專利名稱：Adam12，一種細胞功能異常的新標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的整體發(fā)明意圖是涉及，一種通過確定ADAM12水平，篩查個體中細胞功能異常的方法。
具體的，本發(fā)明涉及提供用于篩查妊娠和非妊娠個體中異常的方法，其基于檢測來自所述個體的生物樣品的ADAM12。具體的，本發(fā)明描述了用于篩查妊娠和/或非妊娠個體中改變的局部增值狀態(tài)的方法，其包括檢測ADAM12水平。

背景技術(shù)：
細胞功能異常是許多與生活方式和遺傳有關(guān)的疾病中的普遍問題，例如癌癥和許多已知的染色體異常。
唐氏綜合癥(Down syndrome)，也稱為21三體癥，是多種腦力發(fā)育遲緩的最普遍的先天性原因，其為存在額外的21號染色體而導致的細胞功能異常的結(jié)果。以前，胎兒的唐氏綜合癥可以通過包括羊水診斷或絨膜絨毛取樣和染色體分型的診斷程序來確定。
這些診斷程序是侵入性的并且對母體和胎兒都有風險。由于這個以及其它一些原因，羊水診斷或絨膜絨毛取樣和染色體分型不能在整個妊娠期間常規(guī)地進行。與此相反，當對于妊娠的風險保證進行侵入性診斷程序的風險時，可以利用一種或多種篩查方法進行確定。
例如唐氏綜合癥的發(fā)生隨著母親年齡的增高而顯著增高。以前，唐氏綜合癥的產(chǎn)前檢測集中在35歲以上的妊娠婦女，在這個年齡唐氏綜合癥的風險接近或超過(母親年齡＞40歲)用來檢測胎兒唐氏綜合癥的診斷程序的風險。多種其他胎兒染色體紊亂的發(fā)生，例如特納氏綜合癥和三倍體不依賴于母親的年齡。因此，產(chǎn)前篩查21三體癥，18三體癥和13三體癥的標準方法涉及基于母親的年齡選擇婦女進行診斷性羊水診斷。但是，年齡并不是充分的篩查依據(jù)，因為，只有約20％的唐氏綜合癥妊娠能夠通過對最具風險的婦女的5％(也就是年齡在35歲以上的婦女)進行羊水診斷和染色體分型來檢測。并且，因為在實際的臨床實踐中，只有約一半的35歲以上的婦女進行了羊水診斷和染色體分型，不到10％的唐氏綜合癥妊娠得到產(chǎn)前診斷。
1984年，發(fā)現(xiàn)了降低的母血甲胎蛋白(AFP)與胎兒唐氏綜合癥之間的相關(guān)性。降低的母血AFP與胎兒唐氏綜合癥之間的相關(guān)性提供了在年輕的顯然未受影響的家庭中使用非侵入性血液篩查試驗的機會，在所述家庭中發(fā)生了約80％的唐氏綜合癥。
另一個篩查方法包括檢測母血中游離雌三醇(UE)的水平。后來發(fā)現(xiàn)了完整HCG分子和HCG的α亞單位(HCG包括兩個亞單位)母血水平的提高與胎兒唐氏綜合癥之間的相關(guān)性。
自從二十世紀90年代早期，已經(jīng)使用多標記物血液檢驗來篩查例如唐氏綜合癥。該檢驗的普遍的形式是三標記物三重檢驗(triple test)。該三重篩查(triple screen)測量妊娠婦女血清中的AFP、人絨毛膜促性腺激素(hCG)和游離雌三醇(UE3)。
象三重檢驗這樣的產(chǎn)前篩查能夠用于減少對羊水診斷的需要或提高相同量的羊水的遺傳缺陷的檢測。該三重篩查結(jié)合來自血清的三種標記物的分析來減少導致進行不必要的侵入程序的假陽性結(jié)果和導致嚴重遺傳缺陷(例如21三體癥)未被檢出。
在35歲以下的婦女中，雙重篩查(AFP和HCG)能夠在中孕期期間檢測出約一半的唐氏綜合癥病例和大多數(shù)其他染色體缺陷。三重篩查(AFP、HCG和UE3)使檢出率提高了5-10％，并進一步提高許多其他嚴重染色體缺陷的檢出，因此降低了假陽性的量。
但是，這樣的比率意味著，雙重和三重篩查依然沒有檢出很大數(shù)量的唐氏綜合癥和其他被妊娠影響的非整倍體，并且該檢驗僅限于中孕期。
盡管三重篩查具有暗示的15至20孕周的篩查期，但這樣的篩查已經(jīng)被推薦在16-18孕周來以使脊柱裂檢測時限最大化(Canick和Krnight)。
1992年的一項對于僅AFP或多項分析的產(chǎn)前的母體血清篩查的調(diào)查報道，在第13周或更早的妊娠期幾乎沒有進行篩查(Palomaki等人)。
因此這些篩查存在另外的問題，即一旦預測到遺傳缺陷的風險就要實行羊水診斷或其他侵入性產(chǎn)前確診程序歷來診斷遺傳缺陷(例如唐氏綜合癥)，正是在妊娠晚期，妊娠終止對于母親在身體和精神上可能更加痛苦，并且能夠利用的創(chuàng)傷性流產(chǎn)術(shù)例如真空吸刮術(shù)是更少的。最近，已經(jīng)證明，在早孕期利用妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)和游離β人絨毛膜促性腺激素(βHCG)的血清學標記物復合物和超聲標記的頸部半透明(結(jié)合早孕期篩查)來篩查染色體疾病的方法，在8-14周發(fā)揮作用，其唐氏綜合癥檢出率為大約80％-90％，假陽性率為3-5％(Bindra等人，2002)。
理論上，預測在相同妊娠的早孕期和中孕期檢驗的聯(lián)合使用將是最有效的篩查，其具有＞90％的唐氏綜合癥檢出率以及大約1％的假陽性率(Wald等人，1999)。
但是，為了提高檢出率和/或降低假陽性率，需要可以補充或替換現(xiàn)有篩查標記物的新標記物。
人工篩查狀態(tài)和不必要的相反結(jié)果的限制，具有潛在危害和價格昂貴的侵入性診斷程序，例如羊水診斷或絨膜絨毛取樣，已經(jīng)導致對于產(chǎn)前篩查唐氏綜合癥和非整倍體的更有識別能力的標記物的研究。
隨著胎兒疾病和不良妊娠的出現(xiàn)，例如妊娠早期的唐氏綜合癥和其他染色體疾病，已經(jīng)開始研究多種生物化學標記物。已經(jīng)常規(guī)使用的其他標記物為，所謂妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)的IGF依賴型IGFBP-4和非IGF依賴型IGFBP-5蛋白酶，其還表現(xiàn)出作為生長發(fā)育遲緩和早產(chǎn)標記物的潛在的臨床重要性。
盡管這些篩查方法確實檢測出胎兒唐氏綜合癥，但是仍然需要和期待一種方法，其能夠檢測出更多的胎兒唐氏綜合癥病例。因此，本發(fā)明描述了產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的顯著進步。
已經(jīng)通過免疫印跡，在妊娠血清中檢測到ADAM12，而在非妊娠血清中則沒有(Shi等人合，Loechel等人)，并且ADAM12的mRNA在胎盤中也特別豐富(Gilpin等人)。
在胎盤中，ADAM12由滋養(yǎng)層產(chǎn)生。ADAM12是一種去整合素和金屬蛋白酶，其在乳癌和結(jié)腸癌以及它們的肝轉(zhuǎn)移中被上調(diào)(Iba等人1999，Le Pabic等人2003)，并且ADAM12的尿水平與乳癌中的疾病狀態(tài)和發(fā)展有關(guān)(Roy等人2004)。
本發(fā)明人在2003年公開了，ADAM12是早孕期唐氏綜合癥母體血清標記物(Laigaard等人2003)，并在2005年公開了母體血清中ADAM12-S水平是胎兒早孕期18三體癥標記物(Laigaard等人2005)。
EP 1 524 523記載，在先兆子癇患者胎盤中，ADAM12的表達、特殊轉(zhuǎn)錄受到強烈上調(diào)。但是，EP 1 524 523沒有記載血清ADAM12的濃度變化，特別是沒有記載其水平與孕齡的關(guān)系。
如果ADAM12濃度沒有進行關(guān)于孕齡的標準化-即轉(zhuǎn)化成不依賴孕齡的值-例如通過母體血清中檢測到的ADAM12濃度除以獲得該樣品的特殊孕齡的中值得到的值(中值倍數(shù)，multiple of median-MoM)，那么ADAM12濃度值的個體間差異將降低標記物的識別能力。
發(fā)明概要 本發(fā)明提供了用于指示提供細胞功能異常的方法、分析法和試劑盒。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，血清ADAM12濃度變化作為預測細胞功能異常帶來的臨床結(jié)果、并發(fā)癥和死亡率的預后工具是有用的。
本發(fā)明人描述了作為細胞功能異常全面標記物的ADAM12，同時本發(fā)明人第一次證明了，ADAM12是胚胎和胎盤發(fā)育、功能的重要指示劑，并且ADAM12可以反映疾病的存在，分類或進展。
本發(fā)明人開發(fā)了一種酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)和一種時間分辨熒光免疫分析法，用于量化血清中的ADAM12。
本申請在三項研究中證明，樣品樣品樣品樣品ADAM12減少了早孕期唐氏綜合癥和18三體癥母體血清并終止了中孕期唐氏綜合癥妊娠，在三項研究中第一項包括來自早孕期唐氏綜合癥妊娠的18個母體血清樣品，第二項包括來自早孕期唐氏綜合癥妊娠的226個早孕期母體血清樣品和89個中孕期唐氏綜合癥妊娠母體血清樣品，第三項包括來自早孕期18三體癥妊娠的10個母體血清樣品。因此ADAM12也許可以用作胎兒疾病的母體血清風險標記物。另外，在來自發(fā)生先兆子癇孕婦的早孕期妊娠的160個母體血清樣品中，證明母體血清中ADAM12濃度減少，并且ADAM12可以用作病理性妊娠的不良結(jié)果的標記物。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種對現(xiàn)有標記物試驗的改進，其表現(xiàn)出假陽性率降低或染色體疾病或不良妊娠結(jié)果的檢出率提高。
發(fā)明的詳細描述 細胞相互作用中的ADAM12 ADAM12是一種具有細胞黏附、金屬蛋白酶和信號傳導活性的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。在發(fā)育、再生和疾病期間的多個組織部分，ADAM12具有嚴格的時空表達模式。
在此，本發(fā)明人證明了，ADAM12與增加腫瘤細胞侵染行為的顯型有關(guān)并誘導其發(fā)生。
因此，使用乳癌小鼠模型，本發(fā)明人證明了，表達ADAM12的小鼠比不表達ADAM12的小鼠更快地出現(xiàn)腫瘤。ADAM12表達型腫瘤的腫瘤負荷大于非ADAM12表達型，并因此有更高的腫瘤細胞侵染侵染行為。
重要的是，本發(fā)明人證明了，在乳癌小鼠模型中，ADAM12誘導產(chǎn)生更具侵染性的成長模式。在下述例子中，在促進乳腺中ADAM12表達的MMTV啟動子(小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)長末端重復(LTR)啟動子/增強子)的作用下，產(chǎn)生了ADAM12轉(zhuǎn)基因小鼠。
通過使用腫瘤傾向的小鼠MMTV-PyMT與這些ADAM12小鼠進行交配，產(chǎn)生了一類新品種的小鼠MMTV-PyMT-ADAM12。將MMTV-PyMT小鼠胚胎中乳瘤的發(fā)展與MMTV-PyMT-ADAM12小鼠進行比較。
絕對和相對的腫瘤負荷被提高(分別為g腫瘤組織和g腫瘤組織/小鼠體重)，無腫瘤時間確定為腫瘤快能夠被觸診觀察到之前的時間。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與MMTV-PyMT小鼠胚胎相比，MMTV-PyMT-ADAM12小鼠明顯有更具侵染性的過程。
在分子水平上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，依據(jù)細胞類型，ADAM12降低細胞增殖和使細胞對細胞凋亡(非惡性細胞)敏感，但重要的是對于惡性腫瘤細胞則沒有。
因此，依據(jù)細胞環(huán)境和暴露的抗原決定簇，ADAM12似乎引導細胞表面細胞黏附受體功能的微妙平衡，這對于癌細胞的行為是十分重要的。
表達ADAM12的乳癌細胞對細胞凋亡有抗性，而被誘導表達ADAM12的非致癌的“正?！奔毎敲舾械?。
本發(fā)明人以前已經(jīng)表示，“正常”基質(zhì)細胞(3T3-L1)借助ADAM12的表達，與它們的對照細胞相比，對細胞凋亡更敏感(Kawaguchi等人2003)。
接著，他們測驗了這樣的“正?！奔毎蛺盒匀榘┘毎g的差異。令人驚訝的是，他們發(fā)現(xiàn)表達ADAM12的惡性MCF-7乳癌細胞對細胞凋亡有抗性。這暗示我們已知過表達ADAM12的腫瘤細胞優(yōu)于正常細胞，并且因此進一步表明ADAM12對于侵染性的顯型是有貢獻的。
產(chǎn)生表達ADAM12的MCF-7細胞 將缺少胞質(zhì)端的全長ADAM12(ADAM12-Δcyt)克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素應答質(zhì)粒(pRevTRE)的Xho I位點。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293-10A1細胞的包裝細胞系。在8μg/mL聚凝胺(polybrene)存在下，用消毒過濾的含有293-10A1包裝細胞系上清液的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導MCF-7細胞。在200μg/mL勻霉素的存在下選擇被轉(zhuǎn)導的細胞。所建立的細胞系被常規(guī)地保存在DMEM、10％FBS-tet、100μg/mLG418、100μg/mL勻霉素、100ng/mL強力霉素和青霉素/鏈霉素中。從生長培養(yǎng)基中去除強力霉素，誘導固定的被轉(zhuǎn)導的ADAM12-Δcyt的表達，并進而誘導ADAM12蛋白質(zhì)。
乳癌細胞對細胞凋亡敏感性的檢測 心肌細胞凋亡指數(shù)的測量結(jié)果為，結(jié)合使用5μM環(huán)己酰亞胺和100ng/mlTNFα處理48小時和UVC照射(60J/m2)24小時后，檢測在表達ADAM12-Δcyt的培養(yǎng)菌和對照MCF-7中的具有濃縮細胞核的Hoescht-轉(zhuǎn)染細胞的百分比。估計具有皺縮細胞核的細胞的百分比。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在此條件下少于5％的MCF-7細胞經(jīng)歷細胞凋亡，并且其不隨TNFα/UV處理而改變。
