xué)網(wǎng)站中所描述的(合成神經(jīng)生物學(xué)的網(wǎng)址為org/protocol s/protocoldetail/36/10)(world wide web at synthetic neuro biology.0rg/protocols/protocoldetai1/36/10)。圖6A-6E顯不Arch是突光電壓指不器。圖6A顯不Arch作為電壓傳感器的模型。pH和膜電位均可改變希夫堿基的質(zhì)子化。所示晶體結(jié)構(gòu)為細(xì)菌視紫質(zhì)。Arch的結(jié)構(gòu)尚不明確。圖6B顯示純化的Arch在中性的、高pH時(shí)的吸收光譜(實(shí)線)和熒光發(fā)射光譜(發(fā)射譜見(jiàn)虛線)。圖6C上圖顯示表達(dá)Arch的HEK細(xì)胞，通過(guò)Arch熒光是可見(jiàn)的。圖6C下圖顯示電壓依賴性熒光的像素權(quán)重矩陣區(qū)。標(biāo)尺10 μ m。圖6D顯示Arch發(fā)揮膜電位功能的熒光。熒光值在_150mV時(shí)分開(kāi)。圖6E顯示膜電位在_70mV和+30mV之間Arch的階梯狀動(dòng)態(tài)響應(yīng)。上升和下降邊緣的突增是電子補(bǔ)償電路的人為產(chǎn)物。數(shù)據(jù)是20個(gè)循環(huán)的平均。插入圖顯示在低于0.5ms分辨率的顯像系統(tǒng)中的瞬態(tài)特性。圖7A-7D顯示Arch3WT動(dòng)作電位的光學(xué)記錄。表達(dá)Arch-GFP的培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元通過(guò)GFP熒光成像。Arch熒光顯示為藍(lán)綠色，電壓依賴性熒光區(qū)顯示為紅色。圖7A顯示在一連串動(dòng)作電位的單個(gè)實(shí)驗(yàn)記錄中，通過(guò)直流電壓記錄(下圖，虛線)和加權(quán)Arch3突光(上圖，實(shí)線)測(cè)定的整個(gè)細(xì)胞膜電位。插入圖是在單個(gè)細(xì)胞中269個(gè)脈沖響應(yīng)的平均峰值，用電壓(虛線)和熒光(實(shí)線)表示。圖7B顯示單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)脈沖序列記錄。將注入電流200pA (黑色虛線表示)應(yīng)用于表達(dá)Arch WT的神經(jīng)元。通過(guò)多重電流注入的熒光容易地檢測(cè)動(dòng)作電位(灰線表示)。圖7C顯示動(dòng)作電位的亞細(xì)胞定位。我們以一個(gè)表達(dá)Arch的神經(jīng)突起的影像并制作指示像素的權(quán)重矩陣，如圖中顯示的圖像，其熒光隨著紅色記錄電位共同變化，覆蓋在紫色的時(shí)間平均的Arch熒光。我們檢測(cè)電活性細(xì)胞中的亞細(xì)胞區(qū)。該圖頂部顯示由每個(gè)指示區(qū)域?qū)?yīng)熒光(F)測(cè)定的動(dòng)作電位時(shí)間過(guò)程(均值除以n=100脈沖)。圖中還顯示動(dòng)作電位的電子記錄(V,圖底部)。圖7D顯示一個(gè)神經(jīng)元中動(dòng)作電位的異質(zhì)動(dòng)態(tài)學(xué)，通過(guò)n=33脈沖的均值計(jì)算得來(lái)。像素圖中的箭頭標(biāo)注的區(qū)域(見(jiàn)圖片)滯后于其他細(xì)胞約 Ims (黑色箭頭)。標(biāo)尺5μηι。圖8A-8D表明Arch D95N顯示具有電壓依賴性熒光而不是光電流。圖8Α顯示在Arch3WT和Arch3D95N突變體中的光電流，在固定為V=O的HEK細(xì)胞中表達(dá)。用波長(zhǎng)λ =640nm，1800ff/cm2的光脈沖照射細(xì)胞。圖8B顯示Arch D95N熒光在_150mV和+150mV之間增加3倍，從-120mV到+120mV接近于線性靈敏度。插圖顯示電壓靈敏度圖片。標(biāo)尺5 μ m。圖8C顯示瞬態(tài)特性，其包含快于500 μ s的組分(響應(yīng)的20%)和恒定41ms的組分。圖8D顯示Arch D95N提供膜電位的準(zhǔn)確估計(jì)，清楚的分辨電壓梯度為10mV，從帶有噪聲熒光對(duì)整個(gè)時(shí)間量程<12s準(zhǔn)確度為260 μ V/(Hz)1/2進(jìn)行電壓估計(jì)。圖9A-9C顯示用ArchD95N的動(dòng)作電位的光學(xué)記錄。圖9A顯示電子記錄的表達(dá)Arch WT的神經(jīng)元膜電位,其經(jīng)過(guò)電流注入脈沖和激光照射(I=1800W/cm2, λ =640nm)。當(dāng)細(xì)胞接近閾值時(shí)，照明產(chǎn)生了足夠的光電流以抑制動(dòng)作電位。灰色的條帶指激光照射。在表達(dá)Arch D95N的神經(jīng)元上圖9B與圖9A相同，顯示照明對(duì)脈沖或靜息電位無(wú)影響。我們提供了表達(dá)Arch D95N的神經(jīng)元，顯示Arch D95N熒光(試驗(yàn)中用藍(lán)綠色顯示)和電壓依賴熒光區(qū)域(實(shí)驗(yàn)中用紅色顯示)。圖9C顯示一連串動(dòng)作電位序列的單個(gè)實(shí)驗(yàn)記錄中，通過(guò)電子記錄和權(quán)重的ArchD95N熒光(頂部，熒光線)確定整個(gè)細(xì)胞膜電位(底部，電壓線)。圖10顯示現(xiàn)有的基因編碼的熒光電壓指示器，根據(jù)其靈敏度和速度分類-兩個(gè)決定指示器性能的關(guān)鍵參數(shù)。VSFPs，F(xiàn)LARE和SPARC代表基于GFP同系物與膜蛋白的融合的指示器。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)的的示例性蛋白是變形菌視紫紅質(zhì)光學(xué)質(zhì)子傳感器(PROPS) ,Arch3WT,和Arch3D95N，在右上側(cè)顯示。PROPS在細(xì)菌中發(fā)揮作用，而Arch3WT和Arch3D95N在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用。注意對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸?；诩?xì)菌視紫紅質(zhì)的電壓指示器比其他指示器更靈敏，更迅速。圖11A-11D顯示在表達(dá)Arch3D95N - eGFP的單個(gè)HL-1小鼠心肌細(xì)胞中動(dòng)作電位的光學(xué)記錄。記錄動(dòng)作電位至多為1000s，不具有光毒性信號(hào)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是采用基因編碼電壓指示器首次定量測(cè)定心臟動(dòng)作電位。