專利名稱：殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于納米材料用于標記生物及生物體系的分析檢測技術領域，更具體涉及 一種殼聚糖-量子點熒光探針用于狗腎細胞標記的方法，通過對細胞組分以及亞細胞結構 的標記，可以用于的細胞的生理活動研究，也可用于細胞內外各類受體的運輸途徑研究及 外源性污染物與細胞相互作用的研究。
背景技術：
殼聚糖是由甲殼素脫去乙?；漠a物，其大分子鏈上分布著許多羥基和氨基。殼 聚糖除具有多功能性、生物相容性、生物降解性，和低細胞毒性等優(yōu)越性之外，還具有獨特 的跨細胞膜能力。但是由于殼聚糖只溶于稀酸和某些特定的溶劑，大大限制了它的應用。羧 甲基殼聚糖是殼聚糖經羧甲基化反應后的形成的一類甲殼素衍生物，由于羧甲基殼聚糖上 所含的-C00-降低了 -NH3+的電荷密度，使得羧甲基殼聚糖的細胞毒性降低，具有比殼聚糖 更好的細胞相容性；并且由于羧甲基殼聚糖溶于水，擴展了它的應用范圍。量子點(Quantum dots, QDs) 又稱半導體納米微晶體(Semiconductor nanocrystals)，是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類半導體納米粒子。量子點具有一 般納米微粒的基本性質如表面效應、體積效應和量子尺寸效應，具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā) 射光譜、可精確調諧的發(fā)射波長、可忽略的光漂白等優(yōu)越的熒光特性。正是基于量子點獨特 的光學性質使得它在生物化學、分子生物學、細胞生物學、基因組學以及蛋白質組學等研究 中有著極大的應用前景。但是作為一種納米材料，由于自身的物理化學性質和環(huán)境因素的 影響，量子點在應用的過程中也表現出了一定的生物毒性效應，如何提高量子點熒光探針 的穩(wěn)定性和生物相容性是目前迫切需要解決的問題。狗腎細胞通常用于流感病毒的分離與鑒定，1958年從正常的雄性考克斯班尼犬的 腎臟建立了該細胞系。該細胞系是一種小犬腎細胞，其特點是細胞匯合后表達分化的上皮 細胞特性，易于培養(yǎng)和傳代。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對目前各類量子點熒光探針在應用上的缺陷，提供了一種殼 聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，把羧甲基殼聚糖良好的細胞相容性和量子點 優(yōu)越的熒光性能結合起來，利用它們在水相通過自組裝形成熒光探針，然后用于細胞標記。 用熒光顯微鏡觀察狗腎細胞的標記情況，用流式細胞儀檢測培養(yǎng)皿中狗腎細胞的平均熒光 強度。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細胞毒性，可 用于細胞的長時間的觀測。為了實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施
本發(fā)明的基本構思是根據羧甲基殼聚糖和CdTe量子點自身的特性，在水相通過自組 裝形成殼聚糖_量子點熒光探針，將該熒光探針與狗腎細胞在DMEM營養(yǎng)液中、于37°C、5% 體積分數的CO2細胞培養(yǎng)箱(下同)中共同孵育，殼聚糖_量子點熒光探針通過狗腎細胞的
3胞飲、胞吞或吞噬等方式進入細胞內部，與細胞中的蛋白質結合，達到對狗腎細胞進行熒光 標記的目的?！N殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，包括如下步驟
1、配制0.0000025-0. 001mol/L的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液(羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH 溶液調整其PH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉入聚四 氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶液冷卻至室溫 20-25°C，即可得到CdTe量子點溶液。根據微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將 會由綠色逐漸變化為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應即 可生成相應熒光的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領域的普通技術人員不付出任 何創(chuàng)造性勞動均能制備)根據羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.廣5ml 的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的IOml容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用；所選用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點 在水相反應形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0.05%體積比的 EDTA-胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取1 X IO4^l X IO7的狗腎細胞接種到到細 胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標記的狗腎細胞。3、待步驟2狗腎細胞貼壁生長12 36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒 光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育6 48小時，即可得到帶有 熒光的狗腎細胞。棄去營養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液(PH=7. 4)洗滌2次，即可用熒光顯微鏡 觀察標記情況。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果
本發(fā)明的殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法操作簡便，細胞對熒光探 針的生物相容性好，熒光探針未顯示細胞毒性，標記后細胞的平均熒光強度及顏色可控，穩(wěn) 定時間長，不影響細胞的正常生長。細胞能夠根據需要標記為不同的顏色且細胞的熒光強 度穩(wěn)定。該方法可用于活細胞的較長時間(48小時)觀測及細胞的生理活動研究，也可用于 細胞內外各類受體的運輸途徑研究及外源性污染物與細胞相互作用的研究。


圖IA為綠色殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖IB為紅色殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖2A為未標記時狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2B為標記12小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2C為標記24小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2D為標記48小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。
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圖2E為殼聚糖_量子點熒光探針進入狗腎細胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進入細胞到充滿整個細胞的過程)熒光照片示意圖。圖2F為殼聚糖_量子點熒光探針進入狗腎細胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進入細胞到充滿整個細胞的過程)明場照片示意圖。圖3A為流式細胞儀檢測未標記時狗腎細胞的平均熒光強度示意圖(陰性對照)。圖3B為流式細胞儀檢測用0. 00005mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均 熒光強度示意圖。圖3C為流式細胞儀檢測用0. 0001mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3D為流式細胞儀檢測用0. 00025mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3E為流式細胞儀檢測用0. 0005mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3F為流式細胞儀檢測用0. OOlmol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均熒
光強度示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，以下所述實施實例所用溶劑均為電阻率大于18 ΜΩ · cm的高純水，所用試劑均為分析純試劑。實施例1
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，包括如下步驟 1.配制0. 0005mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液 分別用移液管移取2. 5mL0. 002mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于 滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ · cm)定容，備用。所選用的殼聚 糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價結合、螯 合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；(羧甲基殼聚糖-CdTe量子點 自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH溶液調整其pH 值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉入聚四氟乙烯微波消解 罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶液冷卻至室溫20-25°C，即可得 到CdTe量子點溶液。根據微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將會由綠色逐漸變化 為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應即可生成相應熒光的羧 甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領域的普通技術人員不付出任何創(chuàng)造性勞動均能制
