一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：AMP緩沖液5~35mmol/L、神經(jīng)氨酸苷酶2~8KU/L、乳酸脫氫酶0.01~0.30KU/L、吐溫?20 3~15g/L、苯甲酸鈉0.1~2g/L，試劑R2：AMP緩沖液5~35mmol/L、NADH2~18mmol/L、神經(jīng)氨酸醛縮酶0.5~5.5KU/L、聚乙二醇?2000 1~15g/L、苯甲酸鈉0.1~2g/L，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的唾液酸的濃度。本發(fā)明具有操作方便、測定準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定唾液酸的試劑盒及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 唾液酸(SA)是一種天然存在的碳水化合物，它最初由頌下腺粘蛋白中分離而出， 也因此而得名，唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在，人體中，腦的唾液酸含 量最高，腦灰質(zhì)中的唾液酸含量是肝、肺等內(nèi)臟器官的15倍，唾液酸的主要食物來源是母 乳，也存在于牛奶、雞蛋和奶酪中。
[0003] 唾液酸是細(xì)胞膜糖蛋白的重要組成部分，與生物體的許多生物學(xué)功能有關(guān)，且與 細(xì)胞惡變、癌轉(zhuǎn)移、浸潤、失去接觸性抑制、細(xì)胞粘附性降低以及腫瘤抗原性密切相關(guān)，測定 血清唾液酸濃度，可作為癌腫診斷輔助性指標(biāo)和療效觀察指標(biāo)。
[0004] 唾液酸(SA)明顯升高的疾病有:急性白血病、食道癌、賁門癌、胃癌、腸癌、肝癌、肺 癌以及卵巢癌等，其中以急性白血病患者為最高。腫瘤患者血清唾液酸增高可能是腫瘤細(xì) 胞涎糖蛋白合成增加和代謝的改變在血中的反映 癌癥患者的唾液酸(SA)水平動態(tài)變化與病情相關(guān)，可以用于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù) 發(fā)。
[0005] 目前，檢測唾液酸（SA)含量的方法有HPLC法、化學(xué)比色法，HPLC法雖然靈敏度高、 特異性好，但是需要特殊的儀器且昂貴，化學(xué)比色法特異性低，操作復(fù)雜，部分反應(yīng)的物質(zhì) 需要特殊的化學(xué)手段提取，而且測定準(zhǔn)確度低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜、成本高以及測定準(zhǔn)確 度低的缺陷，而提供一種測定唾液酸的試劑盒及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開了一種測定唾液酸的試 劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5~5.5KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開了一種測定唾液酸的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試 劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了上述測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，包 括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的唾液酸的濃度。
[0010]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 10到1:50之間。
[0012]本發(fā)明的檢測原理是:樣品中的唾液酸受神經(jīng)氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神經(jīng) 氨酸，進(jìn)而在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(NANA-醛縮酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖 胺。丙酮酸在NADH存在下由乳酸脫氫酶(LDH)作用下生成乳酸和NAD+。測定該NADH的吸光下 降的速率可求得樣本中唾液酸濃度。
式中：△ AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 Δ As以空白管吸光度作對照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中SA的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過在試劑R2中添加了反應(yīng)加速 劑聚乙二醇-2000，加快了反應(yīng)的反應(yīng)速度，防止了因反應(yīng)體系反應(yīng)過慢所帶來的酶濃度變 化過小，進(jìn)一步造成反映產(chǎn)物過低、變化不靈敏的缺陷，因此本發(fā)明的檢測的準(zhǔn)確性較高， 另外在苯甲酸鈉作為防腐劑的同時，提高了整個試劑的保存的穩(wěn)定性，也就進(jìn)一步提高了 本發(fā)明的檢測的準(zhǔn)確性、精密性，而且本發(fā)明不含有任何污染物，不會造成環(huán)境的污染，操 作也比較簡便。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0015] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。
[0016] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: AMP緩沖液 5 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.30 KU/L 吐溫-20 3 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5 mmol/L NADH 18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5KU/L 聚乙二醇-2000 15g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水。 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長405nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)反應(yīng)； 3、 檢測步驟 (a) 取180ul試劑R1與6μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 值ΔΑ = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中唾液酸(SA)的活性 計(jì)算出樣本中的唾液 酸的濃度。
[0017] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.30 KU/L 吐溫-20 3 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5 mmol/L NADH 18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5 KU/L 聚乙二醇-2000 15 g/L 苯甲酸鈉 0.1 g/L 其溶劑為純化水； 2、 全自動生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長340nm，副波長405nm; (c) 反應(yīng)時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)反應(yīng)； 3、 檢測步驟 (a) 取180ul試劑R1與6μ1待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60μ1試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 值ΔΑ = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中唾液酸(SA)的活性 計(jì)算出樣本中的唾液 酸的濃度。
[0018] 表1為實(shí)施例1所制得的測定唾液酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定唾液酸的 試劑盒分別對質(zhì)控品1進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的唾液酸的濃度為25.0 mg/dL，測 定結(jié)果見表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測定唾液酸的試劑盒對質(zhì)控品1的測定結(jié)果偏差較小，因 此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0019] 表2為實(shí)施例1所制得的測定唾液酸的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測定唾液酸的試劑 盒分別對質(zhì)控品2進(jìn)行測定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的唾液酸的濃度為46.0 mg/dL，測定結(jié) 果見表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測定唾液酸的試劑盒對質(zhì)控品2的測定結(jié)果偏差較小，因 此測定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0020] 表3為實(shí)施例3所制得的測定唾液酸的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測 定以及實(shí)施例4所制得的測定唾液酸的試劑盒對同一待測樣本進(jìn)行的多次反復(fù)測定，對所 得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下： 表3
由表3可知本發(fā)明所制得的測定唾液酸的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可知，實(shí) 施例3為最優(yōu)的選擇。
[0021] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定唾液酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組 分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定唾液酸的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑 R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: AMP緩沖液 20 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 5 KU/L 乳酸脫氫酶 0.10 KU/L 吐溫-20 9 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 20 mmol/L NADH 10 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 3.0KU/L 聚乙二醇-2000 8 g/L 苯甲酸鈉 1 g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: AMP緩沖液 5~35 mmol/L 神經(jīng)氨酸苷酶 2~8 KU/L 乳酸脫氫酶 0.01~0.30 KU/L 吐溫-20 3-15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: AMP緩沖液 5~35 mmol/L NADH 2~18 mmol/L 神經(jīng)氨酸醛縮酶 0.5~5.5 KU/L 聚乙二醇-2000 1~15 g/L 苯甲酸鈉 0.1~2 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值； (d )根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的唾液酸的濃度。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種測定唾液酸的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于:步驟(b)中，所述的待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:10到1:50之間。
【文檔編號】G01N1/38GK106092942SQ201610358111
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司