細胞功能異常 因此本發(fā)明人提出，ADAM12是一種用于細胞功能異常的全面標記物，因此一方面，本發(fā)明涉及用于篩查個體中細胞功能異常的方法，所述方法，其包括以下步驟 a)提供來自個體的身體樣品 b)確定所述樣品中ADAM12水平/數(shù)值，其為通過檢測 1)ADAM12多肽和/或 2)編碼ADAM12的多聚核苷酸，和/或 3)特定的ADAM12蛋白酶活性，優(yōu)選通過檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)及其衍生物，或其他適宜的ADAM12底物的剪切，包括它的脫落酶(sheddase)活性； c)將所述水平/數(shù)值與參照水平/預先確定的數(shù)值進行比較； d)鑒定是否該水平/數(shù)值與所述參照水平/預先確定的數(shù)值不同，并且 如果該水平與參照水平不同，則評估是否所述個體細胞具有提高的功能異常的風險。
本文中，術(shù)語“細胞功能異常”涉及在細胞水平上改變的細胞裂解、細胞存活、細胞粘著、細胞遷移、細胞骨架形成、細胞外基質(zhì)的組裝和細胞分化。這些改變是許多病理生理過程例如但不限于惡性、異常胚胎和胎盤發(fā)育、通常的生長障礙和器官對于傷害和壓力的特異反應。
這些病理生理過程由組織或組織液中的ADAM12水平反映出來，因此所述水平即為疾病的標記物。ADAM12是臨床前和臨床疾病的一種標記物。ADAM12水平反映疾病的存在和風險，預后，并有助于定義治療或預防。
本發(fā)明的一個實施方式中涉及，根據(jù)本申請的用于篩查個體中細胞功能異常的方法，其中所述參照水平是表示所述個體的正常生理狀況。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及，根據(jù)本申請的用于篩查個體中細胞功能異常的方法，其中所述參照水平值是表示所述個體的異常狀況。
如果ADAM12水平偏離-即低于或高于-臨床定義的臨界值臨界值，例如ADAM12濃度或特定ADAM12核酸的大量復制的數(shù)值，則它可以用作標記物。ADAM12水平還可以轉(zhuǎn)變?yōu)榭赡苄员嚷?，單獨或與其他標記物聯(lián)合使用來確定臨床狀況或疾病的有關(guān)參數(shù)，例如存活的可能性。
對于每個狀況都定義了臨床的臨界值和/或ADAM12水平的常態(tài)分布，并且它們可以是在健康個體或者臨床或生理上定義為良的人中獲得的數(shù)值的確定的百分點或數(shù)值的分布。在一些例子中，例如妊娠，孕齡特異性區(qū)間將必須用統(tǒng)計學方法來定義。
胚胎健康 本發(fā)明的另一個目的是，確定ADAM12濃度是否是一種有效的胚胎健康的指示劑，因為胚胎發(fā)育是哺乳動物最活躍的細胞生長階段之一。
本申請證明，在18例和226例早孕期唐氏綜合癥妊娠中ADAM12濃度降低，在89例中孕期樣品中ADAM12增加。
在10例有18三體癥胎兒的母體血清妊娠中，ADAM12濃度降低，使得ADAM12成為對于18三體癥的很有前景的標記物。如下述所示的例子，其在具有730例對照的143個病例中得到了證實。
該實施例還證明，ADAM12是早孕期和中孕期先兆子癇、特納氏綜合癥和非特納氏性染色體異常的標記物。另外，還證明通過在早孕期和中孕期聯(lián)合ADAM12和其他標記物，大大增加了這樣的標記物的識別能力。
因此，對于唐氏綜合癥和其他胚胎染色體疾病，ADAM12是一種很有前景的標記物。先兆子癇妊娠中的早孕期ADAM12母體血清的ADAM12濃度減少，使得ADAM12成為對于先兆子癇和胎盤疾病和不良妊娠結(jié)果的一種很有前景的標記物。
因此，一方面本發(fā)明涉及用于篩查胎兒異常的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供來自個體的身體樣品 b)確定所述樣品中ADAM12水平/數(shù)值，其通過檢測 1)ADAM12多肽和/或 2)編碼ADAM12的多聚核苷酸，和/或 3)特定的ADAM12蛋白酶活性，優(yōu)選通過檢測胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)及其衍生物，或其他適宜的ADAM12底物的剪切；。
c)將所述水平/數(shù)值與參照進行比較； d)鑒定是否該水平/數(shù)值與所述參照不同，并且 如果該水平與參照不同，則評估是否具有提高的所述胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果的風險。
本文中，術(shù)語“胎兒異常和不良妊娠結(jié)果”是指，胎兒染色體疾病-以染色體結(jié)構(gòu)異常的形式和它們的嵌合體(mosaec)畸形，單基因遺傳病或多基因遺傳病，偏離正常的發(fā)育，先天性疾病，胚胎疾病，胎盤的病理狀況，子宮內(nèi)生長遲緩，先兆子癇，HELPP綜合癥，癲癇，早產(chǎn)，胎兒心臟病，流產(chǎn)和胎兒死亡。
因此，本發(fā)明的另一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述胎兒異常選自21三體癥，18三體癥，13三體癥，先兆子癇，子宮內(nèi)生長遲緩，異位妊娠，開放性背柱裂，神經(jīng)管缺損，腹壁缺損，Edwards綜合癥，Pateaus綜合癥，特納氏綜合癥，非特納氏性染色體異常，X單染色體癥或Kleinefelter綜合癥，三倍體，嵌合體癥狀和開放性脊柱裂組成的組。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述胎兒異常是一種變異的生長狀態(tài)，其選自生長促進狀態(tài)和生長抑制狀態(tài)組成的組。這樣的胎兒異常能夠被證明為染色體疾病或病理性局部增殖狀態(tài)。
本發(fā)明的一個實施方式是ADAM12在確定婦女是否懷孕方面的用途。
本發(fā)明的一個實施方涉及，ADAM12作為心臟病，細胞肥大或血管生成的標記物。
本發(fā)明的一個實施方式涉及，ADAM12在對于肥厚型，擴張型，心律失常型右心室心肌病和限制型心肌病和左心室心肌肥大的分類，預后，鑒定和特征描述方面的用途。
本發(fā)明的一個實施方式是ADAM12作為心臟病的篩查標記物的用途。
在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中，胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果選自唐氏綜合癥(21三體癥)、18三體癥、13三體癥、三倍體、嵌合體、先兆子癇、特納氏綜合癥和非特納氏性染色體異常組成的組。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果是唐氏綜合癥。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果是特納氏綜合癥。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果是非特納氏性染色體異常(NTSCA)，即47XXY，47XXX，47XYY或三倍體。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果是先兆子癇。
在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果是18三體癥。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中，計算不依賴孕齡的(MOM)或ADAM12的值用以評估胎兒或胎盤疾病的風險。
在一個優(yōu)選的實施方式中，把發(fā)明涉及一種方法，其中，不依賴孕齡的ADAM12(MOM)與生物統(tǒng)計學，血清學或臨床信息相結(jié)合來獲得發(fā)生先兆子癇的風險。
另外，相同類型的方法過去常用于獲得其他上述不良妊娠結(jié)果的預后和診斷信息。
本文中，術(shù)語“個體”是指母體和未出生的子代。
本文中，術(shù)語“染色體疾病”是指任何常染色體或性染色體的三倍體、非整倍體或嵌合體等，即21三體癥、18三體癥、13三體癥、特納氏綜合癥等，和其他染色體結(jié)構(gòu)異常，例如易位和缺失。
本文中，術(shù)語“胎兒”是指從受精到孩子出生的任意型的胎兒，并因此包括指描述早期階段的胚胎和胎兒(或胎兒)的階段。
本文中，術(shù)語“個體”是指最大范圍的具有細胞功能異常風險的人，特別是指懷有胎兒的個體。雖然本實施方式描述母體樣品中ADAM12的測量，氮本發(fā)明能夠適用于直接對胎兒的測量，因此本發(fā)明的一個實施方式中涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中該個體是胎兒。
本文中，術(shù)語“病理”是指異常事物，如細胞功能異常，還有構(gòu)成疾病或成為特殊疾病特征的結(jié)構(gòu)和功能上偏離正常。
換言之，把發(fā)明也能夠描述成一種診斷哺乳動物胎兒的臨床狀況或診斷對于所述臨床狀況的易患素質(zhì)的方法，其包括以下步驟 a)提供來自所述胎兒母親的體液樣品；并且 b)測量所述體液樣品中的ADAM12水平；并且 c)診斷臨床狀況或診斷對于該臨床狀況的易患素質(zhì)，其中大于或小于預先確定的數(shù)值的ADAM12水平表示臨床狀況或?qū)τ谠撆R床狀況的易患素質(zhì)。
其中，該臨床狀況選自唐氏綜合癥、先兆子癇和急性冠脈綜合征，包括不穩(wěn)定型心絞痛，心肌梗死和任何所述的胎兒異常和/或不良妊娠結(jié)果所組成的組。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及，確定妊娠婦女懷有唐氏綜合癥胎兒的風險的篩查方法，其包括，在妊娠的早孕期和/或中孕期測量所述妊娠婦女母血ADAM12水平，在妊娠的早孕期，對(1)懷有唐氏綜合癥胎兒的妊娠婦女和(2)懷有正常胎兒的妊娠婦女的所述ADAM12水平和參照的ADAM12水平值進行比較，所述比較表示所述妊娠婦女懷有唐氏綜合癥胎兒的風險，其中高ADAM12水平表示懷有唐氏綜合癥胎兒的可能性更高。
樣品 本文中，術(shù)語“樣品”是指從被分析個體中收集的液體或固體樣品。優(yōu)選該樣品在分析時被液化。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，在測量ADAM12濃度之前，樣品的處理步驟的最小化是必須的。本文中，“處理步驟”是指，在液體樣品被用于分析，試劑盒或方法之前或之后，它的任何類型的預處理。預處理程序包括分離，過濾，稀釋，蒸餾，濃縮，雜質(zhì)化合物的滅活，離心，加熱，固化，添加試劑或化學處理。
根據(jù)本發(fā)明，被分析的樣品是從任意種類的哺乳動物，包括人類、寵物動物、觀賞動物、飼養(yǎng)動物中收集的。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，該樣品是得自例如體液的來源。
優(yōu)選，該來源選自乳汁、精液、血液、血清、血漿、唾液、尿液、汗液、眼部晶狀體液(ocular lens fluid)、腦脊液、腦脊髓液、腹水、粘液、滑液、腹膜液、陰道排出物、陰道分泌物、宮頸排出物、宮頸或陰道拭子材料或胸膜、羊膜液和其他分泌液，物質(zhì)和器官如腦、心臟和腸的組織切片所組成的組。
本發(fā)明的一個實施方式涉及，一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述身體樣品或生物樣品選擇血液、尿、胸膜液、口腔清洗物、陰道清洗物、宮頸清洗物、組織切片和卵泡液所組成的組。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及，一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述生物樣品選自血液、血漿和血清組成的組。
本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式涉及，一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述生物樣品是血清。
采用的樣品可以為了運輸和進一步分析而干燥。因此本發(fā)明的方法包括液體和干燥樣品兩者的分析。
本發(fā)明的一個實施方式中，母體血清樣品采自妊娠婦女。然后通過常規(guī)分析方法，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫學方法測量該母血ADAM12水平。
然后將母體血清的ADAM12水平與一組參照數(shù)據(jù)表見，來確定該病人懷有例如唐氏綜合癥胎兒的風險是否增高。
為了提高檢測效果，可以將孕齡和母血ADAM12水平與一組參照數(shù)據(jù)比較，來確定該病人懷有例如唐氏綜合癥胎兒的風險是否增高。
ADAM12水平的確定 樣品中一種已鑒定蛋白質(zhì)例如ADAM12的水平的確定，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢測分析來獲得，例如但不限于免疫學方法，基因表達分析和其他已知方法。
ADAM(去整合素和金屬蛋白酶)構(gòu)成一個具有蛋白水解和細胞黏附活性的糖蛋白家族。
人ADAM12以ADAM12-L(長)和ADAM12-S(短)兩種形式存在，后者是ADAM12的分泌型。ADAM12-S的C末端與ADAM12-L不同，它在此處不包括跨膜和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ADAM12-S與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)結(jié)合并具有抵抗胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3的蛋白水解活性，并且在更低程度上水解IGFBP-5。在體外，44-kDa IGFBP-3被ADAM12剪切產(chǎn)生幾個10到20kDa的片段，這并不依賴胰島素樣生長因子(IGF)I和II。IGF I和II是在幾乎全部胎兒和成年人組織中產(chǎn)生的胰島素原樣多肽。IGF I和II的缺乏引起小鼠胎兒的生長遲緩。IGFBPs剪切成與IGF親和力變低的更小的片段，這使得IGFBP對IGFs的促有絲剪切和DNA刺激作用的抑制作用消失。血漿中75％的IGF與IGFBP-3結(jié)合。
