專利名稱：：使用核酸探針、微珠和熒光激活的細(xì)胞分選器(facs)檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒(hpv)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明概括地涉及診斷和檢測(cè)測(cè)定領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的一種或多種分析物的存在或區(qū)分它們的方法和試劑，包括生物芯片。
背景技術(shù)：
：在說明書的末尾，列出了在本申請(qǐng)中提供的參考文獻(xiàn)的著錄項(xiàng)目細(xì)節(jié)。本說明書中的任何現(xiàn)有技術(shù)不是、也不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是承認(rèn)或任何形式的暗示該現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家形成了普通一般知識(shí)的一部分。對(duì)在單一測(cè)定中快速且可靠地檢測(cè)多種分析物的篩選方法的需要，不僅在臨床診斷領(lǐng)域是關(guān)鍵的，而且還在篩選應(yīng)用，例如篩選環(huán)境毒素，和藥物篩選方面是關(guān)鍵的。迫切需要改進(jìn)的篩選方法和試劑的一個(gè)這樣的領(lǐng)域是感染性疾病領(lǐng)域。例如，世界上應(yīng)用于性傳播疾病(例如，人乳頭狀瘤病毒(HPV))的^貪斷檢測(cè)的保守估計(jì)是每年約20000000次檢測(cè)。許多現(xiàn)有的篩選感染性疾病的病因的檢測(cè)是耗時(shí)、費(fèi)力、昂貴的，且經(jīng)常僅對(duì)一種特定病原體是特異性的，和/或不能區(qū)分不同的病原體菌林。HPV是子宮頸癌的主要致病病原體。但是，HPV分類群包含許多病原體"菌林"，僅僅其中的一些與子宮頸癌和其它癌的發(fā)展有關(guān)。因此，通常將HPV菌抹分為"高危險(xiǎn)"菌林，包括13種菌抹，它們占子宮頸病例的約98%，或"低危險(xiǎn)"菌抹，它們通常與子宮頸癌的發(fā)展無(wú)關(guān)。目前，通過巴氏涂片檢測(cè)子宮頸癌。在該技術(shù)中，通過刮術(shù)或洗滌，從子宮頸收集細(xì)胞。然后，將這些細(xì)胞置于顯微鏡載玻片上，制成"涂片，，。病理學(xué)家再檢查載玻片，尋找異常的細(xì)胞。但是，巴氏涂片對(duì)于明確地確定子宮頸癌危險(xiǎn)是有些不令人滿意的測(cè)定，因?yàn)樵摷夹g(shù)具有約20%的假陰性率，且該技術(shù)不能區(qū)分"高危險(xiǎn)"和"低危險(xiǎn)"分類群。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種檢測(cè)測(cè)定，它能檢測(cè)樣品中的分析物，和/或區(qū)分許多不同的分析物。而且，與有些現(xiàn)有的檢測(cè)測(cè)定相比，本文所述的本發(fā)明的試劑和方法是相對(duì)快速且低廉的。
發(fā)明內(nèi)容在本說明書和所附權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，詞語(yǔ)"包含"和變體，例如"包括"和"含有"，應(yīng)當(dāng)理解為表示包含所述的整體或步驟或組的整體或完整的步驟，但是不排除任何其它整體或步驟或組的整體或完整的步驟。通過序列標(biāo)識(shí)號(hào)(SEQIDNO:)指示核苷酸和氨基酸序列。SEQIDNO:在數(shù)字上與序列標(biāo)識(shí)<400〉1(SEQIDN0:1)、<400>2(SEQIDNO:2)等相對(duì)應(yīng)。在表1中提供了序列標(biāo)識(shí)的總結(jié)。在權(quán)利要求書后提供了序列表。本發(fā)明提供了測(cè)定，其能檢測(cè)一種或多種分析物，和/或能區(qū)分一類分析物中不同成員。更具體地，使用基于分析物和測(cè)定組分的性質(zhì)的多重分析來識(shí)別或區(qū)分分析物。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于檢測(cè)一種或多種分析物和/或用于區(qū)分一類分析物中的兩個(gè)或多個(gè)成員的珠子集合(beedset),其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中'.(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會(huì)與待測(cè)樣品中的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和分析物辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份(subsetidentity)，并從而識(shí)別珠子已經(jīng)偶聯(lián)的反應(yīng)物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明設(shè)想到檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種分析物的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸對(duì)目標(biāo)分析物特異性的珠子集合；(b)在足以允許所述樣品中的分析物與所述珠子集合內(nèi)的珠子上的反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間；和(c)檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中結(jié)合到所述珠子的反應(yīng)物上的分析物。在一個(gè)相關(guān)的方面，反應(yīng)物可以標(biāo)有一種或多種熒光染料，其進(jìn)一步允許區(qū)分一類分析物中的不同成員。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了方法和珠子集合，其能檢測(cè)和/或區(qū)分生物樣品內(nèi)的分析物，其中所述分析物是對(duì)傳染性病原體特異性的。本文考慮到的生物樣品包括血液，血清，唾液，糞便，尿，組織液，精液，滲出物，膿汁，呼吸液，和粘液和來自局部瘍、癌癥和損傷的擦樣。術(shù)語(yǔ)"病原體，，指感染或寄居樣品的微生物或病毒。示例性病原體包括病毒，細(xì)菌，真菌和真核微生物。病毒包括慢病毒屬(例如AIDS病毒，HIV-I，HIV-II，HTLV-IV)，逆轉(zhuǎn)錄病毒和禽流感病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，"病原體"包括微生物或病毒，它會(huì)感染多細(xì)胞生物，例如動(dòng)物或植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將分析物視作動(dòng)物或植物病原體。但是，本發(fā)明包括寄居多細(xì)胞生物的非病原性物質(zhì)(例如共生生物，內(nèi)生植物，胃腸寄生物等)的檢測(cè)和/或區(qū)分。本發(fā)明的方法也適用于樣品中指示治療性試劑或?yàn)E用物質(zhì)的存在的分析物的檢測(cè)。本發(fā)明的方法和試劑也可以用于檢測(cè)樣品中的分析物，所述樣品不是源自從動(dòng)物或植物分離的生物樣品。這樣，本發(fā)明的試劑和方法也可以擴(kuò)展到一種或多種分析物的檢測(cè)和/或環(huán)境樣品中分析物的區(qū)分，所述樣品，除了上面列出的生物樣品外，包括空氣、水和土壤樣品，包括地球外土壤、灰塵等樣品，工業(yè)樣品等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人受試者的HPV的診斷方法和試劑，且能檢測(cè)和區(qū)分不同菌林，以便從"低危險(xiǎn)"HPV分類群中區(qū)分"高危險(xiǎn)"HPV分類群。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了珠子集合，其能區(qū)分多個(gè)不同的HPV菌林。這樣，在一個(gè)方面，分析物是對(duì)許多HPV分類群特異性的，且方法和試劑是對(duì)下述物質(zhì)的檢測(cè)特異性的對(duì)許多HPV分類群特異性的核酸或抗原或抗體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，將能結(jié)合HPV基因組的菌林特異性部的核酸引物或探針固定化到每個(gè)珠子子集的珠子上。然后，使用指向側(cè)接菌林特異性區(qū)域的HPV基因組內(nèi)的保守區(qū)的引物，擴(kuò)增HPM基因組。然后，使用對(duì)任一種HPV菌林特異性的珠子子集來檢測(cè)或區(qū)分HPV菌林。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面指向珠子集合，其用于檢測(cè)一種或多種HPV菌林，和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌抹的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林；(b)在足以允許所述探針結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種HPV菌林。在一個(gè)優(yōu)選的方面，在大小、熒光強(qiáng)度水平、焚光染料類型和能與特定分析物反應(yīng)的試劑的基礎(chǔ)上，區(qū)分珠子集合內(nèi)的珠子。本發(fā)明的關(guān)于HPV檢測(cè)的方法可以用于區(qū)分2至16種HPV菌林，包括2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15至16種菌林。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子集合包含至少16個(gè)珠子子集，其針對(duì)HPV菌林6，11，16，18，31，33，35，39，45,51，52，56，58，59，"和68。合適的捕獲探針是在圖9中列出且顯示在SEQIDNO:5至20中的那些。使用能區(qū)分珠子集合內(nèi)的不同珠子的任何方法，可以確定分析物和存在于珠子上的反應(yīng)物之間是否已經(jīng)發(fā)生結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，區(qū)分珠子集合內(nèi)的不同珠子的方法是流式細(xì)胞術(shù)。本發(fā)明還設(shè)想到根據(jù)本發(fā)明的試劑和方法使用的診斷試劑盒。更具體地，本發(fā)明擴(kuò)展到生物芯片和擴(kuò)展到測(cè)定中的固相組分的minaturization,以建立孩i米測(cè)定試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，珠子集合或其一部分或其它試劑固定化在固相(例如生物芯片)上。生物芯片也可以視作"生物實(shí)驗(yàn)室"，在它上面進(jìn)行至少一部分測(cè)定，和/或記錄結(jié)果。在表1中提供了本文使用的縮寫的列表。表1-縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>圖1是描述典型的流式細(xì)胞儀的圖示。圖2是顯示在HPV診斷方法中使用的DM提取操作流程的圖示。圖3是顯示用于擴(kuò)增來自DNA樣品的HPV和人DNA的PCR操作的圖示。GP5+和GP6+指通用HPV引物，其結(jié)合HPV中的保守序列(Y),并產(chǎn)生擴(kuò)增子，其包含在HPV菌林(X卜u)之間可以變化的區(qū)域。引物L(fēng)C1-F和LC1-R擴(kuò)增人基因組DNA區(qū)域(Z)，其用作后一種雜交步驟的對(duì)照。引物GP6+和LC1-R包含焚光標(biāo)記物，其摻入在產(chǎn)生的擴(kuò)增子中。圖4是顯示基于大小區(qū)分微球的圖示。顯示了6個(gè)點(diǎn)群(cluster)，其與包含3.0拜，3.5pm，4.1叫5.Ojim,5.6fim和6.8pm直徑的微球相對(duì)應(yīng)。圖5是顯示基于熒光標(biāo)記強(qiáng)度區(qū)分相同大小的微球的圖示?？梢郧宄貐^(qū)分0%，4%，20。/。和100%的TMR相對(duì)強(qiáng)度。圖6是顯示在測(cè)定中使用的每種結(jié)合試劑的示意圖。測(cè)定包含具有3.0拜，3.5jim，4.1叫5.0拜，5.6拜和6.8拜的直徑的微球，和0%，4%，20%和100%的熒光標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度。在更小的珠子大小(即3.Ojim3.5拜和4.ljim)的情況下，使用0%和100%的TMR強(qiáng)度；對(duì)于5.0,微球，使用0%，20%和100%的TMR強(qiáng)度；且對(duì)于最大的微球，5.6jim和6.8nm直徑，使用所有信號(hào)強(qiáng)度。圖7是顯示如何在顆粒大小和熒光標(biāo)記強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，使用流式細(xì)胞術(shù)區(qū)分17種結(jié)合試劑的圖示。