我們顯示了在D95N-GFP融合體中展示Arch D95N和GFP熒光的外罩。圖1lA顯示膜片箝記錄(虛線)和熒光(實(shí)線)測(cè)定的動(dòng)作電位的比較。圖11B-11D顯示在不斷增加的長(zhǎng)間隔中單個(gè)HL-1細(xì)胞中的動(dòng)作電位的光學(xué)記錄。IlD中的數(shù)據(jù)已校正光漂白作用。圖12顯示表達(dá)Arch3D95N-eGFP的人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)衍生的心肌細(xì)胞中動(dòng)作電位的光學(xué)記錄。人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)由細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有限公司(CellularDynamics Inc.)提供。細(xì)胞在MatTek皿中以每平方厘米上20000，50000或75000的細(xì)胞的密度進(jìn)行培養(yǎng)，其中該培養(yǎng)皿涂有0.1%明膠。這些條件顯示細(xì)胞是稀疏且不自發(fā)搏動(dòng)的(20K)，融合單分子層是自發(fā)搏動(dòng)(50K)的，和密集的單分子層(75K)。iPS細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保持48小時(shí)，且其后每48小時(shí)供給維持培養(yǎng)基(均來(lái)自細(xì)胞動(dòng)力學(xué)公司)(Cellular Dynamics Inc.)。根據(jù)生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)使用Mirus LT-1轉(zhuǎn)染iPS細(xì)胞。在包括20uL OPT1-MEM 的試管中，加入200ng的DNA和1.2uL的LT-1轉(zhuǎn)染試劑。DNA混合物在室溫下孵化20分鐘。孵化過(guò)程中，將新鮮的維持培養(yǎng)基附加到iPS細(xì)胞中，DNA混合物滴加到平皿中。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的48小時(shí)到96小時(shí)成像。我們觀察到毗鄰細(xì)胞的同步搏動(dòng)，表明VIPs可探測(cè)細(xì)胞間的傳導(dǎo)。我們持續(xù)記錄10分鐘以上，幾乎沒(méi)有光毒性。如對(duì)該種群期望的，在細(xì)胞種群內(nèi)，我們觀察到了與心室的，心房的，和節(jié)的細(xì)胞的動(dòng)作電位相匹配的細(xì)胞。藥物的附加導(dǎo)致動(dòng)作電位波形變化，該變化與常規(guī)膜片箝報(bào)告的記錄變化相匹配。在熒光對(duì)比時(shí)間的圖片中細(xì)胞I熒光信息為實(shí)線，細(xì)胞2熒光為虛線。圖13實(shí)驗(yàn)證明了 VIPs與GFP同系物融合蛋白構(gòu)建體的開(kāi)發(fā)的一系列改進(jìn)的電壓指示器。每個(gè)條狀的長(zhǎng)度表明蛋白序列或接頭區(qū)域的長(zhǎng)度。顏色表明相應(yīng)蛋白熒光的顏色。所有的構(gòu)建體用Arch WT和Arch D95N骨架進(jìn)行構(gòu)建。該構(gòu)建體的序列在下面的序列表提供:
權(quán)利要求
1.一種在表達(dá)編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的細(xì)胞中測(cè)定膜電位的方法，該方法包括如下步驟: a)用至少一個(gè)波長(zhǎng)的光體外激發(fā)至少一個(gè)包含編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的細(xì)胞；和 b)體外檢測(cè)來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞的至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)，其中與參考相比，通過(guò)至少一個(gè)細(xì)胞的發(fā)射熒光強(qiáng)度水平指示細(xì)胞膜電位。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，與源自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比，其離子泵活性降低。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)包括鄰近希夫堿基的突變質(zhì)子受體。
4.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是變形菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的成員。
5.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的成員。
6.如前述 權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)波長(zhǎng)是在λ=594-645ηπι之間的波長(zhǎng)。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中細(xì)胞是原核細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)中的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。.
9.如權(quán)利要求8中的方法，其中真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求8中的方法，其中真核細(xì)胞是干細(xì)胞或多能細(xì)胞或祖細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求8中的方法，其中真核細(xì)胞是誘導(dǎo)多能細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求8中的方法，其中真核細(xì)胞是神經(jīng)元。
13.如權(quán)利要求8中的方法，其中真核細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，還包括將載體體外轉(zhuǎn)染給至少一個(gè)細(xì)胞的步驟，所述載體包含編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸。