因此，本發(fā)明的一個實施方式涉及，確定樣品中的ADAM12水平，其中該ADAM12多肽能與ADAM12-L(長)和ADAM12-S(短)兩者結(jié)合。
借助本領(lǐng)域的普通技術(shù)可以進一步理解，ADAM12是至少33個基因的復雜家族的一員。此外，可以合成具有氨基酸序列的微小差別或其他微小差別的多種形式的ADAM12。進一步在例如唐氏綜合癥中，一個以上的ADAM12基因被表達，因而產(chǎn)生一種或多種獨特的變異體(以前所稱切口，斷裂，異常的形式)ADAM12。
根據(jù)本發(fā)明，這些變異體能夠通過常規(guī)的測量ADAM12的免疫學技術(shù)進行測量。提出的用于測量一個或多個與唐氏綜合癥有關(guān)的特定ADAM12變異體的分析法可能導致檢測效果的進一步增強。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及，以源自ADAM12表達的mRNA形式的，樣品中ADAM12多肽水平的確定，包括所有ADAM12的剪接變異體。
從6孕周至足月IGFBP-3的血清濃度顯著降低并且妊娠特異性蛋白剪切導致29至30，19和15kDa片段，這一發(fā)現(xiàn)與ADAM12-S將IGFBP-3剪切成為10-20kDa片段并因此可能是推測的妊娠血清中IGFBP-3蛋白酶之一的發(fā)現(xiàn)是一致的。
因為ADAM12是IGFBP-3蛋白酶并且IGFBP-3是血清中最豐富的IGFBP。所以IGFBP-3的蛋白水解將通過提高生物活性的IGF I和II的水平而刺激生長。而且，由于PAPP-A和ADAM12都是胎盤合成的IGFBP-5蛋白酶，因此作為胎兒異常的指示劑，ADAM12是用于研究的合理的備選品。
生物活性的胰島素樣生長因子(IGF)I和II對于胎兒生長是很重要的。其由胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)1至6調(diào)節(jié)。IGFBP-3的蛋白剪切發(fā)生在人妊娠血清的中；因此，在妊娠期間IGFBP-3血清水平顯著降低。ADAM12(去整合素和金屬蛋白酶)是IGFBP-3和IGFBP-5的蛋白酶并存在于人妊娠血清中。
另外，我們發(fā)現(xiàn)妊娠期間ADAM12濃度增加了60倍，這進一步解釋了IGFBP-3濃度的降低。
Irwin等人(2000)報道的結(jié)果中提供了另外的支持，其表示人胎盤滋養(yǎng)層分泌一種剪切IGFBP-3，在中性和堿性pH中有活性并對鄰二氮雜菲敏感的去整合素和金屬蛋白酶。因為胎盤中ADAM12的mRNA特別豐富并且具有相同的外觀特征，因此由滋養(yǎng)層分泌的蛋白酶可能是ADAM12。
Langford等人(1995)的發(fā)現(xiàn)表明，在具有子宮胎盤缺血的妊娠的晚孕期妊娠血清中IGFBP-3水平增高并且暗示IGFBP-5蛋白酶，PAPP-A作為子宮內(nèi)生長遲緩的預測物的作用，該發(fā)現(xiàn)使得ADAM12成為一個有趣的作為除DS外的不良妊娠結(jié)果的預測物的備選品。
因此，本發(fā)明的另一個實施方式涉及，樣品中ADAM12多肽水平的確定，其中所述水平是通過測量特異性ADAM12蛋白酶活性來計算的，優(yōu)選通過檢測IGFBP-3及其衍生物，或其他適宜的ADAM12底物的剪切。
胎盤亮氨酸氨肽酶(P-LAP)，一種與妊娠期間催產(chǎn)素降解有關(guān)的II型跨膜蛋白酶，通過蛋白剪切被轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿男问?。該研究的目的是確定P-LAP分泌酶行為的性質(zhì)。氧肟酸基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001和ONO-4817和TNFα蛋白酶抑制劑-2(TAPI-2)減少了P-LAP的釋放，而作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-1和TIMP-2對于中華地鼠卵巢(CHO)細胞穩(wěn)定過表達P-LAP中的P-LAP釋放沒有影響，因而暗示在P-LAP脫落中可能涉及ADAM(去整合素和金屬蛋白酶)的成員。此外，ADAM9和ADAM12的過表達增加了P-LAP-CHO轉(zhuǎn)染中的P-LAP釋放。人胎盤免疫組織化學分析證實了合體滋養(yǎng)層中ADAM12的強烈表達，而在整個胎盤中幾乎沒有檢測到ADAM9的表達。這些結(jié)果說明，ADAM長遠，至少包括ADAM12，牽涉到人胎盤中的P-LAP脫落。
因此，本發(fā)明的另一個實施方式涉及，樣品中ADAM12多肽水平的確定，其中所述水平是通過測量特異性ADAM12蛋白酶活性來計算的，優(yōu)選但不限于通過檢測人胎盤中的P-LAP脫落。
參照 為了確定細胞功能異常的臨床嚴重程度，用于評測被測ADAM12的可檢測信號的方法設(shè)計一種或多種參照方式。該參照也使得不直接或間接地與ADAM12濃度相關(guān)的分析和方法變化，試劑盒變化，處理變化和其他變化中的計算成為可能。
本發(fā)明中，術(shù)語“參照”是指與數(shù)量、質(zhì)量或類型有關(guān)的標準，與其相反的其他數(shù)值或特征可以與其比較，例如標準曲線。
參照數(shù)據(jù)反映懷有唐氏綜合癥胎兒(也指受影響的)的妊娠婦女的ADAM12母血水平和/或懷有正常胎兒的妊娠婦女的ADAM12母血水平(也指未受影響的)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的，用于篩查胎兒唐氏綜合癥的方法是通過比較進行判斷的過程。對于任何進行判斷的過程，都需要基于患有該疾病或有關(guān)癥狀的病人和/或沒有該疾病或有關(guān)癥狀的病人的參照數(shù)據(jù)。
本發(fā)明中該參照數(shù)據(jù)是，懷有唐氏綜合癥胎兒的妊娠婦女和懷有正常胎兒的妊娠婦女兩者中被測標記物，例如ADAM12的母血水平。通過收集大量樣品的的參照數(shù)值建立一組參照數(shù)據(jù)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，通過包括增加參照數(shù)值的數(shù)量可以改善該組參照數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的另一個實施方式中，該參照方式是內(nèi)參照方式和/或外參照方式。
本文中術(shù)語“內(nèi)參照方式”是指，不經(jīng)使用者為每種確定進行直接處理而是結(jié)合一種用于確定ADAM12濃度的方法，從而只有“最終結(jié)果”或“最終測量值”被提供的參照。術(shù)語“最終結(jié)果”或“最終測量值”是指考慮參照數(shù)值時提供給使用者的結(jié)果。
本發(fā)明的另一個實施方式中，內(nèi)參照方式連同用于ADAM12濃度確定的設(shè)備被提供。
本發(fā)明的另一個實施方式中，該裝置選自檢驗設(shè)備(assay)、棒(stick)、干燥棒(dry-stick)、電氣設(shè)備、電極，讀取器(分光光度讀取器，紅外讀取器，同位素讀取器和類似讀取器)、組織化學、和結(jié)合參照的類似手段所組成的組。
本文中術(shù)語“外參照方式”是指，使用者為了在得到“最終結(jié)果”或“最終測量值”之前確定ADAM12濃度而直接進行處理的參照。
本發(fā)明的另一個實施方式中，外參照方式選自表格，圖表和類似參照方式，使用者能夠?qū)⒈粶y信號與所選的參照方式進行比較。該外參照方式設(shè)計被使用的設(shè)備排除在外的用作ADAM12的標度，數(shù)值參照，信息物等的參照。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述參照水平/預先確定的數(shù)值表示所述個體的正常生理狀況。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述參照水平/預先確定的數(shù)值表示所述個體胎兒異常的狀況。
雖然任何已知的用于測量ADAM12母血水平的分析方法在本發(fā)明中都有效，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于ADAM12的分析方法必須與產(chǎn)生ADAM12參照數(shù)據(jù)所使用的方法相同。如果一種新的分析方法被用于ADAM12，則必須以該方法得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生一組新的參照數(shù)據(jù)。因此，用于分析血液的技術(shù)對于參照數(shù)據(jù)和被篩查的樣品應該是相同的。
風險評估 本發(fā)明已經(jīng)成功地開發(fā)了一種新的ELISA方法，用于測量整個胎盤的ADAM12。從早孕期至足月，母體血清中ADAM12濃度增加60倍，并且在有胎兒唐氏綜合癥的妊娠的早孕期顯著降低，，在有唐氏綜合癥妊娠的中孕期增加。表1表示ADAM12表現(xiàn)為一種有效的唐氏綜合癥母體血清標記物。其識別能力優(yōu)于其他任何已確定的早孕期標記物。同樣地，中孕期的識別能力優(yōu)于或接近于該孕齡期的熟知的標記物。
為了確定病人懷有例如唐氏綜合癥胎兒的風險是否增加，必須建立一臨界值。這一臨界值可以通過實驗室，醫(yī)師或以每個病人的一個個病例為基礎(chǔ)建立。
該臨界值可以基于多種標準，包括進行進一步侵入性診斷試驗的婦女的數(shù)量，對于全部進行進一步侵入性診斷試驗的婦女懷有唐氏綜合癥胎兒的平均風險，任何病人特異性風險高于一定風險水平，例如1∶400或1∶250(如篩查組織或個體婦女所定義的)的婦女都應該進行進一步的侵入性診斷試驗的決定或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準。
可以使用許多方法建立該極限水平，包括百分點，均值加減標準差，中值倍數(shù)，病人特異性風險或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。
本發(fā)明的另一個更多胎兒唐氏綜合癥病例被檢出的實施方式中，利用雙重或三重分析物檢驗，例如雙重或三重標記的時間分辨熒光免疫分析法，分析血清的ADAM12和βhCG和/或PAPP-A或其他用于胎兒疾病的早孕期風險評估的早孕期標記物，和AFP和/或hCG或游離雌三醇或其他中孕期用于中孕期風險評估的中孕期標記物。
雖然任何已知的用于測量這些分析物母血水平的分析方法在本發(fā)明中都有效，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于每個標記物的分析方法必須與產(chǎn)生特殊標記物參照數(shù)據(jù)所使用的方法相同。如果一種新的分析方法被用于特殊標記物，則必須以該方法得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生一組新的參照數(shù)據(jù)。
懷有唐氏綜合癥胎兒的病人特異性風險的計算優(yōu)選是，借助使用Bayes法則，病人先驗風險，和未患病和患病的妊娠的相對頻率，該相對頻率是通過將病人每種分析物(早孕期的ADAM12和βhCG和PAPP-A和其他標記物，以及中孕期的ADAM12、AFP、hCG、uE3和抑制素A和其他標記物)的定量水平和病人孕齡代入概率密度函數(shù)，該函數(shù)是使用多元判別分析或多維截斷正態(tài)(或其他)分布而建立的。
多元判別分析和其他風險評估的進行可以是，借助商業(yè)上可得到的統(tǒng)計學計算機軟件包統(tǒng)計分析系統(tǒng)(包括SAS研究所制造和出售的)，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他多元統(tǒng)計分析或其他統(tǒng)計軟件包或篩查軟件。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，母體血清樣品采自妊娠婦女。然后，ADAM12和其他標記物(下文稱為“標記物”)母體血清水平的測量，當標記物是血清學標記物時，利用本領(lǐng)域已知的常規(guī)免疫學方法進行，當標記物是生物統(tǒng)計學標記物，例如超聲測量法，即頸部半透明時，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他有關(guān)方法進行。
雖然任何已知的用于測量這些分析物母血水平的分析方法在本發(fā)明中都有效，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于每個標記物的分析方法必須與產(chǎn)生特殊標記物參照數(shù)據(jù)所使用的方法相同。如果一種新的分析方法被用于特殊標記物，則必須以該方法得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，產(chǎn)生一組新的參照數(shù)據(jù)。
為了風險評估或判別分析的目的，作出關(guān)于普通隨意選定種群中唐氏綜合癥的先驗概率的一個假定。通常，先驗概率為大約1∶800。為了多元判別分析和風險評估，作出關(guān)于何種風險臨界值水平構(gòu)成陽性試驗結(jié)果的判斷。例如，如果需要對具有例如1∶400或更高的懷有唐氏綜合癥胎兒的可能性的妊娠婦女進行進一步的侵入性診斷試驗，那么當判別分析顯示一個妊娠婦女具有例如1∶400或更高的懷有唐氏綜合癥胎兒的可能性時，則認為該妊娠婦女具有陽性試驗結(jié)果。如果表現(xiàn)陽性試驗結(jié)果，則該病人應該建議進一步的侵入性診斷試驗來證實唐氏綜合癥的存在。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在上述討論的實施方式中，改變陽性風險臨界值水平或使用可以適用于不同的種群亞組的不同先驗風險，能夠改變每個病人的判別分析的結(jié)果。