點(diǎn)群1至4相當(dāng)于分別具有0%，4%，20%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的6.8jim顆粒；點(diǎn)群5至8相當(dāng)于分別具有0%，4%，20%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的5.6nm顆粒；點(diǎn)群9至11相當(dāng)于分別具有100%,20%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的5.0nm顆粒；點(diǎn)群12和13相當(dāng)于分別具有100%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的4.1jun顆粒；點(diǎn)群14和15相當(dāng)于分別具有100%和0%的標(biāo)記強(qiáng)度的3.5jim顆粒；點(diǎn)群16和17相當(dāng)于分別具有0%和100%的標(biāo)記強(qiáng)度的3.0nm顆粒；圖8是顯示擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合哪個(gè)結(jié)合試劑陣列的圖示。結(jié)果表明結(jié)合于病毒保守序列Y、人對(duì)照序列Z和病毒菌林特異性序列X16。圖9是對(duì)HPV菌林6，11，16，18，31，33,35，39,45，51，52，56，58，59，66和68特異性的捕獲探針(引物)的代表。圖10A至G提供了用于檢測(cè)人樣品是否存在HPV的Qplots(商標(biāo))。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了測(cè)定和試劑，包括生物芯片，其能檢測(cè)一種或多種分析物和/或區(qū)分一類分析物中的不同成員。更具體地，通過基于分析物和測(cè)定組分的性質(zhì)的多重分析方法，鑒別或區(qū)分分析物。本發(fā)明的診斷和檢測(cè)測(cè)定和試劑特別適用于診斷多細(xì)胞真核受試者中的病原體感染。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人受試者中HPV的診斷測(cè)定，且能區(qū)分HPV分類群，以便區(qū)分"高危險(xiǎn)，，HPV感染和"低危險(xiǎn)"HPV感染。而且，本發(fā)明還提供了診斷或評(píng)價(jià)與分析物感染多細(xì)胞真核受試者有關(guān)的疾病(尤其是，人受試者的子宮頸癌)的發(fā)展的方法。應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，本發(fā)明不限于特定的診斷或測(cè)定方法，因?yàn)檫@可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，無(wú)意進(jìn)行限制。應(yīng)當(dāng)指出，如在本說明書所使用的，除非上下文已經(jīng)另有說明，單數(shù)形式的"一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)方面。因此，"一種分析物"包括單一分析物和兩種或多種分析物；一種"物理化學(xué)上可區(qū)分的底物"包括單一底物和兩種或多種底物；依此類推。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了珠子集合，其能檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種分析物，所述珠子集合包含(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會(huì)與待測(cè)樣品中的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和分析物辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別珠子已經(jīng)偶聯(lián)的反應(yīng)物。在一個(gè)相關(guān)的方面，可以進(jìn)一步有區(qū)別地標(biāo)記反應(yīng)物，以基于不同熒光染料的摻入，建立另外的珠子亞群。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和/或區(qū)分分析物的方法或珠子集合。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明的方法或珠子集合能檢測(cè)和/或區(qū)分病原性分析物。本發(fā)明也提供了檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的一種或多種分析物的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸對(duì)目標(biāo)分析物特異性的珠子集合；(b)在足以允許所述樣品中的分析物與所述珠子集合內(nèi)的珠子上的反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間；和(c)檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中結(jié)合到所述珠子的反應(yīng)物上的分析物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"病原性分析物"指推定感染、寄居或已經(jīng)污染樣品的微生物或病毒。示例性的病原體分析物包括病毒，細(xì)菌，真菌和真核微生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，"分析物"包括感染多細(xì)胞生物(例如動(dòng)物或植物)的微生物或病毒。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，病原性分析物可以視作動(dòng)物或植物病原體。不過，本發(fā)明包括檢測(cè)和區(qū)分寄居多細(xì)胞生物的非病原性分析物，例如動(dòng)物的微生物(例如乳酸桿菌屬，反芻動(dòng)物細(xì)菌)，昆蟲的微生物共生生物(例如鏈霉菌屬，沃爾巴克氏體屬)，海綿動(dòng)物的微生物共生生物(例如綠藻，渦鞭藻，藍(lán)細(xì)菌)等；植物的內(nèi)生植物(例如菌根，根瘤菌屬，弗蘭克菌屬，鏈霉菌屬)等。而且，分析物可以是與多細(xì)胞生物無(wú)關(guān)的分析物。這樣的分析物包括，細(xì)菌，真菌，病毒，原生生物，線蟲等，其寄居在特定的環(huán)境中，包括"天然"環(huán)境例如土壤，海洋，淡水，水，巖石，熱水口和空氣；衛(wèi)生保健環(huán)境包括醫(yī)院，醫(yī)院設(shè)備，手術(shù)裝備，衛(wèi)生保健人員衣服等；"工業(yè)"環(huán)境包括生產(chǎn)設(shè)備，制藥設(shè)備，釀酒廠，葡萄酒廠等；"實(shí)驗(yàn)室"環(huán)境包括發(fā)酵罐，培養(yǎng)物，實(shí)驗(yàn)臺(tái)，儀器等。因此，本發(fā)明設(shè)想到的樣品包括工業(yè)樣品(例如空氣、水和土壤等)和生物樣品(例如血液，血清，唾液，糞便，尿，組織液，精液，滲出物，膿汁，呼吸液，粘液和來自局部瘍、癌癥和損傷的擦樣)。另外，樣品可以是地球外樣品，例如來自隕石或另一個(gè)行星。關(guān)于后者，本發(fā)明的測(cè)定適合在行星間的遙控飛船上使用，用于測(cè)試土壤或灰塵或冰樣品，或用于測(cè)試行星的核心材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析物包含感染動(dòng)物受試者的細(xì)菌、真菌病毒和/或真核寄生物。本文設(shè)想到的"動(dòng)物受試者"包括所有動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選靈長(zhǎng)類動(dòng)物，包括低等的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，更優(yōu)選人。為了方便，"動(dòng)物"也特別地包括家畜例如牛，馬，綿羊，豬，山羊和驢以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠，大鼠，兔子，豚鼠和倉(cāng)鼠。使用本發(fā)明的試劑和方法可以檢測(cè)的示例性人分析物包括病毒，如人乳頭狀瘤病毒(HPV)，冠狀病毒包括SARS病毒，流感病毒，禽流感病毒，HIV包括HIV-I，HIV-II或HLTV-IV，通常的慢病毒屬，肝炎病毒等，性傳播疾病的病原性因子，例如衣原體屬，淋病，支原體屬和梅毒；食物傳播的病原體例如李斯特菌屬，沙門氏菌屬，大腸桿菌(尤其是大腸桿菌H0567)，志賀氏菌屬，布魯氏菌屬，金黃色葡萄球菌；Nosicomial病原體，例如金黃色葡萄球菌包括甲氧西林抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)和腸球菌包括萬(wàn)古霉素抗性的腸球菌(VRE);從環(huán)境得到的病原體例如軍團(tuán)桿菌屬，賈第蟲屬，C/7"^7/r2V/i/邁屬，炭疽桿菌(炭疽)等。在一個(gè)方面，檢測(cè)分析物的樣品優(yōu)選地是源自推定被分析物感染或寄居的多細(xì)胞受試者的樣品。因此，在一個(gè)方面，樣品優(yōu)選地是"生物樣品，，。不以任何方式限制本發(fā)明的示例性生物樣品包括組織或細(xì)胞樣品，例如細(xì)胞刮片，活組織檢查等和體液樣品，包括血液，尿，淋巴，羊水，腦脊液等。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的方法也適用于檢測(cè)非排它地源自多細(xì)胞真核生物的樣品中的"分析物"。這樣，本發(fā)明擴(kuò)展到檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的分析物的一種或多種具體的分類群或菌林，所述樣品例如環(huán)境樣品(包括空氣，水和土壤樣品)，工業(yè)樣品，實(shí)驗(yàn)室樣品等。例如，本發(fā)明的方法可以用于評(píng)價(jià)土壤、水或空氣樣品或源自人造物體的樣品或表面的原核微生物群、真核微生物群和/或病毒負(fù)載。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，待測(cè)分析物是HPV或其菌林，且樣品優(yōu)選地是源自人受試者的生物樣品。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品包含受試者的一種或多種細(xì)胞、血液或尿。最優(yōu)選地，生物樣品包含從受試者收集的子宮頸細(xì)胞。Gearhart等(www.emedicine.com/MED/topic1037.htm，2004)詳細(xì)描述了HPV，將其在下面的部分中再現(xiàn)。HPV會(huì)造成皮膚和粘膜的上皮腫瘤。已經(jīng)檢測(cè)到超過IOO種HPV類型，且已經(jīng)完全測(cè)序了幾乎70種基因組。當(dāng)前的基于基因組序列相似性的分類系統(tǒng)，通常與用于臨床上描述HPV的3種分類相關(guān)肛門生殖器疣和/或粘膜疣，非生殖器皮膚疣，和疣狀表皮發(fā)育不良(EV)。通過HPV序列數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)站，可以得到HPV基因組序列的數(shù)據(jù)庫(kù)和種系發(fā)生樹。將HPV粘膜感染進(jìn)一步分為潛伏的(無(wú)癥狀的)，亞臨床的，或臨床的。臨床的損害大致是明顯的，而潛在感染僅僅可以通過測(cè)試病毒DM來檢測(cè)到。通過應(yīng)用5%醋酸并在放大下檢查，可以鑒別亞臨床的損害。大多數(shù)HPV感染是潛在的；臨床上明顯的感染通常會(huì)導(dǎo)致疣，而不是惡性腫瘤。典型地，將HPV類型6和11標(biāo)記為低危險(xiǎn)，因?yàn)檫@些類型的感染具有低致癌潛能，且通常會(huì)導(dǎo)致濕疣的形成和低級(jí)癌前期病變。HPV類型16和18已經(jīng)成為HPV的高危險(xiǎn)類型，因?yàn)樗鼈兪谴蠖鄶?shù)高級(jí)上皮內(nèi)損害(它們可以發(fā)展成癌)的原因，尤其是在肛門生殖器種類和/或粘膜種類中的那些。HPV感染自身不會(huì)造成感染的組織的惡性轉(zhuǎn)化。輔因子，例如吸煙，紫外線輻射，懷孕，葉酸鹽缺乏和免疫抑制參與了該過程。表3列出了許多種疾病和有關(guān)的HPV亞型。表3-疾病和有關(guān)的HPV亞型<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>乳頭狀瘤病毒是高度物種特異性的，不會(huì)感染其它物種，甚至在實(shí)驗(yàn)室條件下。人是唯一已知的HPV宿主。乳頭狀瘤病毒是二十面體對(duì)稱的無(wú)衣殼病毒，其具有72個(gè)在基因組周圍的殼粒，所述基因組含有具有約8000個(gè)堿基對(duì)的雙鏈環(huán)狀DNA。認(rèn)為乳頭狀瘤病毒具有2種復(fù)制模式，即附加體基因組在基底細(xì)胞中的穩(wěn)定復(fù)制，和在更分化的細(xì)胞中失控的或生長(zhǎng)的復(fù)制，以產(chǎn)生子代病毒。盡管損害的所有細(xì)胞都含有病毒基因組，病毒基因的表達(dá)與細(xì)胞分化的狀態(tài)緊密相關(guān)。在感染的角質(zhì)形成細(xì)胞離開基底層之前，大多數(shù)病毒基因未被激活。病毒顆粒的生產(chǎn)，僅僅發(fā)生在高度分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中；因此，病毒生產(chǎn)僅僅發(fā)生在上皮表面，細(xì)胞在這里最終脫落進(jìn)環(huán)境中。認(rèn)為HPV損害的原因是感染的基底角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。當(dāng)基底細(xì)胞暴露于穿過擾亂的上皮屏障的感染性病毒時(shí)，通常發(fā)生感染，如在性交過程中或微小皮膚擦傷后發(fā)生的。