一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒及方法。該試劑盒包括試劑1：包括包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒；試劑2：包括包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒。采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)甘膽酸，可以容易地增強(qiáng)免疫濁度，放大檢測(cè)信號(hào)，具有無(wú)需特殊儀器、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)臨床快速、大流量的樣本測(cè)試，使甘膽酸成為臨床上常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目成為可能，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于物質(zhì)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒及方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘膽酸（化olyglycine，CG)是膽酸與甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸之一。CG正常 代謝途徑為腸-肝循環(huán)，由肝細(xì)胞合成，經(jīng)毛細(xì)膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進(jìn)入十二指 腸，幫助食物消化。95%膽酸在回腸末端重吸收，經(jīng)口靜脈再回肝臟，由肝細(xì)胞攝取再利用。 在血清中主要W蛋白結(jié)合形式存在，溢入體循環(huán)的總量小于1%。在正常情況下，外周血中 膽酸含量甚微，血清CG濃度穩(wěn)定在較低水平。
[0003] 當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時(shí)，肝 臟排泄膽酸發(fā)生障礙，而返流血液循環(huán)的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，目前用 RIA (radioimmunoassay放射免疫測(cè)定法）法測(cè)定血清甘膽酸（SCG)是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及其 肝膽系物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一。
[0004] 正常人血清甘膽酸含量為1. 3 + 0. 8mg/L，范圍可在0. 4~2. 98mg/L內(nèi)波動(dòng)，肝炎 診斷低限值為<3. 18mg/L。各類(lèi)肝炎、原發(fā)性肝癌、肝硬化患者血CG均明顯高于正常人，且 呈遞性增高；膽石癥伴黃痘患者膽管、膽囊排泄功能障礙可引起血清CG顯著升高；肝硬化、 梗阻性肝病、腸-肝循環(huán)障礙血清CG水平高于正常人。
[0005] 甘膽酸是妊娠晚期血清中最主要的膽汁酸組分。正常妊娠時(shí)孕婦血清CG水平隨 孕周逐步增高，至足月妊娠 CG值較非孕時(shí)增加30 %~60%。部分妊娠婦女血清CG值可出 現(xiàn)生理性升高，臨床上并沒(méi)有明顯的ICP癥狀（妊娠期肝內(nèi)膽汁渺積癥）。隨著CG值的升 高程度不同，對(duì)母嬰有著不同程度的損傷，且CG值越高危害越大。
[0006] 目前臨床應(yīng)用中，甘膽酸的測(cè)定方法主要包括RIA (放射免疫分析）方法和酶聯(lián)免 疫法等。上述方法的共同特點(diǎn)是需要特別的測(cè)定儀器，操作復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能應(yīng)用 于臨床大流量的自動(dòng)化分析，且價(jià)格昂貴。由于上述缺陷的制約，目前甘膽酸尚未成為臨床 檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目。
[0007] 在常見(jiàn)的采用乳膠微粒增強(qiáng)的免疫比濁方法中，測(cè)定血清甘膽酸均采用在Rl試 劑中加入免疫比濁促進(jìn)劑，在R2試劑中加入包被抗CG抗體乳膠顆粒的常規(guī)方法。眾所 周知，常規(guī)免疫比濁方法，對(duì)于檢測(cè)小分子抗原，很難達(dá)到臨床應(yīng)用所要求的準(zhǔn)確度和靈敏 度。目前公開(kāi)的文獻(xiàn)也均未出現(xiàn)明顯的提高反應(yīng)強(qiáng)度的專(zhuān)口技術(shù)方法。