專利名稱：紅色裸甲藻的檢測探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組藻類檢測的寡核苷酸探針，具體地說是針對紅色裸甲藻定性與定量檢測的特異性探針。屬于核酸檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紅色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)是一種廣泛分布與世界近岸海域常見的鞭毛藻類，是主要的赤潮生物之一，有多次形成有害赤潮，造成養(yǎng)殖魚類大量死亡的記錄，給海洋漁業(yè)和人類健康帶來巨大威脅。據(jù)報道我國于1998年8月15日～9月10日的煙臺40里海灣海域首次發(fā)生大規(guī)模的紅色裸甲藻赤潮，面積達170平方公里，造成養(yǎng)殖扇貝、海參、鮑魚的大量死亡。因此，及時、準確、快速地檢測海洋環(huán)境中紅色裸甲藻的種群動態(tài)，隨時了解其在海洋中的數(shù)量變化具有重要意義。傳統(tǒng)的利用光學顯微鏡直接觀察和計數(shù)的鑒別方法，過程煩瑣、費時、費力，并需要有經(jīng)驗的分類專家參與其中。當樣品量多，生物多樣性豐富，監(jiān)測范圍廣時工作量極大，因此主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量與大范圍監(jiān)測研究。所以，發(fā)展用于快速、準確檢測紅色裸甲藻的新方法和新技術(shù)極具現(xiàn)實意義。但是，目前國際國內(nèi)關(guān)于這方面的研究進展不大，尚未形成非常有效的對該藻進行定性和定量檢測的成熟技術(shù)。由于rRNA被認為是與藻類的系統(tǒng)進化密切相關(guān)的序列，而且真核生物細胞中rRNA含量非常高，可以達到106～107個拷貝，rRNA是夾心雜交的很好的靶點。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，Christopher A.Scholin等在《利用rRNA在全細胞和“三明治”雜交中識別南方菱形藻》(美國《藻類學雜志》，1996，35(3)，190～197)一文中將提取的RNA或者藻細胞裂解液在一定條件下與結(jié)合在96孔板上的寡核苷酸探針雜交后，再用一標記的信號探針與之雜交，最后進行酶標抗體顯色反應，取得了較滿意的結(jié)果。該技術(shù)現(xiàn)在海洋藻類的監(jiān)測中已經(jīng)有所應用。但到目前為止，應用該技術(shù)能夠檢測的微藻只限于有限的幾種(其中包括了紅色裸甲藻)。其主要缺點是一，因捕獲探針的長度僅10～30bp，因此能夠有效區(qū)別親緣關(guān)系較近的微藻的捕獲探針數(shù)量極少；二，在整個檢測過程中都需要防止RNA降解，然而洗滌、抗體反應等各步驟極易造成RNA降解，因此操作難度大、檢測結(jié)果波動性大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組針對紅色裸甲藻rRNA的特異性的紅色裸甲藻的檢測探針，依據(jù)這組探針對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，實現(xiàn)對該藻的快速定性和定量。
本發(fā)明用于對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針、抓捕探針、信號探針或者連接探針，所述的S1酶保護分析探針，是指與紅色裸甲藻rRNA互補而且用于S1酶保護分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護分析探針的一端結(jié)合，這一端通常為3’端，另外一端標記有生物素，從而將經(jīng)過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護分析探針捕獲下來的探針，所述的信號探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護分析探針后，結(jié)合于S1酶保護分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時該探針標記有可檢測信號，或者在一端具有信號探針結(jié)合區(qū)，能夠與通用信號探針互補。