尚未證實(shí)HPV感染是細(xì)胞溶解性的，然而作為脫落細(xì)胞的降解的結(jié)果，釋放出病毒顆粒。而且，HPV病毒可以在低溫和沒有宿主的情況下存活數(shù)月。病毒倍增通常局限在核中。結(jié)果，感染的細(xì)胞通常表現(xiàn)出高度的核異型。中空細(xì)胞病(來自希臘文koilos，指空的)描述了核周透明(環(huán))和濃縮的或皺縮的(rasinoid)核的組合，且是生產(chǎn)性乳頭狀瘤病毒感染的特征。HPV基因組作為環(huán)狀附加體DNA存在，其與良性或低危險(xiǎn)HPV損害中的宿主細(xì)胞核分離，例如通常與HPV類型6和ll有關(guān)的那些。高危險(xiǎn)HPV類型16和18的基因組通常整合在惡性損害的宿主細(xì)胞DNA中。但是，本發(fā)明擴(kuò)展到任意的HPV菌抹，包括但不限于菌林6，11，16，18，31，33，35,39，45，51，52，56，58，59，66和68。病毒基因組向宿主細(xì)胞基因組中的整合，被視作惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。已經(jīng)顯示，高危險(xiǎn)血清型的HPV蛋白E6和E7會(huì)滅活宿主胂瘤抑制蛋白p53和Rb，從而導(dǎo)致失調(diào)的宿主細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)和/或區(qū)分生物樣品中的一種或多種特定HPV菌林的方法，所述方法包含下述步驟(i)從人受試者得到生物樣品，其推定包含HPV;(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與每種HPV菌林不同的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增對(duì)照核酸序列；(v)標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(Vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與包被有反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合，指示著特定HPV菌林在樣品中的存在。本發(fā)明能檢測(cè)擴(kuò)增的HPVDNA，或者，使用逆轉(zhuǎn)錄酶，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的RNA。因此，本發(fā)明設(shè)想到具有RNA或DNA或其化學(xué)類似物的珠子。本發(fā)明的方法部分地用于檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的受試者分析物的一種或多種特定菌林。本文中提及的"受試者分析物的特定菌株"包括分析物的物種或分類群的任何變體。分析物的"菌林"的實(shí)例包括分析物的亞種，具有不同毒力水平的分析物變體，當(dāng)感染或寄居宿主時(shí)指示不同預(yù)后的分析物變體，分析物的生物化學(xué)變體等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)和/或區(qū)分與在人類中的更高危險(xiǎn)或更高致癌潛能有關(guān)的特定HPV菌林(高危險(xiǎn)菌林)、和與更低的癌危險(xiǎn)或低致癌潛能有關(guān)的那些(低危險(xiǎn)菌林)。因此，術(shù)語(yǔ)"高危險(xiǎn)"HPV菌林包括與人受試者中癌(包括子宮頸癌)的發(fā)展有關(guān)的任何HPV菌林。如上面指出的，不以任何方式限制本發(fā)明的示例性高危險(xiǎn)HPV菌株包括HPV6，11，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。在圖9中顯示了這些HPV菌株的在珠子上的合適的捕獲探針。術(shù)語(yǔ)"探針"和"引物，，可以在本上下文中互換地使用。"低危險(xiǎn)"HPV菌林包括與人受試者中增加的癌危險(xiǎn)無(wú)關(guān)或僅微弱相關(guān)的那些。典型地，低危險(xiǎn)HPV菌抹是瘋形成菌林，包括HPV6和HPV11。本發(fā)明的珠子與反應(yīng)物相偶聯(lián)，所述反應(yīng)物會(huì)與樣品內(nèi)的特定目標(biāo)分析物特異性地反應(yīng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明的反應(yīng)物是核酸，且樣品內(nèi)與反應(yīng)物特異性地反應(yīng)的分析物也是核酸。因此，本發(fā)明的該方面使用指向HPV菌林的保守區(qū)、但是側(cè)接菌林特異性的基因組序列的引物。菌林特異性的序列稱作"可變"序列，因?yàn)榕c在菌林之間恒定的保守序列相比，它們?cè)诰种g變化。擴(kuò)增后，使擴(kuò)增子接觸珠子集合中的珠子子集，其中每個(gè)子集的每個(gè)珠子攜帶能與菌抹特異性的擴(kuò)增子雜交的捕獲核酸引物或探針。使用珠子大小、熒光強(qiáng)度和DNA結(jié)合特異性進(jìn)行倍增，會(huì)實(shí)現(xiàn)HPV菌林的鑒別、分選和區(qū)分。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到珠子集合，其用于檢測(cè)一種或多種HPV菌林和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌株特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到用于檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌抹的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌抹特異性的區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林；(b)在足以允許所述引物結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種hpv菌林。也可以用熒光報(bào)告分子標(biāo)記核酸捕獲探針特異性的擴(kuò)增子。使用對(duì)于樣品本身和分析物的性質(zhì)方便的任何方法，可以從受試者樣品分離核酸。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"核酸"指DNA和/或RM。典型地，DNA是分離的，盡管在有些情況下，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，可以更優(yōu)選地分離RNA，例如，當(dāng)目標(biāo)分析物是RNA病毒時(shí)。如果RM是分離的，可以擴(kuò)增RM,或者可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于隨后的擴(kuò)增和分析。優(yōu)選地，"核酸"是DNA。使用任何方便的方式，可以從樣品分離DNA。例如，在人細(xì)胞樣品的病毒(例如HPV)的情況下，可以使用胍或功能等同試劑來裂解細(xì)胞。示例性的基于胍的細(xì)胞裂解和DNA提取方法是Nelson和Krawetz的方法(Anal.Biochem.207(1):97-201:1992)?；陔业牧呀馊芤阂部蓮墓?yīng)商商業(yè)上得到，例如Qiagen，例如QIAamp，PAXgene等。但是，裂解方法可以根據(jù)樣品和分析物的性質(zhì)而變化。例如，對(duì)于環(huán)境樣品(例如土壤或沉淀樣品)中分析物的檢測(cè)，基于玻璃珠的細(xì)胞裂解系統(tǒng)可以是更合適的，例如Kuske等的方法(Appl.Environ.Microbiol.64(7):2463-2412，1998)。在任何情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不經(jīng)過過度的實(shí)驗(yàn)，即可容易地確定特定分析物和樣品的適宜裂解方法。裂解細(xì)胞后，可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易明白的任何方便的方式(例如參見上面商業(yè)得到的試劑盒)，純化DNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用有限量的DNA結(jié)合試劑，例如但不限于二氧化硅，純化DNA。通過使用有限量的DNA結(jié)合試劑，可以從不同樣品分離一致量的DNA，因?yàn)樵诿糠N情況下回收的DNA的量等于該有限量的DNA結(jié)合試劑可以結(jié)合的DNA的最大量。然后，可以使用任何方便的方式，從DM結(jié)合試劑回收或洗脫DNA結(jié)合試劑結(jié)合的DNA。盡管DNA是優(yōu)選的核酸，也可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)的RNA分離方法，從樣品分離RNA。RM分離典型地包含細(xì)胞破碎步驟和RM分離步驟。適用于分離RNA的示例性的細(xì)胞破碎技術(shù)包括AmbionTechnicalBulletin#183所述的那些("www.ambion.com/techlib/tb/tb-183.html")。而且，在www.ambion.com/techlib/basics/products/rnaisol—compchart.html,描述了適用于許多樣品類型的許多示例性的RNA分離試劑盒。但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些特定的RM分離和純化的方法和試劑盒不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明是與本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的任何RNA分離方法兼容的。關(guān)于HPV檢測(cè)，珠子集合可以包含象HPV菌林一樣多的珠子子集。因此，測(cè)定可以采用2，3，4，5，6，7,8，9，10，11，12，13，14，15或16個(gè)珠子子集，各自對(duì)應(yīng)HPV菌抹6，11，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。其它珠子也可以用作對(duì)照。在圖9中公開了合適的捕獲探針。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面指向珠子集合，其用于檢測(cè)一種或多種HPV菌林，和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與選自SEQIDNO:5至20的核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林。本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中的兩種或多種HPV菌林的方法，其包含下述步驟(a)使樣品接觸包含多個(gè)珠子子集的珠子集合，其中(i)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(ii)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與選自SEQIDNO:5至20的核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌林特異性的區(qū)域；(iii)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(iv)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌抹；(b)在足以允許所述探針結(jié)合擴(kuò)增的HPV基因組的條件下，將所述珠子集合與所述樣品一起溫育一段時(shí)間，產(chǎn)生包含菌林特異性的區(qū)域的復(fù)制子；(c)檢測(cè)和/或區(qū)分樣品中產(chǎn)生的結(jié)合所述珠子的復(fù)制子，從而鑒別或區(qū)分兩種或多種HPV菌林。因此，珠子集合可以包含HPV2，3，4，5，6，7，8，10,11，12，13，14,15，16個(gè)珠子子集，各自具有一種選自SEQIDNO:5至20的核酸分子。SEQIDNO:5至20中的這些HPV菌株特異性的序列包括，與這些序列具有至少90%—致性、或能在低嚴(yán)格性條件下與它們或它們的互補(bǔ)形式雜交的核酸分子。至少90°/。包括90，91，92，93，94，95，96，97，98，99和100%。本發(fā)明的方法部分地依賴于，使用結(jié)合受試者分析物的不同菌林中的保守序列的引物，從樣品擴(kuò)增核酸，但是這會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增子，后者包含分析物的每種菌林的不同核苷酸序列。實(shí)際上，在本發(fā)明中使用的引物會(huì)結(jié)合在受試者分析物菌林中保守的序列，其側(cè)接在菌林之間至少部分地不保守的或多態(tài)的區(qū)域。示意地，擴(kuò)增的分析物區(qū)域具有下述一般結(jié)構(gòu)C-X-C"其中C是核苷酸序列，它在兩種或多種分析物菌林中是保守的，且是"正向"引物的結(jié)合位點(diǎn)；X是核苷酸序列，它的一部分或全部包含不同分析物菌林之間的變化；C，是核苷酸序列，它在兩種或多種分析物菌林中是保守的，且是"反向"引物的結(jié)合位點(diǎn)；從引物位點(diǎn)(例如上述的那些)擴(kuò)增，會(huì)有效地允許使用"通用"引物集合，其結(jié)合在C和C，，以從許多分析物菌林?jǐn)U增X。而且，應(yīng)當(dāng)指出，使用通用引物擴(kuò)增的擴(kuò)增子可以包含保守區(qū)和可變區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用擴(kuò)增HPV序列的引物。