一種馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò) 增引物組和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬來穿山甲（Manisjavanica)隸屬于鱗甲目、穿山甲科、穿山甲屬，主要分布于泰 國、馬來西亞、細(xì)甸、印尼、新加坡等地，生活在低海拔森林及次生林中。馬來穿山甲的鱗片 具有很高的藥用價值，近年來，過渡獵捕導(dǎo)致馬來穿山甲野生資源日益減少，已被IUCN列 為極危動物。為了保護(hù)野生資源，恢復(fù)馬來穿山甲野生種群數(shù)量，研究其種群遺傳結(jié)構(gòu)和野 生群體遺傳變異水平非常必要。
[0003] 分子標(biāo)記是在DNA水平上對遺傳多樣性的直接反映，具有數(shù)量多，多態(tài)性好，遺傳 穩(wěn)定等優(yōu)勢，是研究遺傳變異的理想方法。其中，線粒體基因組是一個非常有效的遺傳標(biāo) 記，與核基因組相比，線粒體基因組具有母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率快等獨(dú)特的遺傳特 性；與單個線粒體基因相比，線粒體基因組全序列能夠提供更為豐富的信息。
[0004] 因此，線粒體全基因組是進(jìn)行馬來穿山甲群體結(jié)構(gòu)和遺傳變異研究的有效工具， 建立一種擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體的有效方法對野生資源保護(hù)與利用有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組，利用該 擴(kuò)增引物組能夠特異性的擴(kuò)增出馬來穿山甲線粒體全基因組序列，為馬來穿山甲的保護(hù)遺 傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及其物種的分子鑒定提供基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明的馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組，其特征在于，包括下述5 對擴(kuò)增引物：
[0007]Lsc引物對：
[0008]LscF:5' -AGCGGTCAAATCCAGACTAAC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 1 所示）
[0009]LscR:5' -AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3'；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 2 所示）
[0010]Lee引物對：
[0011]LeeF:5' -CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 3 所示）
[0012] LeeR:5, -GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3' ；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 4 所示）
[001引Len引物對：
[0014]LenF:5, -GGCATAATCCTGTTCATTGTCT-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 5 所示）
[0015]LenR:5, -AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3'；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 6 所示）
[001引Lnc引物對：
[0017]LncF:5' -ACACAAACTATGAGCGAACCC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 7 所示） [001 引LncR:5' -AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3' ；（其核巧酸序列如沈QIDNO. 8 所示）
[001引Lcs引物對：
[0020]LcsF:5' -GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 9 所示） [00引]LcsR:5' -TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3'（其核巧酸序列如沈QIDNO. 10 所示）。
[0022] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的方法，其 特征在于，W馬來穿山甲全基因組DNA作為模板，W上述5對擴(kuò)增引物分別作為引物化進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物測序后，拼接得到馬來穿山甲線粒體全基因組序列 (其核巧酸序列如SEQIDNO. 11所示）。
[0023] 本發(fā)明的第Ξ個目的是提供上述馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組 在擴(kuò)增得到馬來穿山甲線粒體全基因組序列中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明建立擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體基因組的有效方法，利用該擴(kuò)增引物組能夠特 異性的擴(kuò)增出馬來穿山甲線粒體全基因組序列，為馬來穿山甲的保護(hù)遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué) 及其物種的分子鑒定提供基礎(chǔ)。
【具體實施方式】：
[00巧]W下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0026] 實施例1:
[0027] 本發(fā)明的馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物為5對，引物序列及擴(kuò)增范 圍如表1所示：
[002引表1 :馬來穿山甲線粒體基因組擴(kuò)增片段及引物
[0029]
[0030] (1)馬來穿山甲基因組DNA的提取