這里描述的穩(wěn)定性試驗證明，ADAM12具有對日常處理的高穩(wěn)定性，因此，本發(fā)明人斷定，ADAM12是在臨床應用上很有魅力的分析物。這里提供的數(shù)據(jù)表明，ADAM12一種用于產(chǎn)前篩查的具有潛在價值的標記物。
范圍 本發(fā)明人開發(fā)了一種用于血清中ADAM12量化的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)。檢驗范圍為42至667μg/l。重組ADAM12被用作校準的標準。同樣地，使用Perkin Elmer的自動時間分辨熒光免疫分析平臺，開發(fā)了具有78至1248μg/lADAM12分析范圍的自動時間分辨熒光免疫分析。
因此，本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的分析法，其中該檢測水平范圍為從20μg/1至2000μg/l，如20μg/l至1500μg/l，20μg/l至1000μg/l，20μg/l至800μg/l，20μg/l至600μg/l，20μg/l至400μg/l，20μg/l至200μg/l，50μg/l至2000μg/l，100μg/l至200μg/l，200μg/l至800μg/l，400μg/l至1000μg/l或100μg/l至1200μg/l。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該認識到的是，通過應用更靈敏的檢測分析方法，例如但不限于PCR或質(zhì)譜測定法，可以提高檢測水平。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ADAM12在血清中更穩(wěn)定。在一項研究中，血清濃度從例如8孕周的180μg/l增加到例如16孕周的670μg/l，但是從10-16孕周，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)高度變化但不降低的水平，其由三次多項式樣條函數(shù)描述。如實施例1所述，從18周該水平增加至足月的12000μg/l的中值。
在18例早孕期唐氏綜合癥妊娠中，ADAM12濃度降低，因此中值倍數(shù)值為0.14(0.01-0.76)。如實施例1所述，使用ADAM12和母親年齡作為篩查標記物，MonteCarlo評估發(fā)現(xiàn)，對于篩查陽性率3.2％和風險臨界值1∶400，胎兒唐氏綜合癥的檢出率為82％。
在226例早孕期唐氏綜合癥妊娠中-稍晚的孕齡檢查-中值倍數(shù)為0.79，但在10-12周明顯低于13-14周-表示ADAM12是特別優(yōu)良的早孕期標記物。如實施例5所述，在89例中孕期唐氏綜合癥胎兒妊娠母體血清樣品中，中值倍數(shù)為1.79，這表示ADAM12是特別優(yōu)良的中孕期標記物。
如實施例4所述，在160例從中孕期發(fā)生先兆子癇的婦女得到的早孕期血清樣品中-得自哥本哈根早孕期篩查研究，log MoM ADAM12均值顯著減少至-0.066(范圍-1.009-0.441)。如實施例13所述在67例先兆子癇中-得自英國Harold Wood醫(yī)院，MoM ADAM12同樣在早孕期顯著減少至0.90，在中孕期增加至1.14。
18三體癥妊娠的中值A(chǔ)DAM12 MoM，如實施例6所述的Danish研究中，在早孕期減少至0.29并減少至log MoM ADAM12均值-0.097，如實施例7所述，在中孕期增加至log MoM ADAM12均值0.312。
如實施例8所述，13三體癥妊娠的log MoM ADAM12均值在早孕期減少至-0.221，中孕期增加至0.170。
如實施例9所述，特納氏綜合癥的log MoM ADAM12均值在早孕期為-0.177，在中孕期為0.172。
如實施例10所述，非特納氏性染色體異常例如47XXX，47XXY和47XYY的log MoM ADAM12均值在早孕期減少至-0.238，在中孕期增加至0.212。
logMoM 如果ADAM12濃度沒有進行關(guān)于孕齡的標準化-即轉(zhuǎn)化成不依賴孕齡的值-例如通過母體血清中檢測到的ADAM12濃度除以獲得該樣品的特殊孕齡的中值得到的值(中值倍數(shù)，multiple of median-MoM)，那么ADAM12濃度值的個體間差異將降低標記物的識別能力。
在被檢查的狀況中，與對照妊娠相比，ADAM12的log MoM值在不同妊娠期間有特征性差異 在21三體癥中在5-10孕周ADAM12低。在11-12周與對照者相似，并從13-20周增加。
在18三體癥，13三體癥，45X0(特納氏綜合癥)，非特納氏性染色體異常和三倍體中，log MoM ADAM12水平在早孕期減少，在中孕期增加。
在先兆子癇中，log MoM ADAM12水平，與對照者相比，在早孕期降低，在中孕期增加。
方法 最簡單直接的方法是，免疫分析與分析檢驗相結(jié)合。通過任何本領(lǐng)域已知的免疫分析手段都可以檢測出與ADAM12結(jié)合的抗體。優(yōu)選，利用選自蛋白微陣列分析法、放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、熒光免疫分析法、免疫熒光統(tǒng)計分析法和免疫放射統(tǒng)計分析法組成的組的分析法，檢測抗體的結(jié)合。
更優(yōu)選，利用ELISA檢測抗體的結(jié)合。
酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA) ELISA依賴與RIA相似的原則，但其依賴于一種酶而非放射活性標簽。更具體的是，在適宜底物的存在下，與抗體結(jié)合的酶可以產(chǎn)生可檢測的信號。
在示例的ELISA中，對本發(fā)明有用的抗體被固定在所選擇的表面上，該表面表現(xiàn)蛋白親和力，如聚苯乙烯微孔板的一個孔。然后，將包含抗原例如臨床樣品的懷疑試驗組合物加入該孔。在結(jié)合和清洗來清除非特異性結(jié)合免疫復合物后，可以檢出該結(jié)合抗原。通常，可以通過加入其他結(jié)合了與可檢測標簽聯(lián)合的的抗原的抗體進行檢測，這種類型的ELISA是一種簡單的“夾心ELISA”。也可以通過加入結(jié)合了抗原的第二抗體后，加入對于第二抗體具有結(jié)合親和力的、與可檢測標簽聯(lián)合的第三抗體來檢測。
在另一個示例的ELISA中，包含抗原的懷疑樣品被固定在孔表面，然后與抗體結(jié)合。結(jié)合和適當?shù)那逑春螅瑱z測該結(jié)合免疫復合物。初始抗體與可檢測標簽聯(lián)合，則結(jié)合免疫復合物可以被直接檢測。再者，可以使用對于第一抗體具有結(jié)合親和力的、與可檢測標簽聯(lián)合的第二抗體，對該免疫復合物進行檢測。
競爭性ELISA也是可以的，其中試驗樣品競爭性地與已知數(shù)量的標記抗原或抗體相結(jié)合。在使用包被孔孵育之前或期間，通過將樣品與已知的標記品種混合，可以確定未知樣品中反應品種的數(shù)量。樣品中反應品種的存在使能夠與孔結(jié)合的標記品種的數(shù)量減少并因而減少了最終的信號。
關(guān)于使用方式，ELISA通常具有一定特點，例如包被，孵育或結(jié)合，清洗以除去非特異性結(jié)合品種，和檢測結(jié)合免疫復合物。這些將在下文中記述。
用抗原或抗體包被一張板時，一般是用抗原或抗體溶液孵余該板的孔，過夜或在特定的幾小時的時間內(nèi)。然后清洗該板的孔來去除沒有完全吸附的材料。然后用對于試驗抗血清為免疫原中性的非特異性蛋白“包被”孔剩余可利用的表面。這包括牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白和奶粉溶液。包被封閉固定化表面的非特異性吸附位點，并因此減少了抗血清在該表面上的非特異性結(jié)合引起的背景。
在ELISA中，與直接程序相比，使用第二或第三檢測手段可能是更經(jīng)濟的。因此，抗原或抗體與孔結(jié)合后，用非反應性材料包被來減少背景，并清洗以去除未結(jié)合的材料，固定化的表面與臨床或生物樣品接觸，在有效的條件下被檢測使免疫復合物(抗原/抗體)形成。然后，該免疫復合物的檢測需要一個標記的第二結(jié)合配體或抗體，或者與標記的第三抗體或第三結(jié)合配體結(jié)合的第二結(jié)合配體或抗體。
“在有效的條件下以使免疫復合物(抗原/抗體)形成”的意思是，該條件優(yōu)選包括用溶液例如BSA、牛微球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖鹽/吐溫(Tween)稀釋該抗原和抗體。加入的這些溶劑往往有助于非特異性背景的減少。
該適宜條件還意味著，在一定溫度下孵育一段充足的時間，使其有效結(jié)合。典型的孵育階段是從約1到約2到躍4小時，溫度優(yōu)選25到27℃，或者可以在約4℃過夜。
在ELISA中的全部孵育階段，清洗該被接觸的表面來清除未結(jié)合材料。清洗常包括用PBS/Tween或硼酸鹽緩沖溶液的清洗。在試驗樣品和初始結(jié)合材料之間的特異性免疫復合物的形成中，以及接下來的清洗中，可以確定甚至是微量的免疫復合物的出現(xiàn)。
為了提供一種檢測手段，第二或第三抗體將具有相關(guān)標簽使檢測能夠進行。優(yōu)選，其為對于用適宜的染色體遺傳底物孵育能產(chǎn)生顏色變化的酶。因此，例如，期待在有利于進一步的免疫復合物形成發(fā)展的條件下，例如在含有PBS的溶液如PBS-Tween中于室溫下孵育2小時，用尿素酶、葡萄糖氧化酶、堿式磷酸酯酶或過氧化氫酶聯(lián)的抗體接觸和孵育第一或第二免疫復合物。
用標記的抗體孵育，并隨后清洗以去除未結(jié)合材料后，標簽的數(shù)量被量化，例如，過氧化酶作為酶變遷時，通過用染色體遺傳性底物如尿素和溴甲酚紅紫或2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和過氧化氫孵育。
然后通過測量產(chǎn)生顏色的程度，例如使用可見光分光光度計，進行量化。
或者，該標簽可以是化學發(fā)光體?；蛘咴摌撕炇强梢允褂脮r間分辨熒光免疫分析法檢測的。
蛋白微陣列分析 本發(fā)明的另一個實施方式涉及，使用蛋白微陣列檢測被檢測樣品中存在的至少一種形式的ADAM12的數(shù)量。使用抗體及其片段進行至少一種形式的ADAM12的捕獲，其中，該檢測是使用質(zhì)譜儀，例如MALDI-TOF光譜儀進行的。此外，至少一種ADAM12在表面的結(jié)合可以被用來滿足機理，并且可以使用質(zhì)譜儀(例如SELDI-TOF光譜儀)進行檢測。
試劑盒 當測量樣品中ADAM12濃度時，無論是否需要快速鑒定，都提供了包括必要設(shè)備的試劑盒。
本文中，術(shù)語“試劑盒”是指一組用于特殊目的的設(shè)備，例如該試劑盒的目的是確定樣品中ADAM12濃度。該組設(shè)備，典型地，包括獲得被測樣品的設(shè)備，儲存或支持所獲得的樣品的設(shè)備，提供對于樣品中存在的ADAM12數(shù)量的可檢測信號的設(shè)備和評測被測ADAM12的可檢測信號的設(shè)備，而且可以加入其他設(shè)備。
本發(fā)明的一個實施方式中，該試劑盒包括選自獲得被測樣品的設(shè)備，儲存或支持所獲得的樣品的設(shè)備，提供對于樣品中存在的ADAM12數(shù)量和/或濃度的可檢測信號的設(shè)備和評測被測ADAM12的可檢測信號的設(shè)備所組成組中的至少一種，如所述設(shè)備中的兩種，例如三種和例如四種。
當使用該試劑盒時，獲得被測樣品的設(shè)備包括，例如獲得血樣的注射器或者獲得組織樣品的注射器或解剖刀或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他常規(guī)設(shè)備。接著，將該樣品轉(zhuǎn)移至儲存或支持所獲得的樣品的設(shè)備，并使用提供對于樣品中存在的ADAM12數(shù)量的可檢測信號的設(shè)備進行分析。對獲得的信號進行分析和評價以確定細胞生長紊亂的臨床嚴重程度，從而為疾病提供預后或診斷和/或提供該紊亂引起的并發(fā)癥的最佳預防和/或治療方法。
提供對于樣品中存在的ADAM12數(shù)量的可檢測信號的設(shè)備選自檢驗設(shè)備(assay)、棒(stick)、干燥棒(dry-stick)、電氣設(shè)備、電極，讀取器(分光光度讀取器，紅外讀取器，同位素讀取器和類似讀取器)、組織化學、和結(jié)合參照的類似手段所組成的組。
其他提供對于樣品中存在的ADAM12數(shù)量的可檢測信號的設(shè)備可以是與所述樣品中ADAM12的mRNA水平有關(guān)的，例如但不限于實時PCR。
自動分析 為了減少分析的變化和人為的處理和記錄的錯誤，使用本發(fā)明作為半自動或全自動分析系統(tǒng)的一部分是有利的，優(yōu)選其中臨床數(shù)據(jù)和分析結(jié)果及風險計算的處理和分析結(jié)果及風險評估的質(zhì)量控制是在整體半自動系統(tǒng)中完成的，例如具有相同制造商的軟件生命周期的自動時間分辨熒光免疫分析和自動時間分辨熒光免疫分析平臺的聯(lián)合。我們已經(jīng)表示，ADAM12分析對自動時間分辨熒光免疫分析平臺發(fā)揮作用。本發(fā)明還包括內(nèi)爆干燥試劑或干燥的被包被板的分析系統(tǒng)。進一步，血液或組織成分被存放在濾紙上，并在ADAM12量化前被萃取。
多元分析平臺，例如Luminex技術(shù)也是用于測量ADAM12值的本發(fā)明的一部分。
篩查定時 如本文所述，與以前的基于母體血清標記物的篩查方法相比，本發(fā)明的方法提供了更高的識別能力，更低的價格，更少的入侵和更多的用于胎兒非整倍體的產(chǎn)前篩查的地理上可接受的設(shè)備。
進一步，本發(fā)明的一個重要的實施方式是，本發(fā)明的母體篩查方法由于母體血清篩查方法被大量使用，因此不僅能夠在中孕期使用，也可以在早孕期使用。
如本文所述，由于確定胎兒非整倍體診斷中的耽誤導致更多的創(chuàng)傷性流產(chǎn)程序是必要的，因此中孕期試驗是不利的。而且，孕婦及其家人對于健康孩子的情感和期望在妊娠期間不斷增長，使得妊娠晚期的流產(chǎn)決定更加困難。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中ADAM12被評定為早孕期標記物。