如此，目前臨床應(yīng) 用中，甘膽酸的檢測(cè)準(zhǔn)確度和抗干擾性能一直達(dá)不到廣泛應(yīng)用的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于為了克服現(xiàn)有的高壓液相色譜法和酶聯(lián)免疫法 需要特別的測(cè)定儀器，操作復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能應(yīng)用于臨床大流量的自動(dòng)化分析，且 價(jià)格昂貴；而若套用免疫比濁測(cè)定方法則甘膽酸的檢測(cè)準(zhǔn)確度低、抗干擾性能差的缺陷，提 供了一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒及方法。采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)甘膽酸，可W容 易地增強(qiáng)免疫濁度，放大檢測(cè)信號(hào)，具有無(wú)需特殊儀器、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且成本低廉的 優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)臨床快速、大流量的樣本測(cè)試，使甘膽酸成為臨床上常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目成為可能， 具有極高的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0009] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的：
[0010] 本發(fā)明提供了一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒，其包括：
[0011] 試劑1:包括包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒；
[0012] 試劑2 :包括包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒。
[0013] 較佳地，所述的試劑1包括包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒、緩沖液、免疫凝 集促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑和防腐劑；更佳地，所述的試劑1由包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆 粒、緩沖液、免疫凝集促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑和防腐劑組成。
[0014] 較佳地，所述的試劑2包括包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、緩沖液、穩(wěn) 定劑和防腐劑：更佳地，所述的試劑2由包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、緩沖液、 穩(wěn)定劑和防腐劑組成。
[0015] 其中，所述的抗甘膽酸單克隆抗體一般可通過(guò)商業(yè)化公司獲得，也可W通過(guò)將甘 膽酸-惰性載體偶聯(lián)物免疫小鼠，制備單抗所得；所述的惰性載體較佳地包括血藍(lán)蛋白 KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一種或多種；所述的抗甘膽酸單克隆抗體更佳 地為兔抗甘膽酸抗體，購(gòu)于日本Cosmo Bio Co. ,Ltd公司。
[0016] 其中，所述的甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物優(yōu)選是將甘膽酸與惰性載體通過(guò)化學(xué)交聯(lián) 劑進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)獲得；所述的惰性載體包括血藍(lán)蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白 BSA中的一種或多種；所述的化學(xué)交聯(lián)劑為邸AC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽）和/或Sulfo-NHS (N-徑基硫代班巧酷亞胺）。