15.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸與細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子可操作地連接啟動(dòng)子。
16.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜-靶向的核酸序列。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質(zhì)膜靶向核酸序列。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亞細(xì)胞區(qū)室靶向核酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中亞細(xì)胞區(qū)室是選自于線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。
20.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加額外的熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中至少一個(gè)附加額外的熒光蛋白是能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白是鈣指示器。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白是pH指示器。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白能夠進(jìn)行非放射性熒光共振，使能量轉(zhuǎn)移到細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。
26.如權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)所述的方法,其中突光蛋白的亮度對(duì)膜電位或局部化學(xué)環(huán)境不敏感。
27.如權(quán)利要求20-26任一項(xiàng)所述的方法還包括如下步驟:采用至少第一和第二波長(zhǎng)的光體外激發(fā)至少一個(gè)細(xì)胞；和體外檢測(cè)至少第一和第二光學(xué)信號(hào)，該信號(hào)由來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞的至少的第一和第二波長(zhǎng)的激發(fā)引起。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中第二波長(zhǎng)在λ=447-594nm之間。
29.如權(quán)利要求26-28任一項(xiàng)所述的方法，還包括如下步驟:計(jì)算細(xì)菌視紫紅質(zhì)的熒光發(fā)射與至少一個(gè)附加熒光蛋白的熒光發(fā)射的比率，以獲取不依賴于表達(dá)水平差異的膜電位測(cè)定。
30.如如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法還包括將至少一個(gè)細(xì)胞在體外暴露于能夠或預(yù)期能夠改變膜電位的刺激的步驟。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中刺激是候選試劑。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中刺激是細(xì)胞培養(yǎng)基組分的變化。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中刺激是電流。
34.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括在第一和至少第二時(shí)間點(diǎn)體外測(cè)定至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)的步驟。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中第一時(shí)間點(diǎn)是在將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之前，至少第二時(shí)間點(diǎn)是將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之后。
36.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法包括多個(gè)細(xì)胞。
37.一種分離和純化的核酸，其編碼古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的修飾成員，與來(lái)自于古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的天然成員相比，離子泵活性降低。
38.如權(quán)利要求37所述的分離和純化的核酸，古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的修飾成員包括鄰近希夫堿基的突變質(zhì)子受體。
39.如權(quán)利要求37-38任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸，其可操作地連接于編碼膜靶向核酸序列的核酸序列。
40.如權(quán)利要求39所述的分離和純化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是質(zhì)膜靶向的核酸序列。
41.如權(quán)利要求39所述的分離和純化的核酸，其中膜靶向的核酸序列是亞細(xì)胞膜靶向的核酸序列。
42.如權(quán)利要求41所述的分離和純化的核酸，其中亞細(xì)胞膜是線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。
43.如權(quán)利要求37-42任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸，其與細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子可操作地連接啟動(dòng)子。
44.如權(quán)利要求37-43任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸，其可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。
45.如權(quán)利要求44所述的分離和純化的核酸，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。