本發(fā)明的一個實施方式涉及一種依據(jù)本發(fā)明的方法，其中ADAM12被評定為中孕期標記物。
早孕期和中孕期使用ADAM12作為標記物，提高了這些試驗的效果并會導致更精確的風險妊娠的定義，其應該給出對診斷胎兒疾病的侵入性調(diào)查(即伴隨染色體分型的羊水診斷或絨膜絨毛取樣)。在早孕期和中孕期都使用ADAM12可以減少個體婦女參加由于篩查中的假陽性結(jié)果而失去胎兒的篩查計劃中的風險。在早孕期的11孕周之前，ADAM12單獨或與其他標記物聯(lián)合使用可以將早孕期篩查的效果提高到與目前被認為是最有效的“集成掃描”相似的程度。但是，集成掃描的缺點是，風險在中孕期報告給孕婦。由于從醫(yī)學和心理上遲到的風險報告都是更不令人期待的，因此這是很不幸的。
由于ADAM12在21三體癥中的識別能力優(yōu)良-即MoM ADAM12在11孕周前減少或12孕周后增加-因此該標記物對于“有效期”外從10(11)-11(12)周的21三體癥篩查是有效的。這與具有在妊娠的其他時期的“無效期”的標記物如PAPP-A，hCG和SP1等是類似的。由于僅證明了ADAM12對于21三體癥的無效期，因而當篩查其他胎兒或母體病癥時，該用途是不必推薦的。
因此，本發(fā)明的一個實施方式涉及一種方法，其中該樣品在孕齡11周前或孕齡12周后獲得。
與其他已知標記物的聯(lián)合 在一個優(yōu)選實施方式中，對母體血清或血漿中與一種以上的下述標記物聯(lián)合的ADAM12和生物統(tǒng)計學標記物的測量，可以通過已知試驗減少假陽性的數(shù)量并提高識別能力 甲胎蛋白(AFP) 游離雌三醇(UE3) 人絨毛膜促性腺激素(hCG) 人絨毛膜促性腺激素游離α亞單位(游離α-hCG) 人絨毛膜促性腺激素游離β亞單位(游離β-hCG) β核hCG 過糖基化hCG(ITG) 胎盤生長激素(PGH) 抑制素，優(yōu)選二聚抑制素-A(抑制素A) 妊娠相關(guān)的血漿蛋白-A(PAPP-A) PAPP-A與proMBP復合體(主要基礎(chǔ)蛋白的前體形式) ProMBP ProMBP與血管緊張素和/或補充因子的復合體和剪切產(chǎn)物 Schwangerschaftsprotein 1(SP1) 癌抗原125(CA125) 前列腺特異性抗原(PSA) 白細胞酶 胚胎DNA 胚胎RNA 胚胎細胞 干細胞 雌二醇 超聲標記物 頸部半透明 腿骨長度 缺少鼻骨 腸腔高回聲 心臟中的強回聲點 脈絡(luò)膜囊腫(Choroids plexus cysts) 腎盂積水 胎兒畸形 類固醇 肽類 趨化因子 白介素(例如IL-6，IL-4，IL-1) 腫瘤壞死因子 轉(zhuǎn)化生長因子α和β 急性期反應物 C反應蛋白 纖連蛋白 母體或胚胎的單核苷酸多態(tài)性，例如TNFβ和甘露聚糖結(jié)合凝集素啟動子區(qū)的多態(tài)性 補充成分 HLA-G HLA分子 因比在一個實施例中，本發(fā)明涉及此處所述的方法，其中ADAM12水平與選自上述定義的組的至少一種標記物的數(shù)值相結(jié)合。
ADAM12抗體 還可以被普遍理解的是，在ADAM12特異性抗體的產(chǎn)生中，一些抗體是對蛋白質(zhì)特異性的，一些抗體是對與抗原位點有關(guān)的碳水化合物特異性的。在整個本發(fā)明的描述中提到的ADAM12水平的測量包括，使用對于蛋白質(zhì)或與抗原位點或ADAM12上的其他位點有關(guān)的碳水化合物特異性的抗體。
我們已經(jīng)高效地利用ELISA分析技術(shù)測量ADAM12，來區(qū)別21三體癥患病和未患病的妊娠。使用ADAM12和母親年齡作為風險標記物檢測21三體癥的效果已經(jīng)被評估為，3％的假陽性率的80％。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的是，使用抗體測量特異性分析物可能導致一定程度的與不同或相似底物的交叉反應。因此，患病和未患病病例間的區(qū)別可能由于異常形式的ADAM12的存在而受到影響，這是因為異常形式的ADAM12與所用抗體發(fā)生一定程度的交叉反應而被檢出。一種異常形式的ADAM12可能被指定為一種新的生物化學底物。
21三體癥患病的病例也可以通過異常形式的ADAM12進行特征化，在這些病例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠開發(fā)出這些異常形式的特異性抗體，可能導致這些癥候的檢測效果的進一步加強。
或者，唐氏綜合癥患病的病例也可以通過斷裂形式的ADAM12(或片段)進行特征化，其包括組成ADAM12的氨基酸的不完整的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，如果分析中使用的抗原決定基存在于ADAM12片段中，則用來測量ADAM12的分析法也會檢測ADAM12片段。
本發(fā)明不限于上述實施方式，而是包括全部可能的實施方式和下述實施例中公開的標記物的聯(lián)合。
這里描述的涉及本發(fā)明的方法和/或分析法的全部特征，也可以適用于涉及試劑盒和反之亦然的實施方式，因此在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種在本發(fā)明的分析法中使用的試劑盒。
顯然，本發(fā)明的一個方面的優(yōu)選特征和特性也適用于本發(fā)明的其他方面。
因此本申請中引用的全部專利和非專利參照全部編入。
整個說明書中，詞語“包括”或其變體“包括”或“包括”是指，含有一種規(guī)定的成分、整體或步驟，或者成分、整體或步驟的組，但不排除其他成分、整體或步驟，或成分、整體或步驟的組。
以下，將以非限定性的圖和實施例的方式對本發(fā)明進行說明。



圖1表示確定最適包被抗體的試驗。使用單克隆抗體(Mab)8F8和6E6，以及多克隆家兔抗體(rb)122和134包被ELISA盤。所用的生物素化抗體為6E6(黑色柱)或8F8(白色柱)。
圖2表示冷凍-解凍。反復冷凍和解凍后的血清樣品的分析結(jié)果。
圖3表示ADAM12的標準曲線。使用6E6包被和8F8作為檢測的生物素化抗體，490-620nm的吸收度標準曲線。
圖4表示血清中ADAM12的穩(wěn)定性。靜脈穿刺和離心后，不同儲存溫度下ADAM12對時間的穩(wěn)定性。
圖5表示早孕期log10ADAM12對天數(shù)的分散圖。黑三角是唐氏綜合癥的值。
圖6表示MMTV-PyMT和MMTV-PyMT-ADAM12-S轉(zhuǎn)基因小鼠中明顯腫瘤的出現(xiàn)。每個轉(zhuǎn)基因品系中乳腺腫瘤最明顯的年齡。也表示每個品系(n)被分析動物的數(shù)量。
圖7表示MMTV-PyMT和MMTV-PyMT-ADAM12-Δcyt轉(zhuǎn)基因小鼠中明顯腫瘤的出現(xiàn)。每個轉(zhuǎn)基因品系中乳腺腫瘤最明顯的年齡。也表示每個品系(n)被分析動物的數(shù)量。
圖8表示絕對腫瘤質(zhì)量(g)。與母代的MMTV-PyMT相比，MMTV-PyMT-ADAM12-Δcyt轉(zhuǎn)基因小鼠具有顯著更多的侵染性；p＝0.015。
圖9表示相對腫瘤負荷(g腫瘤組織/小鼠重量)。與母代的MMTV-PyMT相比，MMTV-PyMT-ADAM12-Δcyt轉(zhuǎn)基因小鼠具有顯著更多的侵染性；p＝0.087。
圖10表示絕對腫瘤質(zhì)量(g)。與母代的MMTV-PyMT相比，MMTV-PyMT-ADAM12-S轉(zhuǎn)基因小鼠具有顯著更多的侵染性；p＝0.012。
圖11表示相對腫瘤負荷(g腫瘤組織/小鼠重量)。與母代的MMTV-PyMT相比，MMTV-PyMT-ADAM12-S轉(zhuǎn)基因小鼠具有顯著更多的侵染性；p＝0.014。
圖12表示MoMADAM12對MoMPAPP-A的圖。
圖13表示C.log MoM PAPP-A對log MoM ADAM12的分散圖。實心三角表示唐氏綜合癥的值。
圖14表示log MoMADAM12對log β-hCG的分散圖。
圖15表示早孕期篩查標記物ADAM12、母親年齡、β-hCG、PAPP-A和頸部半透明(NT)的聯(lián)合的ROC-曲線分析。
圖16表示中孕期ADAM12。ADAM12濃度對孕齡的圖。實心三角表示唐氏綜合癥的值。
圖17表示對照妊娠中ADAM12的中值和三次多項式樣條函數(shù)。
圖18表示作為孕齡函數(shù)的DS妊娠的ADAM12 MoM分布。
圖19表示無重量修正的早孕期T21的log DAM12和log游離βMoMs間的相關(guān)性。
圖20表示無重量修正的早孕期對照組的log DAM12和log游離βMoMs間的相關(guān)性。
圖21表示無重量修正的早孕期T21的log DAM12和log PAPP-A MoM間的相關(guān)性。
圖22表示無重量修正的早孕期對照組的log DAM12和log PAPP-A MoM間的相關(guān)性。
圖23表示早孕期T21的log DAM12和ΔNT間的相關(guān)性。
圖24表示早孕期對照組的log DAM12和ΔNT間的相關(guān)性。
圖25表示無重量修正的中孕期T21的log DAM12和log AFP MoMs間的相關(guān)性。
圖26表示無重量修正的中孕期對照組的log DAM12和log AFP MoMs間的相關(guān)性。
圖27表示無重量修正的中孕期T21的log DAM12和log fBhcG MoMs間的相關(guān)性。
圖28表示無重量修正的中孕期對照組的log DAM12和log fBhcG MoMs間的相關(guān)性。
圖29表示 A.早孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.早孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值的盒須圖。
圖30表示18三體癥妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖31表示 A.中孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.中孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的盒須圖。
圖32表示中孕期18三體癥妊娠log MoM ADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖33表示 A.早孕期13三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.早孕期13三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的盒須圖。
圖34表示早孕期13三體癥妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖35表示 A.中孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.中孕期18三體癥妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的盒須圖。
圖36表示中孕期13三體癥妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖37表示 A.早孕期45X0妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.早孕期45X0妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的盒須圖。
圖38表示早孕期45X0妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖39表示 A.中孕期45X0妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.中孕期145X0妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的盒須圖。
圖40表示中孕期45X0妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖41表示log MoMADAM12值分布狀態(tài)如下所示 A.早孕期NTSCA妊娠log MoMADAM12值分布狀態(tài)的圖形描述。
B.A中描述的數(shù)據(jù)的盒須圖。
圖42表示早孕期NTSCA妊娠log MoMADAM12值的常態(tài)概率圖。
圖43表示 A.中孕期NTSCA妊娠log MoMADAM12值的分布狀態(tài)。
B.A中描述的中孕期NTSCA妊娠log MoMADAM12數(shù)據(jù)分布狀態(tài)的盒須圖。
圖44表示中孕期NTSCA妊娠log MoMADAM12數(shù)據(jù)的常態(tài)概率圖。
實施例 實施例1 在早孕期，作為唐氏綜合癥的早孕期母體血清標記物的ADAM12 ADAM12的ELISA的開發(fā)和對于丹麥病人的臨床評估。
材料和方法 血清樣品 正常樣品。在丹麥，奧爾胡斯，skejby大學醫(yī)院，作為日常DS產(chǎn)前篩查計劃的組成部分，從早孕期妊娠婦女(n＝154)獲得血清樣品。該計劃專門針對8到13孕周的婦女，并包括超聲檢查。
通過國家血清研究所(Statens Serum Institute)的其他日常嚴重畸形和DS產(chǎn)前篩查計劃獲得中孕期血清樣品(n＝91)。該篩查計劃限于14到20孕周的婦女。全部早孕期和中孕期的樣品都被放在干燥容器中，并保持冷藏(4℃)，直至經(jīng)正常郵寄的郵資。
從參加哥本哈根，Hvidovre大學醫(yī)院的一項ADAM12試驗性研究的婦女中獲得臨產(chǎn)樣品(n＝10)。這些婦女為38到40孕周，并且在取樣前全部為正常妊娠而沒有產(chǎn)科并發(fā)癥。在國家血清研究所，一個外表健康的28孕周的受試者為儲藏溫度和血液容器的對照捐獻了血液。臨產(chǎn)樣品和用于儲藏溫度和血液容器的對照的樣品被離心并保存在-20℃，直到研究和/或分析的時間。