S1酶保護分析探針在進行生物信息學比對分析時，僅與紅色裸甲藻核糖體小亞基1460～1560區(qū)域核苷酸互補，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為59bp，在一定的條件下可特異性結(jié)合于紅色裸甲藻的rRNA上，序列為5’CGATGCGATTTAAGAAGATTACCCAATCCTGCCGGACCAGGCAGAAACTCGTTGACCGC。通過測定紅色裸甲藻的rRNA序列，進行多序列比較，尋找紅色裸甲藻的特征序列，作為該藻的rRNA特異區(qū)域，然后根據(jù)該rRNA特異區(qū)域序列(特征序列)設(shè)計S1酶保護分析探針。尋找生物特異性區(qū)域的方法以及根據(jù)特異區(qū)域設(shè)計探針都采用現(xiàn)有技術(shù)。已有的實驗表明，不同藻rRNA之間若存在2～3個以上核苷酸的連續(xù)錯配或者缺失就可以作為特異探針設(shè)計的靶序列。
抓捕探針特異性結(jié)合于S1酶保護分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-GCGGTCAACGAGTTTCTGCCTG，在5’端標記有生物素、磷酸基團，或者氨基基團以及其他任何可以用來標記可以用于固定于固體基質(zhì)的標記。
信號探針或者連接探針在一端與S1酶保護分析探針互補，而在另一端具有通用信號探針互補區(qū)，與通用信號探針互補結(jié)合，長度為25bp，序列為5’-TGGGTAATCTTCTCAAATCGCATCG；該序列上標記各種檢測的信號，具體包括熒光素、地高辛、生物素用于信號檢測的序列，或者與通用的信號探針互補的一段序列。
通用信號探針與連接探針的一端(不同于與S1酶保護分析探針互補結(jié)合的一端)互補。常用的標記物包括(但并不限于)地高辛、熒光素、生物素或者辣根過氧化物酶等。
簡而言之，本發(fā)明是針對紅色裸甲藻的rRNA特定區(qū)域合成以S1酶保護分析探針為核心的一組探針，聯(lián)合S1酶保護分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對紅色裸甲藻rRNA的定性定量檢測。
本發(fā)明的這組探針可用于以S1酶保護分析和夾心雜交技術(shù)檢測樣品中是否存在紅色裸甲藻及其數(shù)量，所述的檢測過程包括下列步驟(a)待檢測樣品和S1酶保護分析探針的混合在該步驟中，可以將經(jīng)裂解處理已釋放出rRNA的待檢測的微藻樣品與S1酶保護分析探針混合。也可以將待檢測的微藻樣品與S1酶保護分析探針直接混合，然后再進行裂解處理，從而釋放rRNA。一旦釋放出的rRNA包含對應于S1酶保護分析探針的靶序列，經(jīng)過雜交，則會與S1酶保護分析探針形成雙鏈。
(b)S1酶處理當S1酶保護分析探針與待檢測生物的rRNA雜交后，用適當濃度(通常為0.5U～2U/μl，較佳地為1U/μl)的S1酶消化過量游離的探針；當該探針與其他非目標rRNA反應時，由于雜交體存在切口或小缺口，S1酶亦能將該探針切斷；最終保留下與完全匹配的S1酶保護分析探針和紅色裸甲藻的rRNA形成的DNA/RNA雙鏈，而且該雙鏈的量代表了樣本中相應的rRNA的量。
(c)DNA-RNA雜合體的變性將DNA/RNA雙鏈雜合體變性為DNA單鏈(即S1酶保護分析探針)和RNA單鏈。合適的變性方法沒有特別限制，可以用本領(lǐng)域常用的各種變性方法，例如熱變性等。例如，加入中和溶液后加熱，使S1酶保護分析探針和目標生物的rRNA形成的雜合體變性，從而釋放出保留下來的S1酶保護分析探針。由于RNA不穩(wěn)定，解鏈形成的RNA單鏈易被內(nèi)源或外源的RNA酶降解。
(d)捕獲S1酶保護分析探針將保留有S1酶保護分析探針的溶液與預先固定于固相載體上的抓捕探針雜交，將S1酶保護分析探針特異地抓捕在固相載體上，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
