專利名稱：細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與應(yīng) 用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽白血病病毒囊膜糖蛋白基因(ALV-env)編碼的囊膜糖蛋白(erw)包括囊膜表面 蛋白gp85和穿膜蛋白gp37，兩者在宿主細(xì)胞內(nèi)先是形成gp85-gp37聚合前體蛋白，再經(jīng)加 工剪切形成成熟的囊膜糖蛋白gp85和gp37。ALV-env基因編碼的囊膜蛋白是該類病毒的 主要表面蛋白。該囊膜蛋白與靶細(xì)胞表面特異性受體相互識別、結(jié)合，是病毒進入靶細(xì)胞進 行復(fù)制、增殖所必需的。pLenti7. 3質(zhì)粒是Invitrogen公司利用HIV基因片段等構(gòu)成的慢病毒病毒真核表 達(dá)質(zhì)粒載體(Lentiviral vector)。pLenti7. 3質(zhì)?？蓪⒅亟M到其多克隆位點的目的基因 導(dǎo)入到被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞核并整合到宿主細(xì)胞染色體中。pLenti7. 3質(zhì)?？蓪⑵銱IV長末 端雜交啟動子(RSV/5’ LTR)到SV40pA之間的DNA序列轉(zhuǎn)錄成一條長的mRNA，然后反轉(zhuǎn)錄 成cDNA。此部分DNA序列在整合到宿主細(xì)胞染色體中后，在CMV啟動子的作用下可在宿主 細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄插入的目的基因，在細(xì)胞漿中表達(dá)目的基因；同時表達(dá)pLenti7. 3攜帶的綠 色熒光蛋白(EmGFP)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是將PCR擴增獲得的ALV-env基因與慢病毒表達(dá)載體重 組構(gòu)建一種可在細(xì)胞膜上表達(dá)ALV-env蛋白的熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒(pLenti7. 3/ ALV-env)，該質(zhì)粒含有ALV-env基因。本發(fā)明的另一個目的是細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒在制 備禽白血病假病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；其ALV-env蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒是利用含啟動序列的 特異性引物上游引物5，ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC 3，；下游引物 5，GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG 3，，通過PCR方法從禽白血病病毒基因組(從雞胚成纖維 細(xì)胞培養(yǎng)物中提取)擴增env基因。禽白血病env基因與商品化pLenti7. 3表達(dá)質(zhì)粒重 組，構(gòu)成細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒(pLenti7. 3/ALV-env)。含 有pLenti7. 3/ALV-env質(zhì)粒的大腸桿菌，已于2009年11月06日保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO :3415，分類命名大腸埃希氏菌 Escherichia coli0
本發(fā)明還包括上述細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光表達(dá)轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒在禽白血病假 病毒上的應(yīng)用。細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光表達(dá)轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(如HEK293細(xì) 胞)后，erw基因可表達(dá)禽白血病的囊膜蛋白，并定植到宿主細(xì)胞膜表面，同時在宿主細(xì)胞 漿中表達(dá)報告基因一綠色熒光蛋白。將ALV-env基因和綠色熒光蛋白基因(EmGFP)整合到 宿主細(xì)胞染色體中，并在宿主細(xì)胞膜表面表達(dá)出禽白血病的囊膜蛋白，同時在宿主細(xì)胞漿 中表達(dá)報告基因一綠色熒光蛋白。利用這種出現(xiàn)綠色熒光并在細(xì)胞膜上表達(dá)ALV-env蛋白 的HEK293細(xì)胞，借助輔助質(zhì)粒(pLPl、pLP2，Invitrogen公司)可制備禽白血病假病毒。制備出的假病毒可用于檢測禽白血病病毒(ALV-J亞型)的中和抗體當(dāng)待測樣本 中具有足夠量的抗ALV-J亞型中和抗體時，可阻止該假病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)樣本無抗 禽白血病病毒(ALV-J亞型)中和抗體或中和抗體較少時，該假病毒可與宿主細(xì)胞結(jié)合，24 小時后在熒光顯微鏡下檢測宿主細(xì)胞有無綠色熒光，如有可發(fā)出綠色熒光的宿主細(xì)胞則說 明樣本中沒有中和抗體，樣本檢測結(jié)果為陰性；如無可發(fā)出綠色熒光的宿主細(xì)胞(陰性對 照樣本細(xì)胞可發(fā)出熒光)細(xì)胞則說明樣本中有中和抗體，樣本檢測結(jié)果為陽性。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明構(gòu)建的pLenti7. 3/ALV-env質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共 同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，制備ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒進行中和試驗，避免了 活A(yù)LV病毒對環(huán)境的污染。由于假病毒可自發(fā)發(fā)熒光，在中和實驗中可以省略熒光抗體染 色部分，減少非特異性熒光反應(yīng)。