[0017] 其中，試劑1中，所述的包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒較佳地通過(guò)下述步 驟制得：通過(guò)乳膠顆粒表面的化學(xué)基團(tuán)，如簇基、氨基、琉基等，采用化學(xué)交聯(lián)劑將抗甘膽酸 單克隆抗體結(jié)合到乳膠顆粒表面。本發(fā)明中采用的化學(xué)交聯(lián)方法，優(yōu)選采用兩步交聯(lián)法，W 確保懸浮緩沖液中沒(méi)有殘留的未結(jié)合的游離抗體，從而保證了試劑盒測(cè)定的準(zhǔn)確性。更佳 地，所述的包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒通過(guò)下述步驟制得：乳膠顆粒表面先經(jīng)過(guò) EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和Sulfo-N服(N-徑基硫代班巧酷 亞胺）活化，然后加入抗甘膽酸單克隆抗體，此時(shí)抗體的氨基端與活化后的乳膠顆粒產(chǎn)生 交聯(lián)反應(yīng)，即可；最佳地，所述的包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒通過(guò)下述步驟制得： 將乳膠顆粒加入到MES (2-(N-嗎嘟）乙橫酸）緩沖溶液中，攬拌條件下加入邸AC (1-(3-二 甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和Sulfo-NHS (N-徑基硫代班巧酷亞胺），室溫反 應(yīng)，離屯、除去上清液，加入含有抗甘膽酸單克隆抗體的pH 8. 3棚酸緩沖液，室溫包被，再加 入含甘氨酸的抑8. 3棚酸緩沖液，終止反應(yīng)，離屯、清洗，超聲分散，即得。
[001引其中，試劑2中，所述的包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒較佳地通過(guò)下 述步驟制得：通過(guò)乳膠顆粒表面的化學(xué)基團(tuán)，如簇基、氨基、琉基等，采用化學(xué)交聯(lián)劑將甘膽 酸-惰性載體偶聯(lián)物結(jié)合到乳膠顆粒表面。本發(fā)明中采用的化學(xué)交聯(lián)方法，優(yōu)選采用兩步 交聯(lián)法，W確保懸浮緩沖液中沒(méi)有殘留的未結(jié)合的游離抗原，從而保證了試劑盒測(cè)定的準(zhǔn) 確性。更佳地，所述的包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒通過(guò)下述步驟制得：乳膠顆 粒表面先經(jīng)過(guò)邸AC (I- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和Sulfo-N服(N-徑基 硫代班巧酷亞胺）活化，然后加入甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物，此時(shí)偶聯(lián)物的氨基端與活化后 的乳膠顆粒產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，即可。最佳地，所述的包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒 通過(guò)下述步驟制得：將乳膠顆粒加入到MES (2-(N-嗎嘟）乙橫酸）緩沖溶液中，攬拌條件下 加入邸AC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）和Sulfo-N服(N-徑基硫代班 巧酷亞胺），室溫反應(yīng)，離屯、除去上清液，加入含有甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的抑8. 3棚酸 緩沖液，室溫包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3棚酸緩沖液，終止反應(yīng)，離屯、清洗，超聲分散， 即得。
[0019] 其中，所述的乳膠顆?？蔀樵噭┖袡z測(cè)領(lǐng)域常規(guī)使用的各種乳膠顆粒，較佳地選 自粒徑為50~500nm (更佳地為100~300nm)、表面帶有一種化學(xué)交聯(lián)基團(tuán)（如氨基、簇 基、徑基、琉基、酷阱基、氯甲基）的聚苯乙締核殼結(jié)構(gòu)的球狀聚合物；所述的乳膠顆?？蔀?如化IyMicrospheres 公司的型號(hào)為 CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D 或 CB0267D 簇基 微球。
[0020] 其中，所述的乳膠顆粒的質(zhì)量體積濃度（w/v，g/ml)較佳地為0. 01%~0. 5%，更 佳地為0.05%~0.3%。
[0021] 其中，所述的緩沖液可為試劑盒檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)使用的各種緩沖液，所述的緩沖液 較佳地為3-(N-嗎嘟基）-丙橫酸緩沖液、3-(N-嗎嘟基）-2-徑基丙橫酸緩沖液、Tris緩 沖液、憐酸鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種；所述的緩沖液的濃度較佳地為10~ 300mmol/L，更佳地為30~lOOmmol/L ;所述的緩沖液的抑較佳地為6~9。