46.如權(quán)利要求45所述的分離和純化的核酸，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白。
47.如權(quán)利要求46所述的分離和純化的核酸，能夠指示離子濃度的熒光蛋白是鈣指示器。
48.如權(quán)利要求46所述的分離和純化的核酸，能夠指示離子濃度的熒光蛋白是pH指示器。
49.如權(quán)利要求44-45所述的分離和純化的核酸，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是能夠進(jìn)行非放射性熒光共振，使能量轉(zhuǎn)移到細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。
50.如權(quán)利要求37-49任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸，其進(jìn)一步包括載體。
51.如權(quán)利要求50所述的分離和純化的核酸，其中載體是病毒載體。
52.如權(quán)利要求51所述的分離和純化的核酸，其中病毒載體是慢病毒載體。
53.如權(quán)利要求51所述的分離和純化的核酸,其中病毒載體是腺相關(guān)病毒載體。
54.一種試劑盒，包括在容器中的權(quán)利要求37-53任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸。
55.一種分離細(xì)胞，其包括編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，與來(lái)自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比，離子泵活性降低。
56.如權(quán)利要求55所述的分離細(xì)胞，其中修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白包括鄰近希夫堿基的突變質(zhì)子受體。
57.如權(quán)利要求55-56任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)是變形菌視紫紅質(zhì)家族的成員。
58.如權(quán)利要求55-56任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)是古細(xì)菌視紫紅質(zhì)家族的成員。
59.如權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。
60.如權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)胞是原核細(xì)胞。
61.如權(quán)利要求55-60任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)基因可操作地連接于啟動(dòng)子。
62.如權(quán)利要求61所述的分離細(xì)胞，其中啟動(dòng)子是細(xì)胞型特異性的啟動(dòng)子。
63.如權(quán)利要求55-62任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜靶向的核酸序列。
64.如權(quán)利要求63所述的分離細(xì)胞，其中膜靶向核酸是質(zhì)膜靶向的核酸序列。
65.如權(quán)利要求63所述的分離細(xì)胞，其中膜靶向性核酸是亞細(xì)胞區(qū)室-靶向的核酸序列。
66.如權(quán)利要求65所述的分離細(xì)胞，其中亞細(xì)胞區(qū)室是選自于線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。
67.如權(quán)利要求55-66任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中編碼修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。
68.如權(quán)利要求67所述的分離細(xì)胞，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。
69.如權(quán)利要求67-68任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是能夠進(jìn)行非放射性熒光共振，使能量轉(zhuǎn)移到細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。
70.如權(quán)利要求67-68任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白的亮度是對(duì)膜電位或局部化學(xué)環(huán)境不敏感的熒光蛋白。
71.如權(quán)利要求67-68任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白。
72.如權(quán)利要求71所述的分離細(xì)胞，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白，是鈣指示器。
73.如權(quán)利要求71所述的分離細(xì)胞，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白是pH指示器。
74.如權(quán)利要求55-73任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)胞是干細(xì)胞，多能細(xì)胞，或誘導(dǎo)多能細(xì)胞，或其分化或未分化的子代細(xì)胞。
75.如權(quán)利要求55-73任一項(xiàng)所述的分離細(xì)胞，其中細(xì)胞是分化細(xì)胞。
76.如權(quán)利要求75所述的分離細(xì)胞,其中分化細(xì)胞是神經(jīng)元。
77.如權(quán)利要求75所述的分離細(xì)胞，其中分化細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
78.一種分離細(xì)胞，其含有權(quán)利要求37-53任一項(xiàng)所述分離和純化的核酸。
79.—種試劑盒，含有權(quán)利要求55-78任一項(xiàng)所述的在合適的細(xì)胞培養(yǎng)基上的多個(gè)細(xì)胞和容器。
80.一種用于膜電位光學(xué)測(cè)定的工程細(xì)胞的生產(chǎn)方法，包含采用編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的步驟。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，相比于天然細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，其離子泵活性降低。