圖1通過PCR擴增的ALV-env基因電泳結(jié)果1是env擴增片段；M是DNA分子量 標(biāo)記 2K DNA Marker。圖2ALV-erw基因與Peasy-Tl克隆載體構(gòu)建的T-env酶切鑒定結(jié)果1是T-env克 隆單酶切；2是T-env雙酶切；3是DNA分子量標(biāo)記2K plus DNA Marker。圖3ALV-env基因pLenti7. 3載體構(gòu)建的pLenti7. 3/ALV-env酶切鑒定結(jié)果1是 ALV-env/ALV-env表達(dá)載體雙酶切產(chǎn)物；M是DNA分子量標(biāo)記15K DNA Marker。圖4細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖ALV-enV是插入 的外源基因，其余部分為pLenti7. 3載體。pLenti7. 3/ALV-env表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征如下HIV 長末端雜交啟動子(RSV/5，LTR hybrid promoter) :1_410RSV promoter :bases 1 229HIV-I 5，LTR :bases 230 410HIV 包裝信號(HIV-1 psi ( Ψ)packaging signal) :521 565HIV 反轉(zhuǎn)錄元件(HIV-1 Rev response element (RRE)) 1075 1308Cppt :bases 1801-1923CMV 啟動子(CMV promoter) 1935 2519禽白血病膜蛋白基因(ALV-env) :2570 4327V5 標(biāo)簽(V5 印itope) 4345 4386WPRE :bases 4405—5002
SV40 啟動子(SV40 promoter) 5013 5321綠色熒光蛋白基因(EmEMGFP) :5380 6099HIV 長末端重復(fù)序列(AU3/3，LTR) 6170 6404AU3 :bases 6170 62233' LTR :bases 6224 6404SV40 ^^ A(SV40 polyadenylation signal) 6476 6607S (Ampicillin(bla)resistance gene) 7565 ~ 8425質(zhì)粒骨架(pUCorigin) 8570 92439243 9650 原商品化載體中未注明部分。其中禽白血病膜蛋白基因(ALV-env)是本發(fā)明制備的基因，其余部分來自商品化 質(zhì)粒 pLenti7. 3。圖5表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后48小時熒光檢測結(jié)果發(fā)出熒光的細(xì)胞為已轉(zhuǎn)染 pLenti7. 3/ALV-env將要釋放假病毒的HEK293細(xì)胞。圖6中和試驗結(jié)果觀察為假病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合后培養(yǎng)24小時，在熒光顯微鏡 下觀察到的可發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，此時樣本為陰性。
具體實施例方式一、ALV-env基因的獲取利用含啟動序列的ALV-env特異性引物，通過PCR方法，自禽白血病病毒細(xì)胞培養(yǎng) 物中擴增禽白血病ALV-env基因。1、DNA摸板的提取將ALV-J病毒毒株接種于IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長成70% _80%的雞胚成纖維細(xì)胞 (CEF)單層。接種后細(xì)胞維持7-10天，收集接種病毒培養(yǎng)的細(xì)胞，按照以下程序提取組織 DNA 1)收集接種病毒的細(xì)胞瓶中細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)Hanks液輕輕吹打洗滌數(shù)次，然后每瓶 加入0. 25%胰酶0. 5 1. 0ml，37°C溫箱中放置5 lOmin，將細(xì)胞消化吹打后收集于5ml
離心管。2) IXPBS液洗滌，2000rpm離心沉淀轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中，然后加入300 μ 1抽 提液(lOOmmol/LNaCl，10mmol/L Tris. Cl PH 8. 0,25mmol/L EDTA pH 8· 0，0· 5% SDS)懸浮 后，加入蛋白酶Κ(100 μ g/ml)，55°C水浴中消化過夜。3)加入等體積的苯酚/氯仿溶液(苯酚氯仿異戊醇=25 24 1)約400μ 1 抽提一次，將上層液體轉(zhuǎn)移到另一 1. 5ml離心管中，加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉和2倍 體積無水乙醇后，置于_20°C冷卻2h或者更長時間。4)取出后12000rpm離心IOmin沉淀DNA，以70%乙醇懸浮DNA沉淀后，12000rpm 離心5 lOmin，棄去上清。5)經(jīng)乙醇沉淀后的DNA，空氣中室溫自然干燥后，溶解于50 μ 1體積的TE Buffer(IOmmol Tris-Cl, lmmol EDTA, pH 8. 0)中，核酸定量約為 50 IOOng/μ 1，即為 模板DNA，以用于擴增整合進細(xì)胞基因組的ALV-J的前病毒DNA模板。2、ALV-env 基因擴增
5
ALV-env基因特異性引物上游引物5，ATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCAC3下游引物5，GACAGCTGCTCCCTAATTCTATG3，PCR反應(yīng)體系如下ddH2015. 8μ L