DS樣品。早孕期DS樣品(n＝18)為，由作為該篩查計劃即早孕期的結(jié)果的Skejby篩查計劃的樣品(n＝3)，和在中孕期期間(n＝10)或出生時(n＝5)診斷的國家血清研究所正在進行的質(zhì)量控制計劃的樣品(n＝15)組成。
中孕期血清DS樣品(n＝12)全部來自國家血清研究所正在進行的質(zhì)量控制計劃，并由中孕期(n＝8)或出生時(n＝4)診斷的樣品組成。
全部DS診斷都是通過染色體分型建立的。孕齡通過最后一次月經(jīng)的日期確定，在大多數(shù)病例中，其被超聲檢查證實。
倫理 全部樣品或者是為奧爾胡斯或哥本哈根郡科學倫理委員會支持的項目而收集，或者是作為國家血清研究所正在進行的質(zhì)量控制計劃的組成部分而得到的。
反應物 用于標準化的重組ADAM12-S是通過用編碼人ADAM12-S的全長cDNA(GenBank AF023477)轉(zhuǎn)染人293-EBNA而獲得的，并如Loechel等人(2000)所述，使用陽離子交換和刀豆球蛋白A親和層析進行純化。使用BCA分析確定蛋白質(zhì)的濃度(Price，Rockford IL)。
抗體 本研究中，幾種抗重組ADAM12的前述抗體被檢測鼠IgG單克隆抗體8F8，6E6和6C10；和多克隆抗體rb122和rb134(Gilpin等人，1998，Iba等人，1999，Kawaguchi等人，2002，Kronqvist等人，2002)。以試驗性研究為基礎(chǔ)，比較全部抗體在ELISA中的效果，6E6和8F8分別用于包被和檢測步驟。
生物素化 為了產(chǎn)生生物素化的抗體，使用NApTM5柱(Amersham Biosciences，Sweden)，將8F8 IgG轉(zhuǎn)染入由0.10.1M NaHCO3(pH 8.2)(Merck，Darmstadt，Germany)組成的標記緩沖液中。使用標記緩沖液作為參照，從280nm的吸收度計算該濃度。向該抗體中加入溶于2.5ml二甲基甲酰胺(LabScan，Valby-Denmark)的100mg生物素(Sigma1759)的混合液(10μl per mg)。在室溫下攪拌2小時后，通過使用PD-10柱的凝膠過濾，純化生物素化的抗體(Amersham Biosciences，Sweden)。從280nm的吸收度計算生物素化的單克隆抗體的濃度。
標準品和對照品 從0.15M磷酸鹽緩沖液(PBS)中的1％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma A4503)和0.05％(v/v)Tween 20(Merck)組成的稀釋緩沖液中被稀釋的中孕期混合血清制備對照品。本發(fā)明人校準了抵抗重組ADAM12的晚孕期混合血清，并利用該混合血清制作里用于確定ADAM12濃度的標準曲線。通過在稀釋緩沖液中稀釋該血清來制備范圍從42至667μg/l的標準品。
全部標準品，對照品和樣品的分析均為雙份進行。
ELISA的程序，優(yōu)化和測試 在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，用0.41μg/孔的單克隆抗體6E6覆蓋微孔板(Nunc-ImmunoTM板，MaxiSorpTM表面，Nalge Nunc Intemational-Denmark)。4℃過夜孵育后將板清洗兩次。全部清洗步驟是使用由有0.05％(v/v)Tween 20(Merck822184)的0.1MPBS組成的清洗緩沖液進行的。向板上加入由清洗緩沖液中的1％(v/v)BSA(SigmaA4503)組成的緩沖液，來阻止非特異性結(jié)合。室溫下將該板在封閉緩沖液中孵育30分鐘，然后清洗3次。加入封閉緩沖液中稀釋的標準品，對照品和樣品(100μl/孔)，在室溫下孵育2小時，然后清洗4次。加入生物素化單克隆抗體8F8(0.5μg/ml)并將該板在室溫下孵育1小時，然后清洗4次。加入過氧化物酶聯(lián)鏈霉抗生物素(蛋白)，在室溫下孵育1小時，然后清洗3次。通過加入100μl/孔由鄰苯二胺(OPD)片(Kem-En-Tec，Copenhagen，Denmark)和溶于檸檬酸緩沖液(pH5.0)中的過氧化氫組成的溶液，獲得一種顏色反應，并在室溫下孵育30分鐘。加入150μl(10％v/v)硫酸來停止該顏色反應，并通過光譜(490-620nm)(Victor，PLS-Wallac，Turku，F(xiàn)inland)測量該顏色反應的強度。為了評估分析內(nèi)和分析間的可變性，本發(fā)明人在同一操作中對相同樣品進行了6次分析，并連續(xù)6天重復相同操作。
ADAM12的穩(wěn)定性 為了研究ADAM12的穩(wěn)定性，本發(fā)明人進行了反復的冷凍-解凍試驗。該研究是使用晚孕期混合血清進行的，并對各等量進行兩次分析。重組ADAM12儲存于-20℃。
本發(fā)明人還研究了血清中ADAM12的溫度穩(wěn)定性。樣品采自國家血清研究所的一個外表健康的受試者晚孕期靜脈穿刺。離心后立即分離血清15份室溫保存，10份4℃，10份37℃保存。全部樣品在同一操作中分析。
為了確定所使用的血液容器的類型，本發(fā)明人分析了來自包含在EDTA，檸檬酸鹽，肝素和干燥血液容器的血清/血漿。全部樣品得自靜脈穿刺并在相同條件下處理。
臨床評估 唐氏綜合癥為了研究作為DS篩查標記物的ADAM12濃度值，本發(fā)明人將證實有DS妊娠的ADAM12值和相同孕齡的非DS妊娠的母體血清ADAM12濃度值進行了比較。由于只有3個早孕期DS樣品是新近的并是與對照品一同采集的，而15個病例在-20℃存放了近7年，因此本發(fā)明人分別檢查了MoM值。
PAPP-A和β人絨毛膜促性腺激素(βhCG)對ADAM12 為了建立早孕期血清樣品中的ADAM12，PAPP-A和βhCG之間的關(guān)系，本發(fā)明人使用了來自Skejby篩查計劃的154個未患病的和3個DS樣品，為此以前作為常規(guī)早孕期篩查計劃的一部分進行了PAPP-A和βhCG分析。另外，本發(fā)明人使用了15個來自國家血清樣究所的DS樣品，進行了相同的βhCG和PAPP-A分析。
整個妊娠的ADAM12為了評估整個妊娠的血清中ADAM12水平變化，本發(fā)明人使用了154個早孕期血清樣品，91個中孕期血清樣品和10個臨產(chǎn)血清樣品，即全部未患病血清樣品。
統(tǒng)計學 通過關(guān)于孕齡(天數(shù))的log10 ADAM12濃度的線性衰減，建立血清ADAM12濃度中值。通過最后一次月經(jīng)的日期確定孕齡，其在大多數(shù)病例中被超聲檢查(CRLorBPD)證實。所有濃度都被轉(zhuǎn)換成未患病的妊娠婦女的中值倍數(shù)。使用正態(tài)圖可知與正態(tài)分布的相容性。使用Pearson相關(guān)系數(shù)得到相關(guān)性。通過發(fā)表的Monte Carlo模擬方法(Larsen等人，1998)制造的接受者操作特征曲線(ROC)分析，對ADAM12單獨或與其他標記物聯(lián)合的篩查效率進行評估。使用妊娠婦女的標準化年齡分布(Van derVeen等人，1997)。給出了出生DS孩子的預先的、年齡相關(guān)的風險取自Cuckle等人(1987)。標記物PAPP-A，βhCG和頸部半透明(NT)的分布參數(shù)取自已公布的后設(shè)分析(meta-analysis)(Cuckle & Van Lith 1999)。
結(jié)果 ADAM12 ELISA和穩(wěn)定性 圖1A表示單克隆抗體6E6 and 8F8的包被導致最大吸收。當8F8用作包被抗體時，背景水平高，因此本發(fā)明人在使用6E6作為被吸附在聚苯乙烯孔上的捕捉抗體，8F8作為生物素化的檢測器抗體。ADAM12 ELISA分析范圍為42-667μg/l(圖1B)。變化的分析內(nèi)和分析間的系數(shù)分別是5％和13％。重組ADAM12標準品和妊娠血清的稀釋曲線為線性并平行。
儲存于-20℃的重組ADAM12在大約4個月后開始降解。-20℃儲存6個月后沒能檢測到血清中ADAM12的降解。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ADAM12在經(jīng)歷至少8個冷凍和解凍的循環(huán)中是穩(wěn)定的(圖1C)。室溫下42小時血清樣品是穩(wěn)定的，儲存在4℃，則延長到4天(圖1D)。存放于不同血液容器中的血漿樣品的分析表示，血漿中被置于EDTA容器容器中的ADAM12幾乎不能被檢測到。關(guān)于可檢測的血清ADAM12水平，肝素和檸檬酸容器與干燥容器是等效的。
妊娠中的ADAM12 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，整個妊娠中，血清ADAM12增加近60倍。8孕周的中值是180μg/l，而正常妊娠的臨產(chǎn)中值是12,000μg/l。154例早孕期血清樣品顯示，隨孕齡的顯著增加。由于早孕期隨孕齡的增長率在10周后降低，但本發(fā)明人完成了2個log線性衰減一個是小于等于70天孕齡的樣品，另一個是大于70天孕齡。Log線性衰減導致中值為8周180μg/l，9周262μg/l，10周383μg/l和11周450μg/l(圖2)。這里沒有對從10-14周的孕齡期限詳細描述，并且下面提及的結(jié)果表示，實際上，ADAM12從11到15周減少，然后增加至臨產(chǎn)的高濃度。中孕期血清樣品(n＝91)分析和線性衰減表示，中值14周592μg/l，15周630μg/l，16周670μg/l和17周712的更低的增長率。其余為正常分布。臨產(chǎn)血清(n＝10)分析顯示中值12,000μg/l。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了，早孕期log MoMADAM12與log MoMPAPP-A之間(r＝0.25，p＜0.01)和log MoMADAM 12與log MoMβhCG之間(r＝0.16，p＜0.05)的顯著的相關(guān)性，但log MoMADAM12與母體年齡(r＝0.05，p＞0.05)或頸部半透明(p＞0.05)之間沒有相關(guān)性。早孕期log MoMADAM12濃度分布均值log MoM為0.00且標準差為0.28，與高斯分布是一致的。
唐氏綜合癥妊娠的ADAM12 來自證實有DS妊娠的早孕期血清樣品(n＝18)的分析顯示ADAM12濃度降低，即在0和246μg/l之間(圖2)。MoM值為0.14(0.01-0.76)。早孕期樣品的儲備補充物的平均MoM為0.17，來自早孕期篩查計劃的樣品的平均MoM為0.29。相應的PAPP-AMoM值為0.36(0.02-1.04)。在患病的妊娠(n＝18)中，log MoMADAM12均值-1.28，標準差0.78，顯著低于(p＜0.001)正常妊娠。
圖1說明了，在生產(chǎn)DS孩子的風險臨界值1∶200和1∶400時，與其他早孕期篩查標記物聯(lián)用的ADAM12估測的高篩查結(jié)果。
表1在臨界值水平1∶200和1∶400時的不同篩查標記物的篩查結(jié)果 實施例2 腫瘤小鼠 材料和方法 為了產(chǎn)生乳腺特異性ADAM12的轉(zhuǎn)基因表達，我們使用了MMTV-Sv40-Bssk載體(小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)長末端重復啟動子/增強子(LTR)的被修飾的版本。全長ADAM12-S cDNA，和缺少胞質(zhì)端的全長ADAM12(ADAM12-Δcyt)的被剪切的版本分別被克隆入MMTV-Sv40-Bssk載體。使用PvuI and SpeI限制性內(nèi)切酶切除無載體的MMTVADAM 2-S和MMTVADAM12Δ-cyt片段。這些片段用于，按照標準程序(Hogan B，Beddington R，Costantini F and Lacy EManipulating the MouseEmbryoA Laboratory Manual.CSHL Press，1994)，通過將線化啟動子轉(zhuǎn)基因盒顯微注射入從超數(shù)排卵的捐贈者小鼠中分離的受精卵的雄性前核，形成轉(zhuǎn)基因小鼠。將具有繁殖性的胚胎注入代孕的接受者并使其發(fā)育至足月。為了產(chǎn)生ADAM12-S，捐贈者和接受者均使用B6CBAF1(C57Bl/6j X CBAF1)小鼠。為了產(chǎn)生ADAM12-Δcyt小鼠，使用先天的小鼠品系FVB/n。
在MMTV-LTR轉(zhuǎn)錄控制下的胸腺中表達PyV中部T(PyV middle T)(PyMT)的雜交轉(zhuǎn)基因FVB/N-TgN(MMTVPyVT)634Mul小鼠是從Jackson實驗室獲得的。這些小鼠在小鼠乳腺瘤病毒長末端重復啟動子/增強子(LTR)的控制下表達有活性的多瘤病毒Middle T致癌基因，并自發(fā)地在肺中發(fā)生多病灶乳腺癌和轉(zhuǎn)移的腫瘤(AldazCM et al Carcinogenesis 172069-2072，1996)。使PyMT雄鼠(FVB)與MMTVADAM12-S和MMTVADAM12-Δcyt鼠系的雌鼠交配。其后代包括新的獨特的鼠系并形成PyMT，MMTV-PyMT-ADAM12-S，和MMTV-PyMT-ADAM12Δcyt組。
每周兩次觀察交配得到的后代雌鼠的明顯腫瘤的存在情況。記錄出現(xiàn)胸腺腫瘤基因的年齡。記錄未患病小鼠的數(shù)量作為年齡函數(shù)。使用兩腳規(guī)測量腫瘤。將全部雌鼠在12周時進行無痛處死。切下腫瘤并稱重，測量長、寬、高(cm3)。評價絕對和相對的腫瘤負荷(分別為，g腫瘤組織和g腫瘤組織/小鼠重量)。全部試驗為按照丹麥動物Inspectorate的動物試驗指南來指導的。