82.如權(quán)利要求80-81任一項(xiàng)所述的方法，其中修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)包括突變的鄰近希夫堿基的質(zhì)子受體。
83.如權(quán)利要求80-82任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜靶向核酸序列。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質(zhì)膜靶向的核酸序列。
85.如權(quán)利要求83所述的方法，其中膜靶向性的核酸序列是亞細(xì)胞膜靶向的核酸序列。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中亞細(xì)胞膜是線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。
87.如權(quán)利要求82-86任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸與細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子可操作地連接啟動(dòng)子。
88.如權(quán)利要求80-87任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加熒光蛋白或生色團(tuán)的附加核酸。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。
90.如權(quán)利要求88-89任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中能夠指示細(xì)胞內(nèi)的離子濃度的至少一個(gè)附加熒光蛋白是鈣指示器。
92.如權(quán)利要求90所述的方法，其中能夠指示細(xì)胞內(nèi)的離子濃度的至少一個(gè)附加熒光蛋白是PH指示器。
93.如權(quán)利要求80-92任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是分化細(xì)胞。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中分化細(xì)胞是神經(jīng)元。
95.如權(quán)利要求93所述的方法，其中分化細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
96.如權(quán)利要求80-92任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是多能細(xì)胞，干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
97.如權(quán)利要求96所述的方法，進(jìn)一步包括多能細(xì)胞，干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為分化細(xì)胞的步驟。
98.如權(quán)利要求80-97任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)實(shí)施。
99.如權(quán)利要求80-97任一項(xiàng)所述的方法，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)是采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來(lái)實(shí)施。
100.如權(quán)利要求80-99任一項(xiàng)所述的方法，其中采用權(quán)利要求37-53任一項(xiàng)所述的分離和純化的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
101.一種在表達(dá)編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的細(xì)胞中測(cè)定膜電位的方法，該方法包括步驟: a)用至少一個(gè)波長(zhǎng)的光激發(fā)至少一個(gè)包含編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸的細(xì)胞；和 b)檢測(cè)來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞 的至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)，其中與參考相比，由至少一個(gè)細(xì)胞的發(fā)射熒光強(qiáng)度水平指示細(xì)胞膜電位。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是修飾的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白，或與來(lái)自于天然的細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白相比，該蛋白離子泵活性降低。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)包括鄰近希夫堿基的突變的質(zhì)子受體。
104.如權(quán)利要求101-103任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是變形菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的成員。
105.如權(quán)利要求101-103任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白是古細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白家族的成員。
106.如權(quán)利要求101-105任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)波長(zhǎng)是在λ=594-645ηπι之間的波長(zhǎng)。
107.如權(quán)利要求101-106任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是原核細(xì)胞。
108.如權(quán)利要求101-106任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其中真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