(e)結(jié)合帶可檢測信號的探針用連接探針與被捕獲的S1酶保護分析探針雜交，并洗滌除去非特異的結(jié)合，再用信號探針與連接探針結(jié)合，并洗滌除去非特異的結(jié)合。
(f)信號檢測可用本領(lǐng)域常規(guī)方法對可檢測信號進行信號檢測。例如信號探針上可以標記上熒光信號，這樣通過激發(fā)熒光來讀取數(shù)據(jù)；也可以在信號探針上標記上地高辛、熒光素或者生物素等，然后通過辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗體或者親和素與之反應；最后加入發(fā)光底物或者顯色底物(TMB或者NPP等)，通過探測發(fā)光強弱或者吸光度來判讀信號。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)探針適用性好夾心雜交特異識別的關(guān)鍵是抓捕探針的特異性，一般情況抓捕探針約長20～30核苷酸，該探針要具有特異性，必須與其他非目標生物的rRNA分子要有較大的差異，盡管不同生物的rRNA在進化上會有差異，但在找到并成功驗證親緣關(guān)系較近的生物之間的特異性探針并不是一件容易的事，這可能也是夾心雜交技術(shù)發(fā)展到現(xiàn)在只有找到很少量抓捕探針的原因之一。本發(fā)明中涉及的S1酶保護分析探針，盡管長度在60個核苷酸左右，但并不要求探針全長都要有特異性，而只要求探針的中間區(qū)域有幾個核苷酸的差異即可，這大大方便了特異探針的尋找和實現(xiàn)。
(2)穩(wěn)定性高夾心雜交技術(shù)成功執(zhí)行的關(guān)鍵之一在于保證RNA分子在整個過程不被降解，特別要保證抓捕探針與信號探針之間的那段目標RNA分子(可能在幾十到幾百個核苷酸之間)在整個實驗過程的完好無損。但由于實驗過程涉及抗原抗體反應和多次洗滌步驟，這為RNA酶對RNA分子降解提供了較多機會，因此要保證目標RNA分子不被降解有非常大的難度。即使最終能夠?qū)崿F(xiàn)定性分析，定量分析的可信度也大大打了折扣。而本發(fā)明中直接與rRNA分子相關(guān)的過程只有S1酶保護分析探針與rRNA分子雜交這一步，只要雜交裂解液加入適當?shù)腞NA酶抑制劑就能保證雜交時rRNA分子不被降解或很少被降解，實驗操作的其他步驟都是針對穩(wěn)定的DNA分子進行的，相對比較容易執(zhí)行。因此本發(fā)明的穩(wěn)定性遠遠高于夾心雜交技術(shù)。


圖1是紅色裸甲藻的檢測探針用來探測各種不同藻的示意圖。
圖2是對不同細胞數(shù)的紅色裸甲藻的檢測曲線示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖，在具體實施例進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例應用針對rRNA的S1酶保護分析和夾心雜交技術(shù)對紅色裸甲藻定性定量檢測。
在本實施例中，將S1酶保護分析技術(shù)和夾心雜交技術(shù)聯(lián)合用來實現(xiàn)對海洋赤潮生物紅色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum)的定性和定量檢測，步驟如下1.1紅色裸甲藻rRNA特異區(qū)域的尋找和S1酶保護分析探針的設(shè)計與合成通過測定紅色裸甲藻核糖體小亞基18S rRNA序列并與其它藻類的rRNA序列進行多序列比較，找到其在小亞基rRNA的1460～1560區(qū)域與其它藻類不同，確定該區(qū)域序列為特征序列；根據(jù)特征序列設(shè)計和合成S1酶保護分析探針SNG_S15’-CGATGCGATTTAAGAAGATTACCCAATCCTGCCGGACCAGGCAGAAACTCGTTGACCGC(SEQ IDNO.1)。
根據(jù)S1酶保護分析探針設(shè)計和合成夾心雜交所需的其他探針抓捕探針SNG_CAPT5’-Biotin-GCGGTCAACGAGTTTCTGCCTG(SEQ ID NO.2)，與S1酶保護分析探針的3’端互補，在5’端有生物素(Biotin)標記；連接探針SNG_LINK5’-TGGGTAATCTTCTCAAATCGCATCGTAACAACTCACCTGCCGAATGAACTAGCCCTG(SEQ IDNO.3)，在5’端的25個核苷酸與S1酶保護分析探針的5’端互補，在3’端的32個核苷酸與通用信號探針的5’端互補。