[0022] 其中，所述的免疫凝集促進(jìn)劑可為試劑盒檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)使用的各種免疫凝集促進(jìn) 劑，所述的免疫凝集促進(jìn)劑較佳地包括聚乙二醇（PEG,分子量2000~20000)、硫酸葡聚糖 和聚乙締化咯燒酬中的一種或多種；所述免疫凝集促進(jìn)劑的質(zhì)量體積濃度（w/v，g/ml)較 佳地為0. 1~7%。
[0023] 其中，所述的穩(wěn)定劑可為試劑盒檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)使用的各種穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑 較佳地選自20~300mmol/L甘氨酸、20~300mmol/L雙甘氨膚、0. 05~1 %牛血清白蛋白、 0. 05 ~1% 吐溫-20、0. 05 ~1% Triton X-100、10 ~300mmol/L 薦糖、10 ~300mmol/L 海 藻糖、10~300mmol/L甘露糖、0. 2~20mmol/L邸TA (乙二胺四乙酸）、0. 5 %~2 %氯化鋼 和1%~10%甘油中的兩種或兩種W上；所述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0024] 其中，所述的防腐劑可為試劑盒檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)使用的各種防腐劑，所述的防腐 劑較佳地選自疊氮鋼、Proclin-300中的一種或兩種，所述的防腐劑的質(zhì)量百分比濃度為 0. 1%~1%。
[002引較佳地，所述的試劑1的組成為：150mmol/L 3- (N-嗎嘟基）-2-徑基丙橫酸緩沖 液抑6. 90、0.0 l %包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒、0. 9 %氯化鋼、0. 5%吐溫-20、 1%陽(yáng)G-6000、2mmol/L邸TA、100mmol/L薦糖、20mmol/L海藻糖和0. 2%疊氮鋼；所述的百 分比為質(zhì)量百分比。
[0026] 較佳地，所述的試劑2的組成為：1. 5%包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、 30臟〇1/1甘氨酸緩沖液抑7.6、0.3%吐溫-20、0.15%?'〇(：1111-300、200111111〇1/1薦糖和 20mmol/L海藻糖；所述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0027] 其中，所述的測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒優(yōu)選還包括試劑盒校準(zhǔn)品和試劑盒質(zhì) 控品，所述的試劑盒校準(zhǔn)品和試劑盒質(zhì)控品可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑盒校準(zhǔn)品和試 劑盒質(zhì)控品。較佳地，所述的試劑盒校準(zhǔn)品組成為：40mg/L或60mg/L甘膽酸、50mmo 1 /L Tris緩沖液抑8. 2、0. 2%牛血清白蛋白、lOOmmol/L甘露糖醇、2mmol/L邸TA和0. 15% Proclin-SOO ;所述的試劑盒質(zhì)控品組成為：3mg/L或lOmg/L甘膽酸、50mmol/L Tris緩沖液 pH 8. 2、0. 5%牛血清白蛋白、lOOmmol/L 甘露糖醇、2mmol/L EDTA 和 0. 15% Proclin-300 ; 所述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0028] 本發(fā)明中，所述的試劑盒質(zhì)控品可W用于隨時(shí)檢測(cè)試劑盒反應(yīng)體系的可靠性。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種測(cè)定甘膽酸濃度的方法，其包括下述步驟：將待測(cè)樣品首先 與試劑1混合，反應(yīng)巧加入試劑2后，試劑1中包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒與試 劑2中包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒的反應(yīng)濁度下降；通過(guò)測(cè)定該反應(yīng)濁度下 降的程度，與試劑盒校準(zhǔn)品的反應(yīng)濁度對(duì)比，即可計(jì)算出待測(cè)樣品中甘膽酸的濃度。
[0030] 較佳地，所述的測(cè)定甘膽酸濃度的方法是W非疾病診斷或治療目的的測(cè)定方法。