110.如權(quán)利要求108所述的方法，其中真核細(xì)胞是干細(xì)胞或多能細(xì)胞或祖細(xì)胞。
111.如權(quán)利要求108所述的方法，其中真核細(xì)胞是誘導(dǎo)多能細(xì)胞。
112.如權(quán)利要求108所述的方法，其中真核細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
113.如權(quán)利要求108所述的方法，其中真核細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
114.如權(quán)利要求101-112任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括采用載體轉(zhuǎn)染至少一個(gè)細(xì)胞的步驟，所述載體包括編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸。
115.如權(quán)利要求101-114任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸與細(xì)胞型特異的啟動(dòng)子可操作地連接。
116.如權(quán)利要求101-115任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于膜靶向的核酸序列。
117.如權(quán)利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是質(zhì)膜靶向核酸序列。
118.如權(quán)利要求116所述的方法，其中膜靶向核酸序列是亞細(xì)胞區(qū)室靶向核酸序列。
119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中亞細(xì)胞區(qū)室是選自于線粒體膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，肌質(zhì)網(wǎng)，突觸小泡，內(nèi)涵體或吞噬小體。
120.如權(quán)利要求101-119任一項(xiàng)所述的方法，其中編碼細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白的核酸可操作地連接于編碼至少一個(gè)附加熒光蛋白或生色團(tuán)的核酸。
121.如權(quán)利要求120所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是能夠指示細(xì)胞內(nèi)離子濃度的熒光蛋白。
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白是鈣指示器。
123.如權(quán)利要求121所述的方法，其中能夠指示離子濃度的熒光蛋白是pH指示器。
124.如權(quán)利要求120所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白能夠進(jìn)行非放射性熒光共振，使能量轉(zhuǎn)移到細(xì)菌視紫紅質(zhì)，其能量轉(zhuǎn)移速率取決于膜電位。
125.如權(quán)利要求120所述的方法，其中至少一個(gè)附加熒光蛋白是綠色熒光蛋白或其同系物。
126.如權(quán)利要求120-125任一項(xiàng)所述的方法，其中熒光蛋白的亮度對(duì)膜電位或局部化學(xué)環(huán)境不敏感。
127.如權(quán)利要求120-126任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括如下步驟:采用至少第一和第二波長(zhǎng)的光體外激發(fā)至少一個(gè)細(xì)胞；和體外檢測(cè)至少第一和第二光學(xué)信號(hào)，該信號(hào)由來(lái)自至少一個(gè)細(xì)胞的至少第一和第二波長(zhǎng)的激發(fā)引起。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其中至少第二波長(zhǎng)在λ=447-594ηπι之間。
129.如權(quán)利要求120-128任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括如下步驟:計(jì)算細(xì)菌視紫紅質(zhì)的熒光發(fā)射與至少一個(gè)附加熒光蛋白的熒光發(fā)射的比率，以獲取不依賴于表達(dá)水平差異的膜電位測(cè)定。
130.如權(quán)利要求101-129任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括將體外至少一個(gè)細(xì)胞暴露于能夠或預(yù)期能夠改變膜電位的刺激的步驟。
131.如權(quán)利要求130所述的方法，其中刺激是候選試劑。
132.如權(quán)利要求130所述的方法，其中刺激是細(xì)胞培養(yǎng)基組分的變化。
133.如權(quán)利要求130所述的方法，其中刺激是電流。
134.如權(quán)利要求101-133任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在第一和至少第二時(shí)間點(diǎn)體外測(cè)定至少一個(gè)光學(xué)信號(hào)的步驟。
135.如權(quán)利要求134所述的方法，其中第一時(shí)間點(diǎn)是在將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之前，以及至少第二時(shí)間點(diǎn)是將至少一個(gè)細(xì)胞暴露于刺激之后。
136.如權(quán)利要求101-135任一項(xiàng)所述的方法，包括多個(gè)細(xì)胞。
137.如權(quán)利要求101-136任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是非人類細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供膜電位的光學(xué)測(cè)量方法，細(xì)胞和構(gòu)建體。這些方法可用于采用現(xiàn)有電極方法不可接觸到的細(xì)胞。本方法可用于，例如，高通量藥物篩選試驗(yàn)中測(cè)定能夠影響靶細(xì)胞膜電位的試劑。
文檔編號(hào)G01N33/50GK103168236SQ201180050734
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者亞當(dāng)·E·科恩, 喬爾·M·克拉利, 亞當(dāng)·D·道格拉斯 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)管理委員會(huì)