更優(yōu)選地，這些引物是GP5+,即5'TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC(SEQIDNO:1),和GP6+，即GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC3'(SEQIDNO:2)。這些引物從HPV產(chǎn)生擴(kuò)增子，其包含保守區(qū)(在圖3中定義為Y)和在不同HPV菌林之間變化的區(qū)域(在圖3中定義為X)。本發(fā)明也設(shè)想到對(duì)照序列的擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)照序列可以包括生物樣品來源受試者的基因組的區(qū)域。但是，本發(fā)明絕不限于這些具體的對(duì)照序列，且也設(shè)想到本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的其它對(duì)照序列。而且，也可以在不擴(kuò)增對(duì)照序列的情況下，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用包含核苷酸序列5'TACACACAGGTGTACACAGA(SEQIDNO:3)的引物L(fēng)C1-F和包含序列5'ACCAAGTACTCTACGTGTTG(SEQIDNO:4)的引物L(fēng)CI—R，從人受試者基因組擴(kuò)增對(duì)照序列。使用任意的DM擴(kuò)增方法，可以擴(kuò)增分離的DNA。在"DNAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications"(Demidov和BroudeEds.，HorizonBioscience,2004)中，描述了許多示例性的DNA擴(kuò)增方法，它們不會(huì)限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域已知的任何RM方法，可以擴(kuò)增分離的RNA,且已經(jīng)開發(fā)了許多RNA擴(kuò)增技術(shù)。其中的兩大類是(i)使用熱循環(huán)的技術(shù)，例如RT-PCR，和(ii)等溫測(cè)定，例如基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(Compton，Nature350:91—92，1991;Kievits等，JVirol,methods35:273-286，1991)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)(Hill,J.Clin.LigandAssay19:43-51，1996)?？梢约?xì)分等溫測(cè)定，這基于(i)它們是否拷貝和擴(kuò)增耙序列，例如TMA，MSBA和自持續(xù)的序列復(fù)制(3SR)(Guatelli等，Proc.NatlAcad.SciUSA87:1874-1878，1990;Chadwick等，J.Virol.Methods70:59-70，1998;綜述參見Chan和Fox，Rev.Med.Microbiol.10:185—196，1999)，或(ii)它們是否產(chǎn)生可以進(jìn)一步擴(kuò)增的靶物依賴性的信號(hào)，例如侵入物測(cè)定(Lyamichev等.，Nat.Biotechnol.17:292-296，1999;Ryan等，Mol.Diagn.4:135-144，1999)。存在多種其它擴(kuò)增技術(shù)，它們不能容易地歸入這些類別，例如QP復(fù)制酶(Lizardi等.，Biotechnology(6:1197-1202，1988)和分支的DNA(Todd等，J.AIDSHum.Retrovirol.10:S35-S44，1995;Pawlotsky等，J.Virol.Methods79:227-235，1999)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明設(shè)想到本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的任何RNA擴(kuò)增方法。而且，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明也設(shè)想到使用逆轉(zhuǎn)錄酶或其功能等同物來將RNA轉(zhuǎn)化成DNA，然后可以擴(kuò)增它。根據(jù)本發(fā)明，標(biāo)記在上述方法的步驟(iii)和/或(iv)中所述的擴(kuò)增子?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞?，標(biāo)記本發(fā)明的擴(kuò)增子。示例性的方法包括合成前的和合成后的方法。合成前的標(biāo)記方法包括，標(biāo)記隨后用于PCR擴(kuò)增并從而整合進(jìn)擴(kuò)增子的PCR引物。在該方法中，標(biāo)記典型地結(jié)合在適用于擴(kuò)增擴(kuò)增子的引物的5'末端，盡管也設(shè)想到標(biāo)記引物內(nèi)的其它位置，例如3'標(biāo)記或非末端標(biāo)記。也可以在標(biāo)記和標(biāo)記的多核苷酸之間使用化學(xué)連接物。適宜的連接物序列可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定，可能包括連接物例如C6，C7和C12氨基修飾劑和包含巰基的連接物。容易確定，引物可以包含連接物和標(biāo)記、或單獨(dú)的連接物，可以在后面的階段將標(biāo)記結(jié)合到它上面。擴(kuò)增后的標(biāo)記方法包括切口標(biāo)記系統(tǒng)，其中使用K1enow聚合酶或其功能等同物，使用隨機(jī)引物，從擴(kuò)增子合成標(biāo)記的多核苷酸。在合成過程中，標(biāo)記的核苷酸，或包含連接基團(tuán)的核苷酸，可以摻入Klenow聚合酶合成的多核苷酸中。在任何情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易地明白其它標(biāo)記方法，應(yīng)當(dāng)理解，標(biāo)記方法的選擇決不會(huì)限定或限制本發(fā)明。優(yōu)選地，使用的標(biāo)記是"熒光標(biāo)記物"或"熒光團(tuán)，，。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉許多不同的熒光標(biāo)記物，熒光標(biāo)記物的選擇不以任何方式限制本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光標(biāo)記物包含任何能夠結(jié)合多核苷酸并能使用選自下列的光源激發(fā)的熒光標(biāo)i己物(i)氬離子激光包含藍(lán)色488nm鐠線，它適用于激發(fā)許多在綠色至紅色區(qū)域發(fā)熒光的染料和熒光染料。也可獲得在波長(zhǎng)范圍(458nm、488nm、496nm、515nm等)發(fā)射的可調(diào)氬激光。(ii)二極管激光具有635nm發(fā)射波長(zhǎng)?，F(xiàn)在可獲得的其它二極管激光在532nm工作。有趣地，該波長(zhǎng)最優(yōu)地激發(fā)殃丙錠(PI)。PI染色廣泛地用于DNA分析，活/死計(jì)數(shù)和倍性測(cè)定。也可獲得發(fā)射約476nm光的藍(lán)色二極管激光。(iii)HeNe氣體激光使用紅色633nm譜線工作。(iv)HeCd激光:在325nm工作。(v)100W水銀弧光燈最有效的激發(fā)UV染料(如Hoechst和DAPI)的光源。在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記物選自羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP,別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，蓬唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa熒光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素);PE-Cy5,PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4\5'-二氯-2、7'-二曱氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和ROX;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四甲基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記物是Cy5，其對(duì)于本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是特別方便的。但是，在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，放射性的或非放射性的標(biāo)記可以用于標(biāo)記擴(kuò)增子。方便的放射性標(biāo)記包括"P和3H。可以使用任何方便的方式，將這些標(biāo)記摻入擴(kuò)增子和/或引物。也可以使用許多非放射性的標(biāo)記方法。在Speel(Histochem.CellBiol.112:89-113，1999)中描述了不限制本發(fā)明的示例性的非放射性的標(biāo)記方法。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)物"應(yīng)當(dāng)理解為包含固定化在珠子上的多核苷酸。更具體地，每種反應(yīng)物包含多核苷酸，后者包含與根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子互補(bǔ)的序列，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上。反應(yīng)物也可以包含與前文定義的對(duì)照序列互補(bǔ)的序列，即從多細(xì)胞生物的基因組擴(kuò)增的序列(Z)或在分析物菌抹之間保守的核苷酸序列的擴(kuò)增子(Y)。因此，反應(yīng)物的珠子集合可以包含其中Bl..Bn,By，Bz分別是物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子；cXn是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核普酸序列，后者與對(duì)分析物或受試者分析物的特定菌林特異性的特定核酸序列互補(bǔ)，且其中n是要使用珠子集合檢測(cè)的分析物或受試者分析物的特定菌林的數(shù)目；cY是珠子集合的任選成員，且是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所迷多核苷酸包含核苷酸序列，后者與在分析物或受試者分析物的菌林之間保守的序列互補(bǔ)；cZ是珠子集合的任選成員，且是固定化在珠子上的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，后者與從多細(xì)胞受試者擴(kuò)增的對(duì)照序列互4卜。優(yōu)選地，受試者分析物是HPV,且對(duì)照DNA序列是人基因組DM序列。"互補(bǔ)"應(yīng)當(dāng)理解為，固定化的反應(yīng)物多核苷酸會(huì)在低嚴(yán)格性條件下與根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子雜交。優(yōu)選地，固定化的多核苷酸會(huì)在中等嚴(yán)格性條件下結(jié)合樣品和標(biāo)準(zhǔn)物，且最優(yōu)選地，固定化的多核普酸會(huì)在高嚴(yán)格性條件下結(jié)合樣品和標(biāo)準(zhǔn)物。本文中的低嚴(yán)格性包括，至少約0至至少約15%v/v曱酰胺(包括1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%11%，12%，13%和14%v/v甲酰胺)和至少約1M至至少約2M鹽用于雜交，和至少約1M至至少約2M鹽用于洗滌條件。通常，低嚴(yán)格性是在約25-30。C至約52°C，例如25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51和52。C?？梢愿淖儨囟?，且可以使用更高的溫度來替代甲酰胺和/或產(chǎn)生替代性的嚴(yán)格性條件。當(dāng)需要時(shí)，可以使用替代性的嚴(yán)格性條件，例如中等嚴(yán)格性，它包括至少約16y。v/v至至少約30%v/v甲酰胺，包括16%，17%，18%,19%，20%，21%，22%,23°/。，24%，24%，26%，27%，28%,29%和30%v/v曱酰胺，和至少約0.5M至至少約0.9M鹽用于雜交，和至少約0.5M至至少約0.9M鹽用于洗滌條件，或高嚴(yán)格性，它包括至少約31%v/v至至少約50%v/v甲酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M鹽用于雜交，和至少約0.01M至至少約0.15M鹽用于洗滌條件。通常，在L-69.3+0.41(G+C)%(Mar匿和Doty，J.MolBiol.5:109，1962)，進(jìn)行洗滌。但是，錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目每增加1%,雙鏈DNA的L降低1。C(Bo畫r和Laskey，Eur.J.Biochem.46:83，1974)。