實施例3 ADAM12的自動時間分辨熒光免疫分析法的開發(fā) 程序 如上所述使用相同反應物，即，使用生物素化抗體8F8和6E6包被和檢測，標準品為轉(zhuǎn)染的人293-EBNA細胞產(chǎn)生的重組ADAM12-S，建立一種ADAM12時間分辨熒光免疫分析法在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中用0.41μg/孔的單克隆抗體6E6包被微孔板(Nunc-ImmunoTM Plate，MaxiSorpTM Surface，Nalge NuncInternational-Denmark)。4℃過夜孵育后將板清洗兩次。所有清洗步驟都是使用清洗緩沖液(Delfia Wash Solution；Perkin-Elmer，Turku，F(xiàn)inland)完成的向每孔中加入由溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中的15g/L牛血清白蛋白(A4503，Sigma)和25g/L蔗糖組成的干燥緩沖液(150uL/well)。將這些板在室溫下孵育1小時，抽吸，并在用封條密封和4℃儲存前，在4℃下過夜干燥。除去封條后，將該板放在自動分析編程的自動時間分辨熒光免疫分析儀中，進行以下操作1.加入在多元緩沖液(Perkin-Elmer)中適當稀釋的標準品和對照品，以及未稀釋的臨床血清樣品，100uL/孔。室溫孵育2小時并在清洗緩沖液(Perkin Elmer)中清洗4次。2.以100uL/孔，加入在多元緩沖液(Perkin Elmer)中適當稀釋(取決于生物素化和純化的質(zhì)量)的生物素化8F8，室溫孵育1小時并清洗4次。3.以100UL/孔，加入1∶1000多元緩沖液(Perkin Elmer)稀釋的銪標記的鏈酶抗生物素(蛋白)，室溫孵育1小時，然后清洗3次。4.以200uL/孔加入加強溶液(Perkin Elmer)，并記錄熒光10分鐘。
使用log-樣條函數(shù)通過自動時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)制作標準曲線。使用標準曲線計算濃度值。每次操作中的對照品為，使用通過多元緩沖液中(Perkin Elmer)稀釋產(chǎn)生的161ug/L，319ug/L和714ug/L的對照品。
特征描述 重組ADAM12-S和妊娠血清的稀釋曲線為線性且平行。均值校正為113％(范圍106％-120％)，并且在119ug/L和356ug/L之間該標準曲線為線性(斜率0.91-1.00)。標準(測量)范圍為78-1248ug/L。靈敏度為2.5-5ug/L。測量范圍可以擴大到5ug/L。對照品水平的分析內(nèi)變化為5.6％，8.5％和10.7％，分別是低，中和最高，分析間變化分別為13.3％，10.9％和16.0％。
實施例4 作為先兆子癇的ADAM12 妊娠婦女血清樣品是從哥本哈根早孕期篩查研究計劃收集的樣品中獲得的。160個樣品是從后來發(fā)生先兆子癇的妊娠婦女中獲得的，并且所有的婦女都滿足兩個標準之一以前血壓正常的婦女中收縮壓＞140mm Hg且舒張壓＞90mm Hg或者在人身期間舒張壓＞20mm Hg的增長。324個來自簡單妊娠婦女的樣品作為對照品進行分析。臨床和妊娠結(jié)果數(shù)據(jù)為，從哥本哈根早孕期篩查研究的文件中得到。如上所述，使用ADAM12自動時間分辨熒光免疫分析儀對ADAM12-S進行分析。使用ADAM12濃度值對孕齡天數(shù)的log線性衰減，將全部濃度值轉(zhuǎn)換為MoM值。
結(jié)果 在先兆子癇病人中，平均logMoMADAM12為-0.066(范圍-1.009-0.441)，顯著低于(p＝0.008)正常妊娠的平均logMoMADAM12值0.001(范圍-1.071-0.508)。
結(jié)論 先兆子癇中低水平的ADAM12使得ADAM12成為一種有用的先兆子癇標記物。
實施例5 早孕期和中孕期唐氏綜合癥妊娠中的ADAM12-British研究 材料和方法 使用胎兒醫(yī)學協(xié)會管理的實驗室在英國的生物化學篩查中提及的來自包括226例10-14周唐氏綜合癥病例和89例中孕期唐氏綜合癥病例的妊娠婦女的樣品，來研究ADAM12 MoM數(shù)值在唐氏綜合癥中的分布。使用典型的對照品來建立MoM在正常妊娠中的分布。通過上述的免疫熒光檢測方法來量化ADAM12。隨年齡增長單獨使用ADAM12或與其他標記物的聯(lián)合使用，通過Larsen等人，1998和Laigaard等人，2003描述的Monte Carlo模擬來評價篩查效果。
結(jié)果 圖1表示80天(11-12周)-130天(18-19周)的ADAM12濃度中值的分布。其水平減少，直至16周，然后增加。通過如圖1所示的三次多項式樣條函數(shù)，正常樣品得到了最佳描述。使用回歸中值MoMs計算唐氏綜合癥中的MoM，并且個體病例的分布作為孕齡的函數(shù)表示在圖2中。從圖中可以看到，早孕期的初期，ADAM12MoM數(shù)值大大減少，早孕期后期更少，并在中孕期增加。在整個早孕期，平均MoM值為0.79，中孕期為1.79。84天前采取的21三體癥樣品(n＝43)的平均logMoM(SD)是-0.311(0.3186)，對照組(n＝152)為0.015(0.3030)。84天之前，使用1∶100的出生DS孩子的風險臨界值，將DS胎兒的檢出率(DR)評估為對于1.4％的假陽性率(FPR)的18％。對于風險臨界值1∶250和1∶400，DR(FPR)s分別是36％(6.0％)和48％(12％)。在孕齡84-97天，DS妊娠(n＝172)的ADAM12和對照組妊娠(n＝341)之間沒有顯著殘別。在中孕期，21三體癥妊娠(n＝87)的平均logMoM(SD)是0.257(0.2437)，對照組妊娠(n＝341)為0.027(0.4136)。對于風險臨界值1∶100，1∶250和1∶400，評估的DR(FPR)s分別是17％(1.4％)，34％(5.5％)和46％(11％)。
結(jié)論 對于胎兒唐氏綜合癥，ADAM12是-種良好的母體血清標記物，特別是在早孕期和中孕期。ADAM12補充PAPP-A，βhCG和NT，并能夠與它們結(jié)合后被有效利用。
實施例6 作為18三體癥母體血清標記物的ADAM12-Danish研究。
材料和方法 來自有18三體癥的早孕期妊娠婦女的血清是從哥本哈根國家血清研究所的生物庫得到的。154例有正常結(jié)果的妊娠用作對照組。孕齡和其他信息是從投稿論文提供的信息中得到的。使用上述的ELISA量化血清中的ADAM12。
結(jié)果 18三體癥妊娠的ADAM12明顯減少，在早孕期最為明顯。與對照組1.0相比，MoM中值是0.29。
結(jié)論 ADAM12是早孕期胎兒18三體癥的標記物。
實施例7 作為18三體癥母體血清標記物的ADAM12-British研究 材料和方法 使用胎兒醫(yī)學協(xié)會管理的實驗室在英國的生物化學篩查中提及的來自包括早孕期和中孕期的143例18三體癥癥病例和730例對照組妊娠的妊娠婦女的樣品，來研究ADAM12MoM數(shù)值在18三體中的分布。使用典型的對照品來建立MoM在正常妊娠中的分布。通過上述的免疫熒光檢測方法來量化ADAM12。
結(jié)果 早孕期18三體癥妊娠(n＝131)的母體血清ADAM12平均logMoM(SD)是-0.097(0.2661)，中孕期18三體癥妊娠(n＝12)為0.312(0.2607)。
早孕期18三體癥妊娠logMoM ADAM12值分布描述如下 早孕期18三體癥妊娠LogADAM12 MoM值分布的圖形描述如圖29A所示。
早孕期18三體癥妊娠LogADAM12 MoM值的盒須圖如圖29B所示。
早孕期18三體癥妊娠LogADAM12 MoM值的常態(tài)概率圖如圖30所示。
圖29B的重要分布數(shù)據(jù) 具有1og MoMADAM12常態(tài)分布的依從性的統(tǒng)計分析 中孕期18三體癥妊娠logMoMADAM12值分布如圖31和以下所述 中孕期18三體癥妊娠LogADAM12MoM值分布的圖形描述如圖31A所示。
中孕期18三體癥妊娠LogADAM12MoM值的盒須圖如圖31B所示。
圖31B中給出的分布的概率統(tǒng)計 中孕期18三體癥妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖30所示。
具有18三體癥妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 結(jié)論 ADAM12在早孕期18三體癥妊娠中適度減少，在中孕期18三體癥妊娠中顯著減少。ADAM12時早孕期和中孕期胎兒18三體癥的標記物。
實施例8 作為13三體癥母體血清標記物的ADAM12-British Study 材料和方法 使用胎兒醫(yī)學協(xié)會管理的實驗室在英國的生物化學篩查中提及的來自包括早孕期和中孕期的66例13三體癥病例和730例對照組妊娠的妊娠婦女的樣品，來研究ADAM12 MoM數(shù)值在13三體癥中的分布。使用典型的對照品來建立MoM在正常妊娠中的分布。通過上述的免疫熒光檢測方法來量化ADAM12。
結(jié)果 早孕期13三體癥妊娠(n＝60)的母體血清ADAM12平均logMoM(SD)是-0.221(0.356)，中孕期13三體癥妊娠(n＝6)為0.170(0.1853)。
早孕期 早孕期13三體癥妊娠logMoMADAM12值分布描述如下 早孕期13三體癥妊娠LogADAM12 MoM值分布的圖形描述如圖33A所示。
早孕期13三體癥妊娠LogADAM12 MoM值的盒須圖如圖33B所示。
圖33B中給出的分布的概率統(tǒng)計 早孕期13三體癥妊娠LogADAM12 MoM值的常態(tài)概率圖如圖34所示。
具有13三體癥妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 中孕期 中孕期13三體癥妊娠logMoMADAM12值分布描述如下 中孕期13三體癥妊娠LogADAM12MoM值分布的圖形描述如圖35A所示。
中孕期13三體癥妊娠LogADAM12MoM值的盒須圖如圖35B所示。
圖35B中給出的分布的概率統(tǒng)計 中孕期13三體癥妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖36所示。
具有13三體癥妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 結(jié)論 ADAM12在早孕期和中孕期13三體癥妊娠中減少。ADAM12是早孕期和中孕期胎兒13三體癥的標記物。
實施例9 作為特納氏綜合癥母體血清標記物的ADAM12-British Study 材料和方法 使用胎兒醫(yī)學協(xié)會管理的實驗室在英國的生物化學篩查中提及的來自包括早孕期和中孕期的83例特納氏綜合癥病例和730例對照組妊娠的妊娠婦女的樣品，來研究ADAM12MoM母體血清數(shù)值在胎兒特納氏綜合癥中的分布。使用典型的對照品來建立MoM在正常妊娠中的分布。通過上述的免疫熒光檢測方法來量化ADAM12。
結(jié)果 早孕期特納氏綜合癥妊娠(n＝77)的母體血清ADAM12平均logMoM(SD)是-0.177(0.3195)，中孕期特納氏綜合癥妊娠(n＝6)為0.172(0.1853)。
以下的圖描述早孕期45X0妊娠分布狀況 早孕期45X0妊娠LogADAM12MoM值分布的圖形描述如圖37A所示。
早孕期45X0妊娠LogADAM12MoM值的盒須圖如圖37B所示。
C.圖37B表示的分布的概率統(tǒng)計 早孕期45X0妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖34所示。
E.具有早孕期45X0妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 中孕期 中孕期45X0妊娠logMoMADAM12值分布描述如下 中孕期45X0妊娠LogADAM12 MoM值分布如圖39A所示。
A的分布數(shù)據(jù)盒須圖如圖39B所示。
C.圖39B的重要統(tǒng)計學參數(shù) 中孕期45X0妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖40所示。
E.具有中孕期45X0妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 結(jié)論 ADAM12在早孕期特納氏綜合癥妊娠中減少，并在中孕期特納氏綜合癥妊娠中增加。ADAM12是早孕期和中孕期胎兒特納氏綜合癥的標記物。
實施例10 作為非特納氏性染色體異常(NTSCA)，例如47 XXX，47 XXY，47 XYY母體血清標記物的ADAM12-British Study 材料和方法 使用胎兒醫(yī)學協(xié)會管理的實驗室在英國的生物化學篩查中提及的來自包括早孕期和中孕期的37例NTSCA病例和730例對照組妊娠的妊娠婦女的樣品，來研究ADAM12 MoM母體血清數(shù)值在NTSCA中的分布。使用典型的對照品來建立MoM在正常妊娠中的分布。通過上述的免疫熒光檢測方法來量化ADAM12。
結(jié)果 早孕期NTSCA妊娠(n＝24)的母體血清ADAM12平均logMoM(SD)是-0.238(0.3223)，中孕期特納氏綜合癥妊娠(n＝13)是0.212(0.1202)。
LogADAM12MoM值分布如下所示 早孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值分布的圖形描述如圖41A所示。
早孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值的盒須圖如圖41B所示。
圖41B的早孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM的重要統(tǒng)計學參數(shù) 早孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖42所示。
5.具有常態(tài)分布的早孕期logMoMADAM12值的依從性檢測 LogADAM12MoM值的中孕期分布描述如下 中孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值分布如圖43A所示。
中孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值數(shù)據(jù)盒須圖如圖43B所示。