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取1 X IO6的狗腎細胞分別接種到2個細胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM(美國Gbico公司)營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。得到用于實施熒光標記的狗腎細胞。
3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞的標記
待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長18小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的綠色 和紅色殼聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育， 24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標記情況，結 果表明狗腎細胞已成功標記上綠色和紅色熒光(見圖IA和圖1B)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。實施例2:
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟如下
1.配制0.0001mol/L的的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液
用移液管移取0. 5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的 IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 M Ω · cm)定容，備用。所選用的殼聚糖-量子 點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價結合、螯合作用等 方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取1 X IO5的狗腎細胞接種到細胞培養(yǎng)皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用于實施熒光 標記的狗腎細胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞標記后形態(tài)學觀察 待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長28小時后，向培養(yǎng)皿中加入步驟1所述的殼聚
糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育。于0、12、 24,48小時用顯微鏡觀察細胞生長情況，結果表明標記后的狗腎細胞在(Γ48小時的時間內 均能正常貼壁生長，沒有出現溶脹、脫落及凋亡，說明細胞對熒光探針的生物相容性良好， 熒光探針未顯示細胞毒性(見圖2A、2B、2C、2D、2E、2F)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。其它步驟與實施例1相同。實施例3
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟如下
1.配制0、0· 00005,0. 0001,0. 00025,0. 0005,0. 001mol/L 的的羧甲基殼聚糖-CdTe 量 子點溶液
用移液管移取0、0. 25,0. 5,1. 25,2. 5、5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量 子點溶液于滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用。所選 用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價 結合、螯合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
6將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取1 X IO7的狗腎細胞分別接種到6個細胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用 于實施熒光標記的狗腎細胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞標記后細胞顯示不同的平均 熒光強度；
待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長24小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的殼 聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育，同時做陰 性對照。24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用0. 05%EDTA_胰蛋 白酶將培養(yǎng)皿上的細胞消化為單細胞懸浮液，置于載玻片上用熒光顯微鏡觀察標記情況， 同時用流式細胞儀檢測不同培養(yǎng)皿中狗腎細胞的平均熒光強度。結果表明狗腎細胞已成功 標記上熒光，并顯示出不同的熒光強度，隨熒光探針濃度的增加，細胞平均熒光強度由50 a. u.變化到5000 a. u.(見圖3A、3B、3C、3D、3E、3F)，說明可以通過改變熒光探針的濃度來 控制標記后細胞的熒光強度。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。其它步驟與實施例1相同。
權利要求
一種殼聚糖 量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟是A、配制0.0000025 0.001mol/L的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液根據羧甲基殼聚糖 CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液于滅菌的10ml容量瓶中，加入高純水，電阻率大于 18 MΩ·cm，定容，備用；B、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細胞用0.05%體積比的EDTA 胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取1×104~1×107的狗腎細胞接種到到細胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37℃、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標記的狗腎細胞；C、待步驟(B)狗腎細胞貼壁生長12~36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖 量子點熒光探針，于37℃、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育6~48小時，得到帶有熒光的狗腎細胞，棄去營養(yǎng)液，用pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標記情況。
2.根據權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡 合、共價結合、螯合方式自組裝形成。
3.根據權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的標記的細胞為狗腎細胞。
4.根據權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點制備過程如下，CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合 均勻后用NaOH溶液調整其pH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液，將此混 合液轉入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶 液冷卻至室溫，得到CdTe量子點溶液，將其與羧甲基殼聚糖溶液混合反應生成羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟是A、配制羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液根據羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的容量瓶中，加入高純水定容；B、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細胞用EDTA-胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數后取狗腎細胞接種到到細胞培養(yǎng)皿中，加入營養(yǎng)液，培養(yǎng)；C、待狗腎細胞貼壁生長后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒光探針，與狗腎細胞共同孵育，得到已標記上熒光的狗腎細胞。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細胞毒性，可用于細胞的長時間的觀測。
文檔編號G01N21/64GK101980005SQ201010512868
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2010年10月20日
發(fā)明者何振宇, 周培疆, 朱洪浩 申請人:武漢市疾病預防控制中心;武漢大學