在這些雜交條件下，甲酰胺是任選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)格性水平定義如下低嚴(yán)格性是6xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS，在25-42。C;中等嚴(yán)格性是2xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS，在20。C至65。C的溫度；高嚴(yán)格性是O.1xSSC緩沖液，0.1%w/vSDS,在至少65。C的溫度。反應(yīng)物珠子集合的珠子(Bi…Bn，By，Bz)分別是物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子。術(shù)語(yǔ)"物理化學(xué)上可區(qū)分的"指任何物理的或化學(xué)的特征，其允許一種珠子(例如BJ與另一種珠子(例如B2)區(qū)分開。因此，物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子允許區(qū)分特定反應(yīng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子包含"微粒"。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，幾乎所有均質(zhì)的或不均質(zhì)的材料都可以用作微粒。本文設(shè)想到的微粒也可以包含超過一種物質(zhì)，這樣可以包含貝殼、合金或有機(jī)物和/或無(wú)機(jī)物的混合物。可以根據(jù)本發(fā)明使用且代表本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的特別有用的材料包括選自下述的材料二氧化硅(例如石英或玻璃)，橡膠，鈦，二氧化錫，釔，氧化鋁，和其它二價(jià)金屬氧化物(例如ZnO)，鈣鈦礦和其它壓電金屬氧化物(例如BaTiO》，ZnS，蔗糖，瓊脂糖和其它聚合珠子。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，微粒包含二氧化硅。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"物理化學(xué)上可區(qū)分的"指珠子大小、特定視覺可檢測(cè)的標(biāo)記的存在與否和/或視覺可檢測(cè)的標(biāo)記的強(qiáng)度中任一項(xiàng)的可測(cè)量的差異?？梢詫⒈景l(fā)明設(shè)想到的珠子制成任何常規(guī)的規(guī)則的或不規(guī)則的三維形狀。但是，通常實(shí)用地合成小球或球狀顆粒。這樣的球或球狀顆粒在本文中也稱作"珠子"。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的"微粒"基本上是球形的或類似球狀的，或包含"微球"。盡管本發(fā)明的珠子可以稱作"微球"，顆粒的實(shí)際大小取決于許多因素，且顆粒實(shí)際上可以包含或不包含微米范圍的度量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子包含約300nm至約30nm的直徑(或非球狀顆粒的等同度量)，包括300nm，350nm，400nm，450nm，500nm，550nm，600nm，650nm，700nm，750認(rèn)，800nm，850nm，900nm5950nm，1.0一，1.1nm，1.2fim，1.3拜，1.4jim，1.5jim，1.6jim，1.7,，1.8fim，1.9jim，2.0拜，2.lfim，2.2拜，2.3叫2.4jim，2.5拜，2.6叫2.7拜，2.8jim,2.9叫3.0,，3.ljun,3.2pm，3.3拜，3.4jim，3.5jim，3.6拜，3.7拜，3.8拜，3.9拜，4.Ofim，4.l拜，4.2jim，4.3jtm,4.4叫4.5jim，4.6jim，4.7拜，4.8拜，4.9jim，5-Ofim，5.1叫5.2pm，5.3^un，5.4jim，5.5pm，5.6戶，5.7拜，5-8拜，5.9拜，6.0拜，6.l拜，6.2戶，6.3拜，6.4jim，6.5拜，6.6拜，6-7jim，6.8戶,6.9fim，7.0拜，7.ljim，7.2拜，7.3jun，7.4pm，7.5,，7.6拜，7.7jim，7.8jim，7.9拜，8.0拜，8.lfim，8.2fim，8.3拜，8.4fim，8.5拜，8.6拜，8.7叫8.8戶，8.9拜，9.0拜，9.l叫9.2n瓜，9.3片m，9,4拜，9.5jim，9.6拜，9.7拜，9.8叫,9.9叫,10fim，llpm，12,，13戶，14fim，15拜,16jim，17拜，18拜，19一，20jim，21叫22叫23叫24fim，25,26jim，27叫28拜，29拜，30nm。更優(yōu)選地，珠子包含ljim至10jim直徑(或非球形顆粒的等同度量)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子是由GeneraBiosystems生產(chǎn)的AmpaSand(商標(biāo)GeneraBiosystems)珠子。這些珠子可商業(yè)上得到，且記栽在www.generabiosystems.com/generabiosystems/technoloRy/AmpaSandBeads/。但是，不應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明視作限于j吏用這些特定的珠子。在是否存在一種或多種"視覺可檢測(cè)的標(biāo)記"的基礎(chǔ)上，可以區(qū)分珠子。典型地，特定珠子可以包含O，1，2，3，4，5種視覺可檢測(cè)的標(biāo)記。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"視覺可檢測(cè)的標(biāo)記"指會(huì)發(fā)射焚光、磷光和/或白熱的任何分子、原子或離子。方便的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記包括會(huì)發(fā)射紫外線(波長(zhǎng)范圍為約350nm至約3nm)、可見光(波長(zhǎng)范圍為約350nm至約800nm)、近紅外(NIR)(波長(zhǎng)范圍為約800nm至約1500nm)和/或紅外線(IR)(波長(zhǎng)范圍為約1500認(rèn)至約10nm)的那些。但是，由于容易檢測(cè)，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測(cè)的標(biāo)記是在視覺波長(zhǎng)范圍內(nèi)可檢測(cè)的。在本發(fā)明的其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測(cè)的標(biāo)記包含一種或多種選自下列的標(biāo)記熒光團(tuán)，半導(dǎo)體顆粒，磷顆粒，摻雜的顆粒或納米晶體或量子點(diǎn)。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測(cè)的標(biāo)記是熒光團(tuán)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"熒光團(tuán)"指會(huì)表現(xiàn)出熒光性質(zhì)的任何分子。為了本文的目的，術(shù)語(yǔ)"熒光"可以定義為分子的吸收特定波長(zhǎng)的光和重新發(fā)射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光的性質(zhì)。波長(zhǎng)變化涉及在該過程中發(fā)生的能量損失。術(shù)語(yǔ)"熒光團(tuán)"可以包括許多視覺可檢測(cè)的標(biāo)記，例如化學(xué)熒光團(tuán)和染料，以及量子點(diǎn)。一種可以根據(jù)本發(fā)明使用的特別方便的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記是包埋的半導(dǎo)體熒光顆粒。這些視覺可檢測(cè)的標(biāo)記顆粒可以很小，這樣它們的性質(zhì)和發(fā)射變成大小依賴性的。這樣的微小的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記顆粒在本領(lǐng)域稱作半導(dǎo)體納米顆粒、量子點(diǎn)、量子線、量子棒或納米晶體或Q-顆粒。但是，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"量子點(diǎn)"或"QD"應(yīng)當(dāng)理解為包括所有這樣的顆粒。而且，包含QD的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記可以包含近似球形的或類似球形的顆粒，或包衣的球形的或類似球形的顆粒。但是，術(shù)語(yǔ)QD無(wú)論如何不應(yīng)當(dāng)視作限于球形的、類似球形的、環(huán)狀的、圓柱狀的或"點(diǎn)"的任何其它形態(tài)。例如，如本文所使用的QD也可以包含其它形態(tài)，包括，尤其是，棒狀、橢圓形、或包衣的棒狀或橢圓形顆粒。QD由半導(dǎo)體材料的納米級(jí)晶體心組成；生物學(xué)活性的形式典型地圍繞有保護(hù)殼和外衣。例如，QD可以包含直徑為約2nm至約30nm的半導(dǎo)體微晶，且可以在晶體內(nèi)含有約50-500000個(gè)原子，包括包含ZnS，ZnSe，ZnTe，CdS，CdSe，CdTe，PbS，PbSe，PbTe，HgS，HgSe，HgTe，Si，ZnO等材料的發(fā)光晶體。QD會(huì)發(fā)射寬吸收光譜和窄發(fā)射光譜的熒光。與有些其它的具有不同吸收光譜的熒光團(tuán)不同，QD會(huì)吸收超過寬光譜范圍的光，這允用許多光源(例如激光，弧光燈，或LED)激發(fā)量子點(diǎn)。而且，不同QD的集合可以用于使用僅一種激發(fā)源的多種用途。但是，每個(gè)點(diǎn)的發(fā)射光譜通常非常窄，是約30nm的量級(jí)，確切的顏色依賴于顆粒的直徑和組分。而且，QD的窄發(fā)射光鐠允許鄰近點(diǎn)的光譜分辨。除了上面的優(yōu)點(diǎn)外，QD也是相對(duì)耐光的，甚至在強(qiáng)激發(fā)過程中，且比熒光團(tuán)更亮。鑒于上述內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明包括使用不同大小的QD。而且，本發(fā)明設(shè)想到用熱處理、表面修飾、合金、表面鈍化或覆蓋表面涂層等方法處理的QD,使QD發(fā)射高量子產(chǎn)率，并提高耐光性較長(zhǎng)的時(shí)間。QD也可以從QuantumDotCorp.(QDC)等/>司商業(yè)上得到，該7>司生產(chǎn)QD，例如Qdot[商標(biāo)]605抗生物素蛋白鏈菌素綴合物，其含有在605nm發(fā)射的竭化鎘心。也可以得到在525，565，585,和655nm發(fā)射的Qdot綴合物。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明絕不限于QD的特定組合物(或任何其它視覺可檢測(cè)的標(biāo)記)，且任何QD(商業(yè)的或其它的)可以與本發(fā)明兼容。也存在許多本領(lǐng)域可得到的熒光染料，其可以用作根據(jù)本發(fā)明的熒光團(tuán)。熒光染料或其它熒光團(tuán)的一種決定它的應(yīng)用潛力的重要性質(zhì)是熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)；它必須與可得到的光源的波長(zhǎng)匹配。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的許多不同的熒光染料和其它熒光團(tuán)，熒光標(biāo)記物的選擇，不會(huì)限制本發(fā)明?？梢杂糜跇?biāo)記底物的特別方便的熒光染料包括上面關(guān)于標(biāo)記PCR擴(kuò)增子討論的那些。但是，當(dāng)選擇焚光標(biāo)記物時(shí)，結(jié)合試劑使用的熒光標(biāo)記物的發(fā)射光語(yǔ)應(yīng)當(dāng)與擴(kuò)增子使用的標(biāo)記的發(fā)射光鐠不同。兩種染色技術(shù)常用于熒光地標(biāo)記珠子和微球內(nèi)部染色和外部染色(表面標(biāo)記)。這兩種技術(shù)產(chǎn)生具有獨(dú)特性質(zhì)的珠子，分別對(duì)于不同用途是有益的。內(nèi)部染色會(huì)產(chǎn)生非常穩(wěn)定的顆粒，其典型地具有狹窄的熒光發(fā)射。這些珠子經(jīng)常顯示出更大的對(duì)光漂白的耐受性。由于熒光團(tuán)在珠子的內(nèi)部，表面基團(tuán)可以用于將配體(蛋白，抗體，核酸等)綴合到珠子表面上。鑒于該原因，內(nèi)部地標(biāo)記的珠子典型地用于分析物檢測(cè)和免疫測(cè)定用途。表面標(biāo)記包含熒光團(tuán)向珠子表面的綴合。因?yàn)闊晒鈭F(tuán)是在珠子表面上，它們能與它們的環(huán)境相互作用，正如染色細(xì)胞上的熒光團(tuán)。結(jié)果是珠子標(biāo)準(zhǔn)物，其在許多不同的條件(例如存在污染物或改變pH)下，會(huì)表現(xiàn)出與染色的細(xì)胞樣品相同的激發(fā)和發(fā)射性質(zhì)。表面標(biāo)記的珠子的"環(huán)境響應(yīng)性的"性質(zhì)使得它們理論上適用于模仿生物學(xué)樣品。外部地標(biāo)記的珠子經(jīng)常用作許多使用熒光檢測(cè)的用途中的對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)物。