[0031] 剪取馬來穿山甲肌肉組織于2血離屯、管中，將組織剪碎，加800μL消化緩沖液， 10μL蛋白酶K(20mg/mL)，混勻后于55°C消化過夜。消化清透后，加入800μL飽和酪，輕 輕顛倒混勻20min，lOOOOg離屯、lOmin，抽提上清。加入400μL飽和酪，400μL氯仿/異戊 醇（24:1)，輕輕顛倒混勻20min，lOOOOg離屯、lOmin，抽提上清。加入800μL氯仿/異戊 醇（24:1)，輕輕顛倒混勻20min，10000g離屯、lOmin，抽提上清。加入ImL預(yù)冷的無水乙醇， 于-20°C冷凍化，12000g離屯、15min，棄上清。加預(yù)冷的70%乙醇，小屯、洗涂DNA沉淀兩次， 12000g離屯、5min，棄上清。驚干乙醇，加入50μL超純水溶解沉淀，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?獲得馬來穿山甲基因組DNA
[003引似PCR擴(kuò)增5個長片段
[0033] 線粒體基因組DNA片段用長PCR技術(shù)擴(kuò)增，長片段PCR擴(kuò)增體系為25μL包括約 lOng步驟（1)獲得的馬來穿山甲基因組DNA，2. 5μΙ10XLAPCRbufferΙΙ，0. 4mMdNTP， 上下游引物（表1中的5對引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，即用Lsc引物對、Lee引物對、Lcn引物 對、Lnc引物對和Lcs引物對分別進(jìn)行擴(kuò)增）各0. 4μM，1. 25ULATaq聚合酶燈akara)。 PCR擴(kuò)增條件為：首先94°C預(yù)變性4min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性 30sec，55°C退火30sec，72°C延伸2-4min，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物純化后直接進(jìn) 行雙向測序，然后設(shè)計中間測序引物，通過引物步移的方法逐步測通整個片段。測序結(jié)果 用sequencher4. 2(GeneCodes,AnnArbor,MI,USA)軟件拼接，先將每個長片段拼接完整， 再將五個長片段拼接起來，獲得完整的馬來穿山甲線粒體基因組全序列（其核巧酸序列如 SEQIDNO. 11所示），其結(jié)構(gòu)如表2所示。
[0034]Lsc引物對擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的第2280-6014bp，Lee引物對 擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的第5792-909化P、Lcn引物對擴(kuò)增馬來穿山甲線粒 體全基因組序列的第8850-11696bp、Lnc引物對擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的第 11155-14695bp和Lcs引物對擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的第14640-2324bp。
[0035] 表2馬來穿山甲線粒體基因組結(jié)構(gòu)
[0036]
[0037]
【主權(quán)項】
1. 一種馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組，其特征在于，包括下述5對擴(kuò) 增引物： Lsc引物對： LscF:5' -AGCGGTCAAATCCAGACTAAC-3' LscR:5' -AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3' ； Lee引物對： LeeF:5' -CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3' LeeR:5' -GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3' ； Len引物對： LenF:5' -GGCATAATCCTGTTCATTGTCT-3' LenR:5' -AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3' ； Lnc引物對： LncF:5' -ACACAAACTATGAGCGAACCC-3' LncR:5' -AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3' ； Lcs引物對： LcsF：5, -GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3, LcsR:5' -TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3'。2. -種擴(kuò)增馬來穿山甲線粒體全基因組序列的方法，其特征在于，以馬來穿山甲全基 因組DNA作為模板，以權(quán)利要求1所述的5對擴(kuò)增引物分別作為引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然 后將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物測序后，拼接得到馬來穿山甲線粒體全基因組序列。3. 權(quán)利要求1所述的馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組在擴(kuò)增得到馬來 穿山甲線粒體全基因組序列中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬來穿山甲線粒體全基因組序列的擴(kuò)增引物組和擴(kuò)增方法及其應(yīng)用。擴(kuò)增引物組包括下述5對擴(kuò)增引物：Lsc引物對：Lsc？F：5’-AGCGGTCAAATCCAGACTAA？C-3’，Lsc？R：5’-AGAATGGGGTCACCTCCTCC-3’；Lcc引物對：Lcc？F：5’-CGTCAATCCTTGGGGCTATC-3’，Lcc？R：5’-GCCTGGGTTATGTGGTTTCG-3’；Lcn引物對：Lcn？F：5’-G？GCATAATCCTGTTCATTGTCT-3’,Lcn？R：5’-AACGGGTGTCTGTCATCCTCT-3’；Lnc引物對：LncF：5’-ACACAAACTATGAGCGAACCC-3’,Lnc？R：5’-AGGATGAAGTGAAGAGCGAAG-3’；Lcs引物對：Lcs？F：5’-GGATTCTCGGTAGACAAAGC-3’,Lcs？R：5’-TCAATTAACGGATTATCTGGAC-3’。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/10
【公開號】CN105255872
【申請?zhí)枴緾N201510752411
【發(fā)明人】龔世平, 李偉業(yè), 滑溜帥, 葛研, 王付民, 侯方暉
【申請人】廣東省昆蟲研究所
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月4日