15. 8μ L 2. 5μ L 2. 0μ L 2. Ομ L l.OyL l.OyL 0. 2μ L 1 μ LIOXBufferMgCl24dNTP上游引物(20ρΜ)下游引物(20ρΜ)Taq enzymeModel DNAPCR反應(yīng)程序如下94°C IOmini94°C Imin57 °C Imin72 °C 2min72 °C IOmin4°C 保存反應(yīng)結(jié)束后，進行瓊脂糖電泳，目的基因長度為1710bp，見附圖1。3、PCR 產(chǎn)物與 Peasy-Tl 克隆將擴增的PCR產(chǎn)物與與Peasy-Tl克隆載體連接，獲得T-env克隆載體。其構(gòu)建過 程是建立5微升連接體系PCR 產(chǎn)物0. 5 μ LPeasy-Tl4. 5 μ L連接體系室溫反應(yīng)10-15分鐘感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取5 μ L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞。挑取單陽性菌落，接種到含5mL LB (含100 μ g/mL)培養(yǎng)基的試管中，37°C震蕩培 養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶BamHl、Xhol酶切，利用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，見 到1710bp和3928bp兩條DNA片段，見附圖2。二、ALV-env 與 pLenti7. 3 連接利用限制性內(nèi)切酶BamHl、Xhol酶切T-env克隆載體。利用瓊脂糖凝膠進行 電泳，從膠上回收帶有粘性末端的ALV-env片斷。利用限制性內(nèi)切酶BamHl、Xhol酶切質(zhì)粒pLenti7. 3，將線形化的載體與從回收 的DNA片斷用T4DNA連接酶連接，得到細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒 pLenti7. 3/Alv-env 質(zhì)粒。其構(gòu)建過程是
T-env載體與pLenti7. 3表達(dá)載體雙酶切建立50微升酶切反應(yīng)體系BamHl2 μ LXhol2μ LIOXK Buffer5μ LPlasmid30 μ LddH20IlyL37°C水浴4h。電泳切膠回收。ALV-env片段與pLenti7. 3表達(dá)載體連接回收表達(dá)載體與ALV-env片段，建立連接反應(yīng)體系PCR 產(chǎn)物2 μ 1pLenti7. 38μ 1Solution I10 μ 116 °C連接過夜。5、轉(zhuǎn)化和增菌轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)，挑取單菌落，接種到含IOmL LB (含100 μ g/mL)培養(yǎng)基的試管 中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒后利用限制性內(nèi)切酶BamHl、Xhol酶切，利用瓊脂糖凝 膠進行電泳，見到1710bp和7935bp兩條DNA片段，見圖3。DNA序列測定，確認(rèn)ALV-env已 與pLenti7. 3表達(dá)載體重組，閱讀框架正確，獲得pLenti7. 3/ALV-env表達(dá)載體質(zhì)粒。6、增菌并提取質(zhì)粒大量培養(yǎng)，利用QIAGEN DNA質(zhì)粒純化試劑盒，提取質(zhì)粒，電泳鑒定。具體過程如 下(1)將篩選克隆重新劃板，挑取單菌落，接種到含IOmL LB培養(yǎng)基的試管中，37°C 震蕩培養(yǎng)過夜，取1培養(yǎng)物mL接種到含IOOmL LB (含100 μ g/mL)培養(yǎng)基的試管中，37°C震 蕩培養(yǎng)過夜，。(2)利用QIAGEN DNA質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒1)取30mL細(xì)菌培養(yǎng)物于50mL離心管中，離心使細(xì)菌沉淀。2)加ImL裂解液I，劇烈振蕩，懸浮菌體。3)加ImL裂解液11，輕輕混勻，冰浴不超過5分鐘。4)加ImL裂解液III，上下振蕩，冰浴10分鐘。5) 12000rpm 離心 lOmin，取上清夜。6)將上清裝入層析柱中，垂直靜置，待上清夜完全通過層析柱。7)加2mL洗脫，垂直靜置，待洗脫液完全通過層析柱。8)收集洗脫液，檢測DNA濃度，-20°C冰箱保存?zhèn)溆?。三、制備?xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白、細(xì)胞漿表達(dá)綠色熒光蛋白HEK293細(xì)胞將HEK293細(xì)胞接種24孔板，每孔Iml MEM+10% FBS (胎牛血清)，培養(yǎng)至70% 80%細(xì)胞融合。每孔加入脂質(zhì)體-DNA轉(zhuǎn)染液(pLenti7. 3/ALV-env 0.8μβ;，輔助質(zhì)粒 PLpl，PLp20. 8 μ g ；脂質(zhì)體2 μ g)表達(dá)質(zhì)粒混合溶液，稍稍震蕩混勻，于37°C、C025%的培養(yǎng) 箱里培養(yǎng)6小時，棄轉(zhuǎn)染液，每孔加入含10% FBS的DMEM Iml,60 72小時觀察可在宿主細(xì)胞漿中出現(xiàn)綠色熒光(激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長567nm)，見圖5。收集上清液，滴定 禽白血病假病毒滴度(ID5tl)。-20°C冰箱保存。該禽白血病假病毒可用于檢測禽白血病病 毒中和抗體的病毒效價。四、禽白血病假病毒的應(yīng)用連續(xù)稀釋測待檢血清樣本，用50 100*ID5Q禽白血病假病毒與等量的已稀釋的待 檢樣本混合，37°C孵育30分鐘，接種雞胚成纖維細(xì)胞，37°C孵育24 48小時。如果樣品中 含有足夠量的抗ALV-J亞型中和抗體時，可阻止該假病毒與雞胚成纖維細(xì)胞結(jié)合；當(dāng)樣本 無抗禽白血病病毒中和抗體或中和抗體較少時，該假病毒可與雞胚成纖維細(xì)胞結(jié)合。24小 時后在熒光顯微鏡下檢測雞胚成纖維細(xì)胞是否可發(fā)出綠色熒光，如觀察到可發(fā)出綠色熒光 的雞胚成纖維細(xì)胞則說明樣本中沒有足夠的中和抗體(如圖6)，樣本為陰性；如無可發(fā)出 綠色熒光的細(xì)胞(陰性對照樣本細(xì)胞可發(fā)出熒光)則說明樣本中有中和抗體，樣本為陽性。利用本發(fā)明構(gòu)建的pLenti7. 3/ALV-env質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，制 備ALV-J假病毒，可代替利用活的ALV-J病毒進行中和試驗，避免了活A(yù)LV病毒對環(huán)境的污 染。由于假病毒可自發(fā)熒光，在中和實驗中可以省略熒光抗體染色部分，減少非特異性熒光 反應(yīng)，并可節(jié)約時間和試劑。<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用<160>2<210>1<211>2932<212>DNA<213> 質(zhì)粒(Plasmid)<220><221>CDS<222>(1175).. (2932)<400>1