但是，本發(fā)明設(shè)想到珠子與熒光標(biāo)記物通過任何方式的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)"發(fā)磷光的珠子"、"磷光珠子"和"磷光劑"在本文中可互換地使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易地理解構(gòu)成發(fā)磷光的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記的物質(zhì)。但是，作為實(shí)例，它們不以任何方式限制本發(fā)明，合適的磷光劑包括ZnS、ZnS:Cu、氧化銪和在顯示裝置使用的其它磷光劑的小顆粒。包含"摻雜的珠子"的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記可以包括顆粒，后者包含封閉量的一種或多種稀土離子，例如Eu，Y，Yb，Sm等。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"視覺可檢測(cè)的標(biāo)記"應(yīng)當(dāng)理解為也包括多種視覺可檢測(cè)的標(biāo)記，視覺可檢測(cè)的標(biāo)記的混合物，包衣的納米晶體，合金和熟練的技術(shù)人員顯而易見的其它復(fù)雜的混合物。所有這樣的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記的應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)視作在本文所述的方法和試劑的范圍內(nèi)。而且，反應(yīng)物的視覺可檢測(cè)的標(biāo)記可以包含摻入固定化的多核苷而不是直接結(jié)合珠子本身的標(biāo)記。通常，用固定化的"標(biāo)簽，，或探針寡核苷酸標(biāo)記珠子。該標(biāo)簽攜帶內(nèi)胺(Niy，后者再通過綴合染料的琥珀酰亞胺基酯來修飾。在現(xiàn)有的設(shè)定中，使用的染料是BODIPY-TMR。通過混合標(biāo)記的和未標(biāo)記的標(biāo)簽，然后將該混合物綴合到珠子上，可以生成具有不同水平的熒光標(biāo)記物的珠子等級(jí)。方便地使用的比例是l:5X系列；也就是說，通過使用未標(biāo)記的標(biāo)記的標(biāo)簽的比例，產(chǎn)生不同的等級(jí)。在下面的表4中對(duì)此進(jìn)行了分類例證。表4-未標(biāo)記的標(biāo)記的標(biāo)簽的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>視覺可檢測(cè)的標(biāo)記可以用于在許多濃度或強(qiáng)度的珠子，從而提供另一種"在生物化學(xué)上區(qū)分"特定珠子的基礎(chǔ)。例如，如果將特定視覺可檢測(cè)的信號(hào)的最大可檢測(cè)強(qiáng)度視作100%，標(biāo)記可以應(yīng)用于許多珠子，產(chǎn)生0%，2%，4°/。，6%，8%,10°/。，15%,20%，25%，30%，35%，40%,45%,50%，60%，70%,80%，90%,100%的強(qiáng)度。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)物的珠子集合包含3.Onm，3.5戶，4.1,，5.Ojim，5.6fim和6.8拜的珠子，其中所述3.0拜，3.5戶和4.ljim直徑珠子纟皮0%和100°/。標(biāo)記，且5.Onm直徑珠子纟皮0°/。，100%和20%標(biāo)^己，且5.6nm和6.8jim直徑珠子華皮0%，100%，20%和4%標(biāo)記?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞剑瑢⒎磻?yīng)物的固定化的多核苷酸組分，例如cXn，cY和/或cZ，結(jié)合到珠子上。在它們的生產(chǎn)過程中，可以將固定化的多核苷酸包封在珠子中，或在生產(chǎn)后，可以將其結(jié)合到它們的表面上。用于結(jié)合多核苷酸和珠子的方法的選擇取決于使用的材料，如熟練的技術(shù)人員會(huì)容易地確定的。另外，可以在結(jié)合多核苷酸之前，對(duì)珠子進(jìn)行其它處理，包括硅烷化(用硅烷包被底物)，以便增加所述多核苷酸向珠子的結(jié)合。通常，可以用會(huì)共價(jià)地結(jié)合或吸附到珠子表面上的任何化合物包被珠子，另外，反應(yīng)物也應(yīng)當(dāng)具有用于結(jié)合多核苷酸的化學(xué)基團(tuán)，例如巰基、胺或羧基。具有這些特性的化合物的實(shí)例包括氨基-結(jié)尾的硅烷例如氨基-丙基三甲氧基硅烷或氨基-丙基三乙氧基硅烷。除了硅烷外，例如聚-L-賴氨酸，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，熟練的技術(shù)人員可以容易地識(shí)別其它化合物，包括適用于將多核苷酸結(jié)合到表面上的其它硅烷，本發(fā)明不受化合物的選擇的限制?？梢允褂萌魏畏奖愕姆绞剑瑢⒍嗪塑账峤Y(jié)合到珠子上，典型地，這通過物理吸附或化學(xué)連接來實(shí)現(xiàn)。另外，可以用促進(jìn)或增加多核苷酸向珠子表面的吸附或結(jié)合的試劑，例如氨基硅烷，進(jìn)一步包被珠子。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易地確定能執(zhí)行該功能的其它試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子通過UniversalAnchoringSystem(UAS)(商標(biāo)GeneraBiosystems)結(jié)合到珠子上。簡(jiǎn)而言之，該系統(tǒng)包含使用"橋"核酸分子來將核酸"標(biāo)簽"序列連接到具有靶序列的底物上。"橋"序列部分地與標(biāo)簽序列互補(bǔ)，且部分地與靶序列互補(bǔ)，使得橋序列可以結(jié)合標(biāo)簽和靶序列，并使它們保持直線排列(alignment)對(duì)齊，以^使可以^使用連接酶連接標(biāo)簽和靶序列。UAS也是商業(yè)上可才尋至ij的,且詳細(xì){己栽在www,generabiosystems.com/generabiosystetns/technology/UAS/。但是，不應(yīng)當(dāng)以4壬4可方式將本發(fā)明視作限于將核酸分子連接到底物上的該特定方法。應(yīng)物上的任何方法，可以確定擴(kuò)增子和反應(yīng)物之間是否已經(jīng)發(fā)生結(jié)合。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可定義為測(cè)量當(dāng)細(xì)胞或顆粒在液體懸浮液中運(yùn)動(dòng)或流動(dòng)時(shí)的性質(zhì)的技術(shù)?？膳c更熟悉的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備顯微鏡類比，以進(jìn)一步描述該技術(shù)。大多數(shù)顯微鏡具有如下組成光源典型的顯微鏡使用燈泡照明物體。在流式細(xì)胞儀中，光源通常是激光。使用激光是因?yàn)樗鼈儠?huì)提供非常集中和強(qiáng)烈的單色光束。光的單色特征在進(jìn)行熒光測(cè)量中特別重要。鏡臺(tái)在顯微鏡中，鏡臺(tái)是可移動(dòng)的，以允許物體通過目鏡的視野。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞或顆粒存在于液體懸浮液中。液體隨氣壓流經(jīng)物鏡，從而攜帶細(xì)胞或顆粒通過視野。透鏡在顯微鏡和流式細(xì)胞儀中，透鏡從物體收集光。一些顯微鏡具有濾鏡，以選擇對(duì)觀察者來說最重要的光的特征。在熒光顯微鏡中尤其如此。在熒光中，染料分子被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)，然后產(chǎn)生更長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光。濾鏡會(huì)除去激發(fā)光，以允許觀察或測(cè)量發(fā)射光。檢測(cè)器在顯微鏡中，光檢測(cè)器是觀察者。流式細(xì)胞儀使用稱為光電倍增管(PMT)的高靈敏性光檢測(cè)器。所述檢測(cè)器必須能夠測(cè)量來自細(xì)胞或顆粒的激發(fā)光的短暫閃爍，所述細(xì)胞或顆粒是以至多達(dá)每秒數(shù)千個(gè)的速率一次一個(gè)地通過物鏡視野。大多數(shù)流式細(xì)胞儀可測(cè)量散射光和焚光。圖1顯示了流式細(xì)胞儀的一個(gè)特定型號(hào)的主要組成。在底部的一個(gè)容器提供緩沖液，所述緩沖液攜帶細(xì)胞或顆粒通過儀器，而第二個(gè)容器收集所有廢液。載體流體(通常稱作鞘液)的目的是吸出懸浮液，以使細(xì)胞或顆粒以單列通過激光束。左前方的激光用藍(lán)色光束照明從試管向上流過的細(xì)胞或顆粒。正向的散射光通過與激光束(激光束本身被小的不透明柵阻擋)同軸的透鏡收集，并被反射到光檢測(cè)器上。通過與激光束成直角的透鏡收集側(cè)面散射光和熒光。所述儀器可測(cè)量在綠、橙和紅光譜區(qū)域的三色熒光。通過濾鏡分離顏色，所述濾鏡反射或只透過想要的波長(zhǎng)至合適的探測(cè)器。最后，所有來自探測(cè)器的電子信號(hào)傳輸?shù)接涗浰鼈兒惋@示結(jié)果的計(jì)算機(jī)(未顯示)。因?yàn)樗械臏y(cè)量值都是同時(shí)針對(duì)每一個(gè)細(xì)胞的，因此可確定它們之間的相關(guān)性。并且，可使用一種測(cè)量法選擇細(xì)胞子集，以用另一種測(cè)量法進(jìn)行研究。例如，可以檢查熒光和顆粒大小。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和/或分選珠子。然而，本發(fā)明絕不限定于前面描述的特定的流式細(xì)胞術(shù)方法或儀器。該實(shí)施例只作為說明性目的來提供，并且本發(fā)明不限定于根據(jù)提供的實(shí)施例的儀器或方法。使用流式細(xì)胞儀，通過物體散射光可確定給定的珠子的大小。光散射是光和物體的相互作用。所有物質(zhì)，包括珠子，都會(huì)散射光。其主要由反射或折射的光組成。觀察物體的位置通常決定可獲得的信息。在流式細(xì)胞儀中，光散射探測(cè)器通常位于激光的對(duì)面(相對(duì)于細(xì)胞或顆粒)，并且在激光的一側(cè)，與液流/激光束交點(diǎn)同軸。這些檢測(cè)器產(chǎn)生的測(cè)量分別稱為正向光散射和側(cè)向光散射。正向光散射會(huì)提供有關(guān)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的相對(duì)大小的一些信息，而側(cè)向光散射會(huì)提供有關(guān)單個(gè)細(xì)胞或顆粒的相對(duì)粒度的一些信息。它們通常一起用于區(qū)分未分離的哺乳動(dòng)物血液中不同的主要種類的白細(xì)胞，但也用于許多種其它測(cè)定中，例如確定微粒的大小。本發(fā)明者已確定流式細(xì)胞術(shù)能夠區(qū)別直徑約3.Onm，約3.5nm，約4.ljim，約5.(Vm，約5.6nm和約6.8fim的珠子。也可以區(qū)分其它珠子量級(jí)，例如，5.0至5.6和5.6至6.8。因此，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)為，流式細(xì)胞術(shù)可區(qū)分至多達(dá)至少6種不同大小的珠子。除了大小檢測(cè)外，流式細(xì)胞儀通常具有一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)樣品熒光的激光器和檢測(cè)器。熒光是分子的吸收特定波長(zhǎng)光并再發(fā)射更長(zhǎng)波長(zhǎng)光的特性。波長(zhǎng)的變化涉及在該過程中發(fā)生的能量損失。它是使熒光特別有用的特征濾鏡可用于排除來自光檢測(cè)器或觀測(cè)儀的激發(fā)光。因此，測(cè)量或觀察到的光只是來源于熒光團(tuán)的光。來自背景或照射到檢測(cè)器上的散射光的干擾是非常低的。有許多用于流式細(xì)胞術(shù)的熒光染料。它們結(jié)合多種細(xì)胞化學(xué)組分，例如核酸、蛋白、特定的細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)受體、細(xì)胞內(nèi)離子分子以及更多的成分。確定其用于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的潛力的焚光染料的關(guān)鍵特征是激發(fā)波長(zhǎng)，即它必須與可獲得的光源波長(zhǎng)匹配。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于診斷受試者被病原性分析物感染的方法，所述方法包含(i)從推定包含所述病原性分析物的受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，從受試者擴(kuò)增對(duì)照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與包被有反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與分析物或分析物的特定菌抹的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合，指示著分析物在受試者中的感染。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者"指對(duì)另一種分析物的感染易感的任何生物。