1.2抓捕探針固定于酶標板抓捕探針的固定方法在預先包被有親和素的酶標板(Pierce公司)的每一孔中加入100μl溶解于碳酸鹽緩沖液CBS(pH7.2)的40nM抓捕探針，37℃靜置2小時。用磷酸鹽緩沖液PBS洗三次備用。
1.3 S1酶保護分析將用f2培養(yǎng)基培養(yǎng)的海藻樣品計數(shù)后，離心收集于1.5ml塑料管中，棄去上清，加入濃度為50nM S1酶保護分析探針的1000μl裂解液(0.8％十二烷基磺酸鈉SDS，1.2M尿素，20％甲酰胺，0.3M氯化鈉，50mM三羥甲基氨基甲烷，pH7.0)。
進行紅色裸甲藻的特異性驗證時，將裸甲藻、米氏裸甲藻、塔瑪亞歷山大藻、角毛藻、中肋骨條藻、新月菱形藻、諾氏海鏈藻、膜質(zhì)舟形藻、直鏈藻、赤潮異彎藻、海洋原甲藻、微型原甲藻、尖刺菱形藻等各約106個細胞分別進行上述處理。
進行紅色裸甲藻的檢測曲線分析時，將過濾收集到的紅色裸甲藻樣品用含有S1酶保護分析探針的裂解液10倍逐級稀釋6次共獲得7個樣品。
對于海藻樣品和S1酶保護分析探針的混合物，超聲波處理兩分鐘，將混合溶液在95℃放置10分鐘，然后70℃雜交2小時。自然冷卻后加入500μl含有800U S1酶(Promega公司)的S1酶解緩沖液(50mM硫酸鋅，500mM醋酸鈉，50mM氯化鈉pH4.5)，在50℃酶切處理30分鐘。
1.4 DNA-RNA雜合體的變性加入250μl變性緩沖液(1.5M氫氧化鈉，300mM EDTA)，95℃處理10分鐘，自然冷卻后用于夾心雜交。此時DNA-RNA雜合體變性形成單鏈DNA(即曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護分析探針)和單鏈RNA。與此同時，單鏈RNA被降解，因此溶液中僅含曾結(jié)合于靶序列的S1酶保護分析探針。
1.5夾心雜交抓捕將100μl上述變性后的反應混合液分別移入到預固定有抓捕探針的酶標板微孔中，50℃雜交1小時，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
夾心雜交每孔加入含有100μl 5nM連接探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)，于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次；每孔加入含有100ul 5nM信號探針的雜交緩沖液(2×SSC，0.5％SDS)于50℃雜交30分鐘，用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗滌液洗6次。
1.6信號檢測酶標板用磷酸緩沖液(PBS)洗6次；每孔加入含有標記了辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體(購自Roche公司)，37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗6次；每孔加入TMB(購自Pierce公司)顯色液100μl，37℃處理15分鐘后，每孔加入50μl 2M硫酸終止反應。將酶標板置于讀板機上于450nm測定光吸收值。
1.7結(jié)果檢測結(jié)果如圖1和圖2所示。
圖1顯示了用針對紅色裸甲藻的探針探測各種不同的藻的檢測結(jié)果，證明了本發(fā)明方法具有極高的可行性和特異性。
對數(shù)據(jù)用常規(guī)統(tǒng)計方法進行擬合，獲得如下關(guān)系y＝0.0033x+0.046；R2＝0.9967；x為樣品中紅色裸甲藻的細胞數(shù)，y為實際測定的OD.450，R2為相關(guān)系數(shù)。
下表列出了用本實施例方法測定的紅色裸甲藻樣品數(shù)量與顯微計數(shù)結(jié)果的比較

序列表<110>中國海洋大學<120>紅色裸甲藻的檢測探針<160>3<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>紅色裸甲藻rRNA序列的互補堿基序列。
