專利名稱：L-蘋果酸診斷/測定試劑盒及l(fā)-蘋果酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 L-蘋果酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景蘋果酸有D—蘋果酸、DL—蘋果酸和L一蘋果酸。L一蘋果酸又名2— 羥基丁二酸，是生物體三羧酸的循環(huán)中間體，易被人體吸收，因此作為性 能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療和保健 品等領(lǐng)域。L—蘋果酸中含有天然的潤膚成分，可以清除皮膚表面鈹紋，使 皮膚變得嫩白、光潔而有彈性，因此在化妝品配方中備受青睞；L一蘋果酸 可以配制多種香精、香料，用于多種日用化工產(chǎn)品，如牙膏、洗發(fā)香波等; 國外將其用于替代檸檬酸作為新型洗滌助劑，用于合成高檔特種洗滌劑。L 一蘋果酸可用于藥物制劑、片劑、糖漿中，還可以配入氨基酸溶液中，能 明顯提高氨基酸的吸收率；L一蘋果酸可以用于治療肝病、貧血、免疫力低 下、尿毒癥、高血壓、肝衰竭等多種疾病，并能減輕抗癌藥物對正常細胞 的毒害作用；還可用于制備和合成驅(qū)蟲劑、抗牙街劑等。另外L一蘋果酸 還可以作為工業(yè)清洗劑、樹脂固化劑、合成材料增塑劑、飼料添加劑等。中華人民共和國國家標準GB 13737-92有關(guān)食品添加劑L-蘋果酸的 檢測是用蘋果酸氨鹽呈色試驗，是用化學(xué)方法顯色。另外，還有利用高錳 酸鉀化學(xué)發(fā)光體系測定了 DL-蘋果酸。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用二倍擴增法(Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)、法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm 波長處吸光度的變化，得以測定L-蘋果酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將 給出用以實現(xiàn)該方法的L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在 紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行L-蘋果酸濃度測定，而 且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明L-蘋果酸濃度測定方法原理如下L-蘋果酸+輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)丙酮酸+ 二氧化碳+還原型輔酶丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙酰輔酶入+還原型輔酶這種方法應(yīng)用L-蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40)偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)酶促反應(yīng)速率比色法/終點法。L-蘋果酸脫氫酶酶解L-蘋果酸反 應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過偶聯(lián)丙酮酸脫氫酶的作用，最終二次將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從 而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量 340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算L-蘋果酸的濃度大小。本方法 也可以省略第二反應(yīng)，如此就沒有二倍擴增，靈敏度減少一半。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明L-蘋果酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 6 mmol/LL-蘋果酸脫氫酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的L-蘋果酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶。 輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、L-蘋果酸脫氫酶。輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定L-蘋果酸濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的L-蘋果酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 6 mmol/L' L-蘋果酸脫氫酶 10000 U/L丙酮酸脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測L-蘋果酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O 分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出L-蘋果酸 的濃度大小。 實施例二本實施例的L-蘋果酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L輔酶A 6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/LL-蘋果酸脫氫酶 丙酮酸脫氫酶10000U/L 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測L-蘋果酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延 遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出L-蘋果酸 的濃度大小。 實施例三本實施例的L-蘋果酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑輔酶A50 mmol/L3 mmol/L6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑丙酮酸脫氫酶500 mmol/L12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/LL-蘋果酸脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定L-蘋果酸濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測L-蘋果酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出L-蘋果酸 的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種二倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法的L-蘋果酸的濃度測定方法，其方法原理如下L-蘋果酸+輔酶 蘋果酸脫氫酶(脫羧化) 丙酮酸+二氧化碳 +還原型輔酶丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+ 乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出L-蘋果酸的濃度大小測定結(jié)果。本方法也可以省略第二反應(yīng)，如此就沒有二倍擴增。靈敏度減少一半。
2. —種L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括:緩沖液 穩(wěn)定劑.20--500 mmol/L-4000 mmol/L.6 mmol/L.1000-.1000-.50 mmol/L-80000 U/L-80000 U/L輔酶AL-蘋果酸脫氫酶 丙酮酸脫氫酶其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A 組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、 L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔酶A 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、 L-蘋果酸脫氫酶組成。輔酶、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、輔 酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.P/。-100。/()體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的L-蘋果酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定L-蘋果酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、輔酶A、L-蘋果酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出L-蘋果酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101329326SQ20071002471
公開日2008年12月24日 申請日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司