這樣，"受試者"包括但不限于，動(dòng)物，植物，真菌和細(xì)菌(其可以被噬菌體感染)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"優(yōu)選地包括哺乳動(dòng)物，且更優(yōu)選靈長(zhǎng)類動(dòng)物，包括低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，且更優(yōu)選人。但是，術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"也特別地包括家畜例如牛，馬，綿羊，豬，山羊和驢以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和倉(cāng)鼠。兔子和嚙齒動(dòng)物，例如大鼠和小鼠，會(huì)提供方便的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或動(dòng)物模型，正如靈長(zhǎng)類動(dòng)物和低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物一樣。也設(shè)想到非哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，例如鳥類、斑馬魚、兩棲動(dòng)物(包括蟾蜍)和果蠅種類例如黑腹果蠅。"受試者"也可以是非動(dòng)物，例如植物。術(shù)語(yǔ)"植物"具體地包括具有農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物，例如谷類植物(例如小麥，大麥，燕麥，黑麥，黑小麥和玉米)，水稻，果樹(例如蘋果，香蕉，芒果和柑橘)，甘蔗，園藝作物植物(例如土豆，胡蘿卜和洋蔥)等。但是，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷人受試者中HPV感染的方法，所述方法包含(i)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iii)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌株特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對(duì)照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合指示著人受試者中的HPV感染。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明也設(shè)想到確定人受試者發(fā)展與一種或多種HPV菌林有關(guān)的疾病的危險(xiǎn)的方法，所述方法包含(i)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ii)從所述樣品分離核酸；(iU)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌株特有的擴(kuò)增子；(iv)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對(duì)照核酸序列；(v)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(vi)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(vii)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與包含多核苷酸的特定反應(yīng)物的結(jié)合，所述多核苷酸與特定疾病的相關(guān)HPV菌林互補(bǔ)，指示著受試者中所述疾病的增力口的危險(xiǎn)。如部分(v)所述的擴(kuò)增子的標(biāo)記是優(yōu)選的。因此，擴(kuò)增子和珠子都被標(biāo)記。與一種或多種特定HPV菌株有關(guān)的示例性疾病包括在表3中列出的那些。因此，在這方面，本發(fā)明提供了通過特異性地識(shí)別哪種HPV菌林感染受試者，診斷受試者發(fā)展特定疾病的增加的危險(xiǎn)的方法。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法適用于確定人受試者發(fā)展子宮頸癌的危險(xiǎn)。本發(fā)明還設(shè)想到用于本文所述的方法的診斷試劑盒，包括診斷人受試者的HPV感染和/或評(píng)價(jià)人受試者發(fā)展HPV相關(guān)疾病(包括子宮頸癌)的危險(xiǎn)。試劑盒包含反應(yīng)物的珠子集合，它們各自包含與特定HPV菌抹的核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上。任選地，試劑盒也可以包含結(jié)合到不同HPV菌株之間的保守序列上的引物，但是產(chǎn)生的擴(kuò)增子包含對(duì)于每種HPV菌林不同的核苷酸序列，其中所述產(chǎn)生的擴(kuò)增子推定與結(jié)合到試劑盒的一種或多種物理化學(xué)上可區(qū)分的珠子上的多核苷酸互補(bǔ)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)物的珠子集合包含至少一組珠子，各自具有約3.(Vm,約3.5jim，約4.ljim，約5.Ojim,約5.6nm和約6.8拜中的任一種直徑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，珠子的每個(gè)尺寸組包含一個(gè)或多個(gè)微球子群，各自具有不同強(qiáng)度范圍的熒光標(biāo)記物。更優(yōu)選地，熒光標(biāo)記物是TMR，且在約0%，約4%，約20%和約100%的強(qiáng)度使用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包含引物GP5+和GP6+和任選的引物L(fēng)C1-F和LC1-R。試劑盒也可以是固相芯片或支持物的形式，通常稱作生物芯片。在受試者測(cè)定中使用的所有或部分試劑可以摻入生物芯片或微小化到納米測(cè)定。盡管流式細(xì)胞術(shù)在測(cè)量受試者測(cè)定的輸出中是特別有用的，生物芯片可以用于測(cè)量或自動(dòng)化其它信號(hào)，例如與回音壁模式(whisperinggallerymode)測(cè)定有關(guān)的那些。盡管熒光強(qiáng)度是多重方法的優(yōu)選方面，本發(fā)明也設(shè)想到其它形式的鑒別。一種這樣的替代方法包括回音壁模式(WGM)檢測(cè)。在該實(shí)施方案中，將熒光標(biāo)記物摻入子集珠子中，或摻入或結(jié)合到珠子表面上的DNA。該熒光標(biāo)記物可以用激光或未聚焦的白光源或用過濾的未聚焦的白光源激發(fā)WGM。WGM只允許某些波長(zhǎng)的光從顆粒發(fā)射出來。該現(xiàn)象的結(jié)果是，來自例如熒光團(tuán)的普通的寬發(fā)射(10-lOOnm寬)帶受到限制，并作為一系列尖峰來出現(xiàn)，它們有效地與顆粒內(nèi)的光的靜止模式圖語(yǔ)相對(duì)應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定WGM特性是對(duì)微球顆粒表面的變化非常敏感的，且當(dāng)微球顆粒與分析物或它環(huán)境中的分子相互作用時(shí)，WGM特性會(huì)變化。因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面設(shè)想到檢測(cè)分析物的方法，所述分析物例如來自包含菌抹特異性序列的HPV菌林的擴(kuò)增子，所述方法包含使至少一個(gè)微球顆粒集合接觸推定包含所述分析物的樣品，其中微球顆粒集合內(nèi)的每個(gè)顆粒包含視覺可檢測(cè)的標(biāo)記和固定化的推定的所述分析物的結(jié)合伴侶(例如能結(jié)合、捕獲或固定化來自HPV菌林的擴(kuò)增子的引物或探針)，其中每個(gè)顆粒集合具有確定的WGM特性，其中所述分析物向所述固定化的結(jié)合伴倡的結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致所述至少一個(gè)微球顆粒集合的所述WGM特性的變化，這指示著所述分析物的存在。本發(fā)明的方法可以用于檢測(cè)微球顆粒的WGM特性的調(diào)控，其中所述調(diào)控來自樣品中的分子向固定化在微球顆粒表面上的潛在結(jié)合顆粒的結(jié)合的檢測(cè)?；赪GM特性的靈敏變化，檢測(cè)分析物和它的結(jié)合伴侶之間的結(jié)合反應(yīng)，能鑒別和分離分析物。本發(fā)明的一個(gè)特征是，可以用寬范圍的光源激發(fā)微球顆粒，促進(jìn)許多不同WGM特性的測(cè)量。"視覺可檢測(cè)的標(biāo)記"可以是發(fā)射熒光、磷光和/或白熱的任何分子、原子或離子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，視覺可檢測(cè)的標(biāo)記是熒光團(tuán)，其可以包括許多視覺可檢測(cè)的標(biāo)記，例如化學(xué)熒光團(tuán)和染料，以及量子點(diǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了微球顆粒，其包含直徑為lnm至lOOjim的橡膠(latex)或二氧化珪顆粒，并用視覺可檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，例如熒光團(tuán)或量子點(diǎn)，該顆粒還包含待測(cè)分析物的推定的結(jié)合伴侶。一個(gè)實(shí)例是捕獲核酸分子，其能結(jié)合使用側(cè)接菌林特異性區(qū)域的HPV基因組的保守區(qū)的2個(gè)引物擴(kuò)增產(chǎn)生的HPV擴(kuò)增子。視覺可檢測(cè)的標(biāo)記在可見波長(zhǎng)是可檢測(cè)到的，且該微球顆粒會(huì)表現(xiàn)出一種或多種WGM特性。當(dāng)分析物與固定化在顆粒上的結(jié)合伴侶相互作用時(shí)，會(huì)可檢測(cè)地調(diào)控微球顆粒的一種或多種WGM特性。WGM特性的任何這樣的變化，指示著已經(jīng)結(jié)合到它的結(jié)合伴侶上的分析物的存在。下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明實(shí)施例1:HPV診斷-DNA分離和擴(kuò)增在圖2中顯示了用于分離HPV診斷方法中的DNA的DNA提取方法的概況。如圖3所示，使用PCR來擴(kuò)增DNA樣品。使用引物GP5+和GP6+來產(chǎn)生存在于DNA樣品中的任何HPV菌林的擴(kuò)增子。引物GP6+包含熒光標(biāo)記物，更具體地是Cy5，以允許以后觀察擴(kuò)增子向結(jié)合試劑的結(jié)合。產(chǎn)生的病毒擴(kuò)增子包含保守區(qū)(Y)(它在所有檢查的HPV菌抹中是保守的)和在HPV菌抹之間可變的(即菌林特異性的)區(qū)域Xn,其中n代表與每種HPV菌林有關(guān)的可變區(qū)。固定化在珠子上的結(jié)合伴倡會(huì)特異性地結(jié)合HPV菌林特異性的基因組。另外，使用LC1—F和LC1-R引物作為對(duì)照，也產(chǎn)生了來自人受試者基因組DNA的擴(kuò)增子。在該情況下，引物L(fēng)Cl一R也攜帶Cy5標(biāo)記。實(shí)施例2:HPV診斷-多重檢測(cè)使在實(shí)施例1中產(chǎn)生的擴(kuò)增子與結(jié)合試劑的陣列雜交，每種結(jié)合試劑攜帶與從每種HPV菌林c，11，16，18，31，33，35，42，45，51，52，56，58，59，67和68(X,至Xj產(chǎn)生的推定病毒擴(kuò)增子的可變區(qū)互補(bǔ)的多核苷酸。固定化到珠子上的捕獲核酸的核苷酸序列見圖9。而且，該陣列包含，含有與HPV病毒擴(kuò)增子的保守區(qū)(Y)互補(bǔ)的多核苷酸的結(jié)合試劑。最后，包括如下的結(jié)合試劑，其包含與人對(duì)照擴(kuò)增子序列互補(bǔ)的多核苷酸。捕獲核酸可以是DM或RNA。如果使用RNA，可能需要逆轉(zhuǎn)錄酶來從DNA擴(kuò)增子產(chǎn)生RM。陣列中的每種結(jié)合試劑包含具有不同大小和不同熒光(TMR)標(biāo)記強(qiáng)度的微球或珠子。使用如圖4所示的流式細(xì)胞術(shù)，可以將具有3.Onm，3.5nm，4.ljim，5.O^irn,5.6fim和6.8jun的直^圣的珠子彼J:匕區(qū)分開。對(duì)于每種給定大小的微球，熒光標(biāo)記物(TMR)以0%，4%，20%和100%的相對(duì)強(qiáng)度摻入。使用如圖5所示的流式細(xì)胞術(shù)，可以清楚地區(qū)分開這些標(biāo)記強(qiáng)度。在圖1中顯示了讀取強(qiáng)度的機(jī)器。圖6是顯示在陣列中使用的每種結(jié)合試劑的示意圖?？梢钥闯?，陣列寸吏用具有3.0nm，3.5jun，4.1jim,5.Ojim，5.6jim和6.8jim直徑的微球，且焚光標(biāo)記物信號(hào)強(qiáng)度為0%，4%，20%和100%。不過，在更小的珠子大小的情況下，使用更少量級(jí)的信號(hào)強(qiáng)度。圖7顯示了如何在大小和熒光標(biāo)記強(qiáng)度的基礎(chǔ)上區(qū)分這些結(jié)合試劑中的每一種。圖8顯示了結(jié)合的擴(kuò)增子與陣列中的3種特異性的結(jié)合試劑的結(jié)合。在該圖中，證實(shí)了擴(kuò)增子會(huì)結(jié)合人DNA對(duì)照(Z)、病毒保守序列(Y)和病毒可變序列X7，這指示著HPV菌林18在樣品中的存在。