專利名稱：谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒及谷氨酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定谷氨酸 濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009-2003味精衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法有l(wèi).旋 光計(jì)法2.甲醛滴定法3.凱氏定氮法。味精系指以糧食及制品為原料經(jīng)發(fā)酵提 純的谷氨酸鈉。酶法分析是國(guó)際上公認(rèn)的谷氨酸鹽的分析方法，已被多個(gè)國(guó)際權(quán)威組織 或機(jī)構(gòu)采納如IFU (國(guó)際果汁生產(chǎn)者協(xié)會(huì))，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn) 者聯(lián)盟)，及MEBAK,OICC,VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè) 方法。已被寫入澳大利亞，荷蘭，德國(guó)，瑞士等多個(gè)國(guó)家的食品法。國(guó)內(nèi)也 有數(shù)家果汁、酒類加工企業(yè)使用酶法試劑盒作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。生物體內(nèi)存在分解骨質(zhì)的破骨細(xì)胞和形成骨骼的成骨細(xì)胞，正常情況下 兩種細(xì)胞的作用保持著良好的平衡。如果平衡被打破、破骨細(xì)胞過(guò)于活躍， 就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。破骨細(xì)胞中含有谷氨酸，而一種名為"谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體"的 蛋白可以將谷氨酸排出破骨細(xì)胞，被"釋放"的谷氨酸會(huì)和細(xì)胞表面的受體結(jié) 合，激活細(xì)胞內(nèi)的酶，抑制破骨細(xì)胞分解骨質(zhì)的作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng) 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致 在400—700nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，得以測(cè)定谷氨酸濃度的方法，同時(shí)， 本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅 可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行谷氨酸濃度測(cè)定，而且 測(cè)定速度快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明谷氨酸濃度測(cè)定方法原理如下 L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+ 2-酮戊二酸酯+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶n引嗒胺色原或醌亞胺色原+水這個(gè)方法應(yīng)用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶聯(lián)過(guò)氧化物酶(peroxidase ; EC Ul丄7)酶促反應(yīng)終點(diǎn)/速率比色法。谷 氨酸氧化酶酶解谷氨酸反應(yīng)，再通過(guò)偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的作用，最后生成的過(guò) 氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下，將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的染 料，從而可以通過(guò)可見光分析儀器，在400—700nm (根據(jù)還原型色原體組 合的不同而定)波長(zhǎng)處，測(cè)定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺 色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大??；通過(guò)測(cè)量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程度/速度，得出谷氨 酸濃度大小測(cè)定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L過(guò)氧化物酶 30000 U/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L還原型色原體組合0.1-20 mmol/L所述還原型色原體組合,(Chromogen)可以是下列28個(gè)組合中的任何一個(gè)配對(duì)組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1^-乙基一^- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙任溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮脂爾雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒1^-乙基^>4- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4_羥基_3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發(fā)明的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接 使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、谷氨酸氧化酶。 過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、谷氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、過(guò)氧化物酶、谷氨酸氧化酶。 過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、谷氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L過(guò)氧化物酶 30000 U/L谷氨酸氧化酶 10000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波 長(zhǎng)505nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)谷氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)方法為終點(diǎn)/速率法，延遲時(shí)間大約0 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)505nrn吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出谷氨酸的濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括-試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸0.2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L過(guò)氧化物酶谷氨酸氧化〖4-氨基抗砒30000 U/L 10000U/L 0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè)試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)谷氨酸樣品與試劑的體積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)方法為終點(diǎn)/速率法，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出谷氨酸的濃度大小。 實(shí)施例三本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑3-甲基-2-苯噻唑酮腙50 mmol/L0.6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L試劑3雙甲基苯胺三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑過(guò)氧化物酶谷氨酸氧化酶2 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L30000 U/L10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C,反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng) 578nm，測(cè)試副波長(zhǎng)660nm，被測(cè)谷氨酸樣品與試劑的體積比例為1/30，反 應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測(cè)方法為終點(diǎn)/速率法，延遲時(shí)間大約0分 鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析13儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nrn吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出谷氨酸的濃 度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不 另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)可見光分析儀器 得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的谷氨酸濃度測(cè)定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+2-酮戊二酸酯+過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫+還原型色原體組合過(guò)氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測(cè)400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出谷氨酸濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000mmol/L過(guò)氧化物酶 500——80000 U/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成 單劑試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組成。 過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合、谷氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合組 成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶組成。過(guò)氧化物酶、還原型色原體組 合、谷氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個(gè)組合中的任一個(gè)配對(duì)組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 齊基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻咬胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的谷氨酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定谷氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、谷氨酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)，最終將無(wú)色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過(guò)可見光分析儀器，在400-700nm波長(zhǎng)處，測(cè)定染料含量的高低，進(jìn)而直接反映出谷氨酸濃度的大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101324570SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司