0128]ttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaat600129]acactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattgga1200130]attagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatat1800131]￡1￡1￡1￡Ι ￡Ι 0ataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtact2400132]ttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctccc3000133]aaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacag3600134]agacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaa4200135]aggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacat4800136]Q.CQ.Q.Q.CX^Q.Q.0·gaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgataagcttgg5400137]gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccc6000138]cgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccat6600139]tgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtat7200140]catatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat780
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395400 405
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410415420
aatttaacateattaatattgaatgcg ata ctg gag gat acg aac agt2491
AsnLeuThrSerLeulieLeuAsnAla lie Leu Glu Asp Thr Asn Ser
425430435
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440445450 455
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460465 470
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475480 485
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505510515
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540545 550
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MetTyrGlnPheMetAspGluArglie Arg Tyr His Arg lie Arg Glu
555560 565
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GlnLeuSerArgAlalieLeuGlnlie Ser lie Thr Leu Ala Ala Ala
570575580
Arg Tyr His Arg lie Arg Glu Gln Leu Ser Arg Ala lie Leu Gln Ile565570575Ser lie Thr Leu Ala Ala Ala Arg Val58058權(quán)利要求
一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；其ALV env蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒，其特征 在于該質(zhì)粒含有ALV-env基因。
3.一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于該質(zhì)粒 可用于制備禽白血病假病毒，按照本發(fā)明制備的禽白血病假病毒可用于禽白血病病毒中和 抗體的制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用，是將PCR擴增獲得的ALV-env基因與慢病毒表達(dá)載體重組構(gòu)建的一種可在細(xì)胞膜上表達(dá)ALV-env蛋白的熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有ALV-env基因。該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞后，可將ALV-env基因和綠色熒光蛋白基因(EmGFP)基因整合到宿主細(xì)胞染色體中，并在宿主細(xì)胞膜表面表達(dá)出禽白血病的囊膜蛋白，同時在宿主細(xì)胞漿中表達(dá)報告基因-綠色熒光蛋白。該膜表達(dá)ALV-env蛋白熒光真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)質(zhì)?？捎糜谥苽淝莅籽〖俨《荆苽涞那莅籽〖俨《究捎糜跈z測J-亞型禽白血病中和抗體。
文檔編號C07K16/10GK101935675SQ201010011630
公開日2011年1月5日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者崔治中, 常維山, 張振杰 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)