實(shí)施例3:對(duì)比多重檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的HPVi^斷下面的表5提供了對(duì)比本發(fā)明的多重HPV檢測(cè)方法和現(xiàn)有的HPV診斷的組織學(xué)方法的概況。表5HPV診斷方法的對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>實(shí)施例4檢測(cè)人樣品中的HPV圖IOA至G提供了實(shí)施例，其中在人樣品中檢測(cè)到了HPV或發(fā)現(xiàn)缺少HPV。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)明白，本文所述的發(fā)明可以進(jìn)行具體描述以外的變化和修飾。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修飾。本發(fā)明也包括在本說明書中單獨(dú)地或統(tǒng)一地提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，和任一種或多種所述步驟或特征的任意和所有組合。參考文獻(xiàn)BonnerandLaskey，Eur.J.Biochem.46:83，1974Chadwicketal.，J.Virol.Methods70:59-70，1998ChanandFox,Rev.Med.Microbiol.10:185-196，1999Compton，Nature350:91-92，1991DemidovandBroude(Eds.)，"MAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications",HorizonBioscience,2004Gearhartetal.，www.emedicine.com/MED/topicl037.htm，2004Guatellietal.，Proc.NatlAcad.Sci.USA87:1874-1878，1990Hill，J.ClinKievitsetalKuskeetal.，1998Lizardietal.，Biotechnology6:1197-1202，1988Lyamichevetal.，Nat.Biotechnol.17:292-296，1999MarmurandDoty,J.Mol.Biol.5:109，1962NelsonandKrawetz，Anal.Biochem.207(1):97-201，1992Pawlotskyetal.，J.Virol.Methods79:227-235，1999Ryanetal.，Mol.Diagn.4:135-144，1999Speel,Histochem.Cel1Biol.112:89-113,1999Toddetal.，J.AIDSHum.Retrovirol.10:S35-S44,1995.UgandAssay19:43-51，1996.，JVirol.Methods35:273-286，1991ApplEnviron.Microbiol.64(7):2463—247權(quán)利要求1.珠子集合，其用于檢測(cè)HPV菌株和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌株，其中所述珠子集合包含多個(gè)珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌株特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌株。2.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述珠子大小選自3.O;xm，3.5拜，4.l拜，5.Ojim，5.6戶和6.8,。3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的珠子集合，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP，別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3,光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-l，噢唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa熒光染料，包括AlexaFluro-350，—430，—488，-532，—546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4'，5'-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素(J0E);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和R0X;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四曱基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B,FluorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的珠子集合，其中所述珠子上的核酸捕獲探針是DM。5.權(quán)利要求l的珠子集合，其包含2-16個(gè)珠子子集。6.權(quán)利要求5的珠子集合，其中所述珠子集合包含16個(gè)珠子子集。7.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述HPV菌林選自菌林6，11，1618,31，33,35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。8.權(quán)利要求7的珠子集合，其中所述HPV菌林選自6，11,31和33。9.權(quán)利要求1的珠子集合，其中所述核酸捕獲探針選自SEQIDNO:5至20。10.制備用于檢測(cè)一種或多種HPV菌抹和/或用于區(qū)分兩種或多種HPV菌林的珠子集合的方法，該方法包含選擇多珠子子集，其中(a)每個(gè)子集的珠子是大小均勻的；(b)每個(gè)子集內(nèi)的珠子與核酸捕獲探針相偶聯(lián)，所述核酸捕獲探針能結(jié)合HPV基因組的HPV菌抹特異性的區(qū)域；(c)每個(gè)珠子上的反應(yīng)物標(biāo)有相同的標(biāo)記，每個(gè)珠子子集具有不同的熒光強(qiáng)度，以建立基于熒光強(qiáng)度的珠子的異質(zhì)混合物；和(d)將至少2個(gè)珠子子集混合到一起，產(chǎn)生一個(gè)珠子集合，其中通過基于大小、熒光強(qiáng)度和序列辨別的流式細(xì)胞術(shù)，識(shí)別子集身份，并從而識(shí)別HPV菌林。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述珠子大小選自3.Ojim,3.5jim，4.ljim，5.Ofim，5.6jim和6.8拜。12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，曱氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP，別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYT0XBlue,hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1，SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，瘞唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa焚光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680，-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7，熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4'，5'-二氯-2，，7，-二曱氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和ROX;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四曱基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，B0DIPY-FL和德克薩斯紅。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸捕獲探針是DNA。14.權(quán)利要求13的方法，包含選擇2至16個(gè)珠子子集。15.權(quán)利要求14的方法，包含選擇16個(gè)珠子子集。16.權(quán)利要求10的方法，其中所述HPV菌林選自6，11,16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述HPV菌林選自菌林6，11,31和33。18.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸捕獲探針選自SEQIDNO:5至20。19.診斷人受試者中HPV感染的方法，所述方法包含(viii)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ix)從所述樣品分離核酸；(x)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所述分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(xi)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對(duì)照核酸序列；(xii)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(xiii)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(xiv)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與特定反應(yīng)物的結(jié)合指示著人受試者中的HPV感染。20.確定人受試者發(fā)展與一種或多種HPV菌抹有關(guān)的疾病的危險(xiǎn)的方法，所述方法包含(viii)從推定包含HPV的人受試者，得到生物樣品；(ix)從所述樣品分離核酸；(x)使用引物從所述樣品擴(kuò)增核酸，所述引物產(chǎn)生與所述分析物或所迷分析物的特定菌林特有的擴(kuò)增子；(xi)任選地，擴(kuò)增來自人受試者基因組DNA的對(duì)照核酸序列；(xii)任選地，標(biāo)記在步驟(iii)和/或(iv)所述的擴(kuò)增子；(xiii)使標(biāo)記的擴(kuò)增子與反應(yīng)物的珠子集合雜交，其中珠子集合的每個(gè)成員包含與HPV或特定HPV菌林的核苷酸序列具有互補(bǔ)性的核酸分子，其結(jié)合或者連接在物理化學(xué)上可區(qū)分的底物上；和(xiv)確定擴(kuò)增子已經(jīng)結(jié)合的那種反應(yīng)物；其中所述擴(kuò)增子與包含多核苷酸的特定反應(yīng)物的結(jié)合，所述多核苷酸與特定疾病的相關(guān)HPV菌抹互補(bǔ)，指示著受試者中所述疾病的高危險(xiǎn)。21.權(quán)利要求19和20的方法，其中所述珠子大小選自3.Onm，3.5拜，4.ljim，5.Ojim，5.6nm和6.8拜。22.權(quán)利要求19或20中任一項(xiàng)的方法，其中所述珠子用選自下述的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記羥基香豆素，氨基香豆素，甲氧基香豆素，瀑布藍(lán)，熒光黃，NBD，Phyccerythrin(PE)，PerCP,別藻藍(lán)蛋白，hoechst33342，DAP1，SYTOXBlue，hoechst33258，色霉素A3，光輝霉素，Y0Y0-1,SYT0X綠，SYT0X橙，7-AAD，吖咬橙，T0T0-1，To-PR0-1，瘞唑橙，T0T0-3，T0-PR0-3，LDS751，Alexa焚光染料，包括AlexaFluro-350，-430，-488，-532，-546，-555，-556，-594，-633，-647，-660，-680,-700和-750;BoDipy染料，包括BoDipy630/650和BoDipy650/665;CY染料，尤其是Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5和Cy7;6-FAM(熒光素)；PE-Cy5，PE-Cy7,熒光素dT;六氯熒光素(Hex);6-羧基-4、5'-二氯-2，，7，-二甲氧基熒光素(JOE);俄勒岡綠染料，包括488-X和514;羅丹明染料，包括X-羅丹明，麗絲胺羅丹明B，羅丹明綠，羅丹明紅和R0X;TRITC，四甲基羅丹明(TMR);羧基四甲基羅丹明(TAMRA);四氯熒光素(TET);Red6B，F(xiàn)luorX，BODIPY-FL和德克薩斯紅。全文摘要本發(fā)明一般地涉及診斷和檢測(cè)測(cè)定領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的一種或多種分析物的存在或區(qū)分它們的方法和試劑，包括生物芯片。文檔編號(hào)G01N15/14GK101341257SQ200580040234公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2005年12月9日優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日發(fā)明者K·波特,T·戈?duì)柕律暾?qǐng)人:杰納羅生物系統(tǒng)有限公司