[0031] 本發(fā)明的構(gòu)思是在試劑1中采用單株單克隆抗體，將其化學(xué)交聯(lián)在乳膠顆粒載體 上，使該載體具有多點(diǎn)位結(jié)合抗原的能力，當(dāng)與試劑2中同樣交聯(lián)在乳膠顆粒上的多個(gè)抗 原結(jié)合時(shí)，能形成不斷疊加的凝聚物，從而大大地提高了運(yùn)種抗原抗體反應(yīng)的濁度。當(dāng)被測(cè) 樣品加入試劑1時(shí)，首先與試劑1乳膠顆粒載體上的單抗反應(yīng)，掩蔽掉一定量的抗體結(jié)合 能力，因此，加入試劑2后，形成的濁度相應(yīng)降低，因此可W通過(guò)測(cè)定該反應(yīng)濁度下降的程 度，與試劑盒中校準(zhǔn)品的反應(yīng)濁度對(duì)比，即可計(jì)算出樣品中甘膽酸的濃度。該濁度的檢測(cè)能 夠應(yīng)用于目前臨床廣泛使用的自動(dòng)生化分析儀，從而達(dá)到廣泛、快速、大批量規(guī)模應(yīng)用的特 點(diǎn)。
[0032] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0033] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0034] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0035] (1)本發(fā)明的特點(diǎn)之一在于，提供了一種采用一株單克隆抗體進(jìn)行多聚反應(yīng)的免 疫比濁試劑方案，為體內(nèi)小分子抗原的全自動(dòng)檢測(cè)提供了一個(gè)實(shí)用方法，可W提高反應(yīng)靈 敏度。
[0036] (2)本發(fā)明優(yōu)選采用兩步交聯(lián)法，不僅有效排除了非特異性交叉反應(yīng)，而且確保懸 浮液中沒(méi)有殘留的未結(jié)合的游離抗原或抗體，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
[0037] (3)本發(fā)明的另一特點(diǎn)之一在于，提供了一種采用一株單克隆抗體包被在乳膠顆 粒表面的免疫比濁試劑方案，從而大大提高了檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0039] 本發(fā)明所用試劑和原料均能很容易地從相關(guān)商業(yè)公司購(gòu)得。
[0040] 下述實(shí)施例中無(wú)特別說(shuō)明，百分比均是指質(zhì)量百分比。
[00川實(shí)施例1
[0042] (I)甘膽酸-卵清蛋白偶聯(lián)物的制備
[004引在1. 0血25mmol/L抑為6. 1的MES (2-嗎嘟乙橫酸）緩沖液中加入IOmg卵清蛋 白，快速攬拌，加入甘膽酸，緩慢滴入60mmol/L EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽）溶液300 y L，快速攬拌反應(yīng)2小時(shí)，加入2. 5血50mmol/L抑為8. 2的Tris緩 沖液終止反應(yīng)30分鐘。用抑為6. 1的巧樣酸緩沖液4°C透析備用。
[0044] 似試劑1的制備
[0045] 取濃度為10%、表面帶有簇基、直徑100皿的乳膠顆粒（Polymicrospheres公司 的CB0100E產(chǎn)品）2血，加入到5血20mM P冊(cè).1的MES緩沖溶液中，邊攬拌，邊加入300mg Sul化-N服和30mg EDAC，室溫反應(yīng)20分鐘，離屯、去上清，然后加入含有30mg抗CG單克隆抗 體的抑8. 350mM棚酸緩沖液35血，室溫包被6小時(shí)。加入5血含50mM甘氨酸的上述棚酸 緩沖液，作用30分鐘終止反應(yīng)。用Rl緩沖液離屯、清洗3次，去除未包被的游離抗體，超聲分 散。最后用Rl緩沖液重懸制成含0. 2%抗CG單克隆抗體包被的乳膠顆粒Rl試劑。Rl緩 沖液含 150ml MOPSO P冊(cè).90、0. 9%氯化鋼、0. 5%吐溫-20、1% 陽(yáng)G-6000、2mM 邸TAUOOmM 薦糖、2〇1111海藻糖、0.2%疊氮鋼。
[004引 做試劑2的制備
[0047] 取濃度為10%、表面帶有簇基、直徑250nm的乳膠顆粒（Polymicrospheres公司 的CB0267D產(chǎn)品）2血，加入到5血20mM P冊(cè).1的MES緩沖溶液中，邊攬拌，邊加入300mg Sul化-N服和30mg EDAC，室溫反應(yīng)20分鐘，離屯、去上清，然后加入含有50mg步驟（1)制得 的甘膽酸-卵清蛋白偶聯(lián)物的抑8. 3 50mM棚酸緩沖液35mL，室溫包被6小時(shí)。加入5血含 50mM甘氨酸的上述棚酸緩沖液，作用30分鐘終止反應(yīng)。用R2緩沖液離屯、清洗3次，去除未 包被的游離甘膽酸-卵清蛋白偶聯(lián)物，超聲分散。最后用R2緩沖液重懸制成含0. 05%甘 膽酸-卵清蛋白偶聯(lián)物包被的乳膠顆粒R2試劑。R2緩沖液含30mM甘氨酸緩沖液抑7. 3、 0. 3%吐溫-20、0. 15% Proclin-300、200mM 薦糖、20mM 海藻糖。
[004引 （4)甘膽酸校準(zhǔn)品的制備
[0049] 在50mM Tris緩沖液中依次加入0. 2%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、2mM邸TA、 0. 15% Proclin-300和40mg/L甘膽酸；用弱鹽酸邊攬拌、邊調(diào)節(jié)抑至8. 2。