圖43B的重要統(tǒng)計學參數(shù) 中孕期NTSCA妊娠LogADAM12MoM值的常態(tài)概率圖如圖44所示。具有中孕期45X0妊娠logMoMADAM12值常態(tài)分布的依從性檢測 結(jié)論 ADAM12在早孕期NTSCA妊娠中明顯減少，并在中孕期NTSCA中顯著增加。ADAM12是早孕期和中孕期胎兒NTSCA的標記物。
實施例11 與其他血清學標記物和NT(在11-13周被確定的)和母體年齡聯(lián)合作為早孕期標記物的ADAM12 如果與其他血清學的(早孕期PAPP-A，βhCG，proMBP或SP1)和超聲(頸部半透明(NT)和鼻骨和其他生物統(tǒng)計學特征)標記物結(jié)合使用，則ADAM12作為21三體癥的效率大大增強。
結(jié)果 84天前采取的21三體癥樣品(n＝43)平均logMoM(SD)是-0.311(0.3186)，對照組(n＝152)為0.015(0.3030)。早孕期標記物之間的相關(guān)性如圖19-24所示 頸部半透明和母體年齡之間沒有相關(guān)性(見圖23) 下表總結(jié)了早孕期的不同癥狀中ADAM12和PAPP-A和游離β-hCG與對照組之間的相關(guān)性 不同癥狀中ΔNT和ADAM12的相關(guān)性 孕齡84前的早孕期評估效果的結(jié)果 通過結(jié)合其他標記物確定ADAM12在早孕期(＜12周)的效果-British研究 根據(jù)Larsen等，J Med Screen 1998，557～62中描述的進行DR檢測率以及FPR假陽性率評估 結(jié)論 當與其他早孕期標記物結(jié)合使用時，ADAM12是有效的早孕期初期21三體癥標記物。這是該標記物首選的用途。
實施例12 與其他血清學標記物和和母體年齡聯(lián)合作為中孕期21三體癥標記物的ADAM12 如果與其他血清學的(中孕期AFP和βhCG)和可能的超聲標記物結(jié)合使用，則ADAM12作為21三體癥的效率大大增強。
結(jié)果 在中孕期，21三體癥樣品(n＝87)平均logMoM(SD)是0.257(0.2437)，對照組(n＝341)為0.027(0.4136)。中孕期標記物之間的相關(guān)性如圖25-29所示 通過結(jié)合其他標記物確定ADAM12在中孕期(＞13周)的效果-British研究 根據(jù)Larsen等，J Med Screen 1998，557～62中描述的進行DR檢測率以及FPR假陽性率評估 數(shù)據(jù)來自Rode等，Prenat Dagn 2003，593～598。
結(jié)論 當與其他中孕期標記物結(jié)合使用時，ADAM12是有效的21三體癥中孕期母體血清標記物。這是該標記物首選的用途。
實施例13 先兆子癇中的ADAM12-British研究 在Harold Wood醫(yī)院(埃塞克斯)和胎兒醫(yī)學中心(倫敦)，在一站式風險評估(OSCAR)18中，利用胎兒頸部半透明和母體血清游離β-hCG和PAPP-A，對全部妊娠婦女給與21三體癥篩查。評估時將人口統(tǒng)計學特征，超聲結(jié)果和生物化學檢測結(jié)果輸入計算機數(shù)據(jù)庫。常規(guī)分析后，全部樣品儲存于-20℃。
一項鑒別所有單個妊娠的研究由數(shù)據(jù)庫組成，其與早孕期篩查結(jié)合。然后研究這些病人每人的醫(yī)院記錄和產(chǎn)房記錄，以鑒別受先兆子癇困擾的妊娠和獲得分娩細節(jié)。先兆子癇定義為，沒有已患高血壓或腎臟疾病的婦女在任意時刻的舒張壓為110mmHg以上或間隔4小時的連續(xù)兩個時刻的舒張壓為90mmHg，并且在24小時收集的尿中存在多于300mg總蛋白或在試劑帶上存在1+白蛋白。20共67個病例被鑒定，基于35周前分娩的需要，其中33例被鑒定為嚴重。作為對照組，一系列與孕齡和儲存時間相匹配的病例與用于使用時間分辨熒光免疫檢測的ADAM12分析的病例一同被得到。
此外，作為研究實驗的一部分，引入尿道多普勒測量，在23-24孕周多普勒檢查時收集75個對照樣品和12個PET病例。這些樣品也用于分析ADAM12。
結(jié)果 早孕期收集的病例組中，全部先兆子癇組的中值MoMADAM12低于正常的中值MoM0.90。在嚴重先兆子癇組中，該中值甚至更低至0.75MoM。在23-24周的病例中，先兆子癇組的中值MoM稍高于正常的中值MoM1.14。
結(jié)論 這些結(jié)果證實了例4中給出的數(shù)據(jù)。而且，ADAM12可能也是中孕期先兆子癇的有用標記物。
實施例14 不依賴孕齡的ADAM12值的計算 由于在相同孕齡妊娠的ADAM12的明顯變化和ADAM12隨年齡的增長，因此幾乎不能使用血清中ADAM12的絕對濃度作為標記物。這是通過表達ADAM12的母體血清水平-以任何直接或間接確定-作為妊娠的同一時間的正常婦女中被期待的水平的函數(shù)。孕齡可以表達為最后依次月經(jīng)后的天數(shù)，作為胎兒生物統(tǒng)計學標記物或其他適于表現(xiàn)ADAM12隨妊娠發(fā)展的變化的事物。
制作獨立于孕齡的ADAM12數(shù)值的一種方式是，使用特定孕齡的中值倍數(shù)，例如通過計算每周或每天的實驗式中值?；蛘?，可以使用其他與孕齒相關(guān)的標記物，例如冠臀長和二頂骨直徑計算實驗式中值。后者是ADAM12的優(yōu)選用途。
實施例15 作為21三體癥和18三體癥10-12孕周標記物的ADAM12-Leeds Study 本研究的目的是建立作為孕齡期10-12周的21三體癥和18三體癥母體血清標記物的性能，而以前的研究表示ADAM12的該識別能力可以被忽略。
在268例對照妊娠和20例樣品中，使用熒光免疫分析來確定ADAM12濃度。
21三體癥(n＝16)和18三體癥(n＝4)。在利茲的篩查中心收集樣品，于-20℃儲存，并且按儲存時間的長短和冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)匹配對照組和樣品。
結(jié)果 通過log線性衰減估測每個孕周的ADAM12中值。估測的ADAM12中值在9周為214ug/L，10周為275ug/L，11周為353ug/L，12周為454ug/L，13周為584ug/L。將全部樣品ADAM12濃度轉(zhuǎn)換為logMoM值，并且對照組中l(wèi)ogMoMADAM12的分布為均值0.000，標準差0.326。在16個Ds樣品中，平均logADAM12MoM為-0.044，并且與對照組沒有顯著差別(p＝0.55)。在DS妊娠中，平均ADAm12MoMs為9周是1.09(n＝1)，10周是0.9968(n＝5)，11周是0.8223(n＝9)，12周是1.113(n＝1)。在18三體癥妊娠中，theADAM12 MoM值1，92，0.765，1.705和2.09各自是在9，11，12和13周獲得的。
結(jié)論 在10-12周，對于21三體癥，ADAM12不是一個良好的母體血清標記物，而對于18三體癥它似乎是良好的標記物。當使用ADAM12作為染色體異常疾病的標記物時，在恰當?shù)脑旋g使用ADAM12和使用logMoM值是重要的。該研究是上述Danish研究(Laigaard等人，2003)和British研究(Example5)結(jié)果的一項獨立確認。
參考文獻
EP 1 524 523
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權(quán)利要求
1.一種用于篩查胎兒中胚胎異常的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供來自個體的身體樣品；
b)確定所述樣品中ADAM12水平，其通過檢測
1)ADAM12多肽和/或
2)編碼ADAM12表達的多聚核苷酸，和/或
3)特異的ADAM12蛋白酶活性，優(yōu)選通過檢測IGFBP-3及其衍生物，或其他適宜的ADAM12底物的剪切；
c)將所述水平與參照水平進行比較；
d)鑒定是否該水平與所述參照水平不同，并且
如果該水平與參照水平不同，則評估是否胎兒具有提高的胎兒異常和/或不良妊娠的風險。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物樣品選自血液、尿、胸膜液、口腔清洗物、組織切片和卵泡液所組成的組。
3.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中，所述生物樣品選自血液、血漿和血清所組成的組。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中，所述生物樣品是血清。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求的任一項所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠選自胎盤疾病或功能紊亂、21三體癥、18三體癥、13三體癥、先兆子癇、子宮內(nèi)生長遲緩、異位妊娠、開放性脊柱裂、神經(jīng)管缺損、腹壁缺損、Edwards綜合癥、Pateaus綜合癥、特納氏綜合癥、X單染色體癥、三倍體、單倍體、孕齡小和Kleinefelter綜合癥所組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為21三體癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為先兆子癇。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為18三體癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為13三體癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為特納氏綜合癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述胎兒異常和/或不良妊娠為非特納氏性染色體異常(NTSCA)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項所述的方法，其中，ADAM12被評定為早孕期標記物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項所述的方法，其中，ADAM12被評定為中孕期標記物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一項所述的方法，其中，ADAM12水平與至少一個選自以下組的標記物的數(shù)值結(jié)合，該組由甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(UE3)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人絨毛膜促性腺激素游離α亞單位(游離α-hCG)、人絨毛膜促性腺激素游離β亞單位(游離β-hCG)、β核hCG、過糖基化hCG(ITG)、胎盤生長激素(PGH)、優(yōu)選二聚抑制素-A(抑制素A)的抑制素、妊娠相關(guān)的血漿蛋白-A(PAPP-A)、PAPP-A與ProMBP復合體(主要堿性蛋白的前體形式)、ProMBP、ProMBP與血管緊張素和/或補充因子的復合體和剪切產(chǎn)物、Schwangerschaftsprotein 1(SP1)、癌抗原125(CA125)、前列腺特異性抗原(PSA)、白細胞酶、胚胎DNA、胚胎RNA、胚胎細胞、干細胞、雌二醇、超聲標記物、頸部半透明、腿骨長度、缺少鼻骨、腸腔高回聲、心臟中的強回聲點、脈絡(luò)膜囊腫(Choroids plexus cysts)、腎盂積水、胎兒畸形、類固醇、肽類、趨化因子、白介素(例如IL-6，IL-4，IL-1)、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和β、急性期反應物、C反應蛋白、纖連蛋白、母體或胚胎的單核苷酸多態(tài)性例如TNFβ和甘露聚糖結(jié)合凝集素啟動子區(qū)的多態(tài)性、補充成分、HLA-G和HLA分子組成。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的任一項所述的方法，其中，計算不依賴孕齡的(MOM)或ADAM12值用以評估胎兒或胎盤疾病的風險。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15的任一項所述的方法，其中，不依賴孕齡ADAM12(MOM)與生物統(tǒng)計學，血清學或臨床信息結(jié)合用于獲得發(fā)生先兆子癇的風險。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16的任一項所述的方法，其中，樣品是在孕齡之前11周和/或孕齡12周之后獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于指示提供細胞功能異常的方法，分析法和試劑盒。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，血清ADA M12濃度變化作為預測細胞功能異常帶來的臨床結(jié)果、并發(fā)癥和死亡率的預后工具是有用的。本發(fā)明人描述了作為細胞功能異常全面標記物的ADAM12，同時本發(fā)明人第一次證明了，ADAM12是胚胎和胎盤發(fā)育、功能的重要指示劑，并且ADAM12可以反映疾病的存在，分類或進展。本發(fā)明人開發(fā)了一種酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)和一種時間分辨熒光免疫分析法，用于量化血清中的ADAM12。
文檔編號C12Q1/68GK1981196SQ20058001589
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者烏拉·M·韋威爾, 邁克爾·克里斯蒂安森, 卡米拉·弗勒利克, 珍妮·萊加德, 本特·諾加德-彼澤森, 凱文·斯潘塞 申請人:哥本哈根大學, 國家血清研究中心, 哈羅德伍德醫(yī)院