<400>1cgatgcgatt taagaagatt acccaatcct gccggaccag gcagaaactc gttgaccgc 59<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’端標記有生物素、磷酸基團，或者氨基基團。
<400>2gcggtcaacg agtttctgcc tg 22<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’端可標記地高辛、熒光素、生物素或者辣根過氧化物酶等。
<400>3tgggtaatct tctcaaatcg catcg2權(quán)利要求
1.一種紅色裸甲藻的檢測探針，其特征在于，用于對該藻進行S1酶保護分析和夾心雜交檢測，具體包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針、抓捕探針、信號探針或者連接探針，所述的S1酶保護分析探針，是指與紅色裸甲藻rRNA互補而且用于S1酶保護分析方法的寡核苷酸探針，所述的抓捕探針，是指與S1酶保護分析探針的一端結(jié)合，這一端通常為3’端，另外一端標記有生物素，從而將經(jīng)過S1酶酶切處理和變性處理后保留在溶液中的S1酶保護分析探針捕獲下來的探針，所述的信號探針或者連接探針能夠在抓捕探針捕獲S1酶保護分析探針后，結(jié)合于S1酶保護分析探針的另一端的的探針為連接探針，同時該探針標記有可檢測信號，或者在一端具有信號探針結(jié)合區(qū)，能夠與通用信號探針互補。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色裸甲藻的檢測探針，其特征是，所述的紅色裸甲藻rRNA之間若存在2～3個以上核苷酸的連續(xù)錯配或者缺失可作為特異探針設(shè)計的靶序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色裸甲藻的檢測探針，其特征是，所述的S1酶保護分析探針，在進行生物信息學比對分析時，僅與僅與紅色裸甲藻核糖體小亞基1460～1560區(qū)域核苷酸互補，而與其它藻核糖體RNA無同源性，長度為59bp，在一定的條件下可特異性結(jié)合于紅色裸甲藻的rRNA上，序列為5’-CGATGCGATTTAAGAAGATTACCCAATCCTGCCGGACCAGGCAGAAACTCGTTGACCGC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色裸甲藻的檢測探針，其特征是，所述的抓捕探針特異性結(jié)合于S1酶保護分析探針一端，長度為22bp，序列特征為5’-GCGGTCAACGAGTTTCTGCCTG，在5’端標記有生物素、磷酸基團，或者氨基基團以及其他任何可用來標記的用于固定于固體基質(zhì)的標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅色裸甲藻的檢測探針，其特征是，所述的信號探針或者連接探針在另一端具有通用信號探針互補區(qū)，與通用信號探針互補結(jié)合，序列為5’-TGGGTAATCTTCTCAAATCGCATCG；該序列上標記各種檢測的信號，具體包括熒光素、地高辛、生物素用于信號檢測的序列，或者與通用的信號探針互補的一段序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅色裸甲藻的檢測探針，屬于核酸檢測領(lǐng)域。具體針對紅色裸甲藻的rRNA特定區(qū)域合成以S1酶保護分析探針為核心的一組探針，聯(lián)合S1酶保護分析和夾心雜交技術(shù)實現(xiàn)對紅色裸甲藻rRNA的定性定量檢測。所述檢測探針包括三條相互關(guān)聯(lián)的寡核苷酸探針S1酶保護分析探針、抓捕探針、信號探針或者連接探針。本發(fā)明探針適用性好，大大方便了特異探針的尋找和實現(xiàn)。本發(fā)明的穩(wěn)定性遠遠高于夾心雜交技術(shù)。
文檔編號G01N33/50GK1624477SQ20041007553
公開日2005年6月8日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 蔡青松, 米鐵柱, 甄毓 申請人:中國海洋大學