[0050] (5)甘膽酸質(zhì)控品的制備
[005。 在50mM Tris緩沖液中依次加入0. 2%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、2mM邸TA、 0. 15% Proclin-SOO和3mg/L或lOmg/L甘膽酸；用弱鹽酸邊攬拌、邊調(diào)節(jié)抑至8. 2。
[00閲 （6)試劑性能檢測(cè)
[005引 1、在日立7180型全自動(dòng)臨床生化分析儀上，采用下表中的測(cè)定參數(shù)，
[0054] 檢測(cè)試劑的準(zhǔn)確度和精密度性能：
[00 巧]
[0056] 2、試劑質(zhì)控品檢測(cè)及其準(zhǔn)確度和精密度：
[0057]
[005引結(jié)果顯示試劑盒反應(yīng)體系的具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，可靠性較好；并且采用 該試劑盒多次檢測(cè)結(jié)果誤差很小，說(shuō)明該試劑盒檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性。
[0059] 3、用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果如下，說(shuō)明試劑盒具有應(yīng)用價(jià)值：
[0060]
[0061]
[00的]實(shí)施例2
[0063] (1)甘膽酸-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物的制備
[0064] 在1. 0血20mmol/L抑為6. 1的MES (2-嗎嘟乙橫酸）緩沖液中加入IOmg血藍(lán)蛋 白，快速攬拌，加入甘膽酸，緩慢滴入50mmol/L EDAC (1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞 胺鹽酸鹽）溶液300 y L，快速攬拌反應(yīng)2小時(shí)，加入2. 5血50mmol/L抑為8. 2的Tris緩 沖液終止反應(yīng)30分鐘。用抑為6. 1的MES緩沖液4°C透析備用。
[0065] 似試劑1的制備
[0066] 取濃度為10%、表面帶有簇基的化Iymicrospheres公司CB0213E乳膠顆粒2血， 加入到5mL 20mM P冊(cè).1的MES緩沖溶液中，邊攬拌，邊加入300mg Sulfo-N服和30mg EDAC， 室溫反應(yīng)20分鐘，離屯、去上清，然后加入含有30mg抗CG單克隆抗體的抑8. 350mM棚酸緩 沖液35mU室溫包被6小時(shí)。加入5mL含50mM甘氨酸的上述棚酸緩沖液，作用30分鐘終 止反應(yīng)。用Rl緩沖液離屯、清洗3次，去除未包被的游離抗體，超聲分散。最后用Rl緩沖 液重懸制成含0. 2%抗CG單克隆抗體包被的乳膠顆粒Rl試劑。Rl緩沖液含150mM MOPSO P 冊(cè).90、0. 9% 氯化鋼、0. 5% 吐溫-20、1% 陽(yáng) G-6000、2mM EDTA、100mM 薦糖、20mM 海藻糖、 0. 2 %疊氮鋼。
[0067] 做試劑2的制備
[0068] 取濃度為10%、表面帶有簇基的化Iymicrospheres公司CB0104D乳膠顆粒2血， 加入到5mL 20mM P冊(cè).I的MES緩沖溶液中，邊攬拌，邊加入350mg Sulfo-N服和35mg EDAC， 室溫反應(yīng)20分鐘，離屯、去上清，然后加入含有50mg實(shí)施例1制得的甘膽酸-血藍(lán)蛋白偶聯(lián) 物的抑8. 1 50mM棚酸緩沖液35血，室溫包被6小時(shí)。加入5血含50mM甘氨酸的上述棚酸 緩沖液，作用30分鐘終止反應(yīng)。用R2緩沖液離屯、清洗3次，去除未包被的游離甘膽酸-血 藍(lán)蛋白偶聯(lián)物，超聲分散。最后用R2緩沖液重懸制成含0. 05%甘膽酸-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物 包被的乳膠顆粒R2試劑。R2緩沖液含30mM甘氨酸緩沖液抑7. 3、0. 3%吐溫-20、0. 15 % Proc 1 in-300、200mM 薦糖、20mM 海藻糖。
[0069] (4)甘膽酸校準(zhǔn)品的制備
[0070] 在50mM Tris緩沖液中依次加入0. 5%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、5mM邸TA、 0. 15% Proclin-300和60mg/L甘膽酸；用弱鹽酸邊攬拌、邊調(diào)節(jié)抑至8. 2。
[0071] (5)甘膽酸質(zhì)控品的制備
[007引在50mM Tris緩沖液中依次加入0. 3%牛血清白蛋白、IOOmM甘露糖醇、5mM邸TA、 0. 15% Proclin-SOO和3mg/L或lOmg/L甘膽酸；用弱鹽酸邊攬拌、邊調(diào)節(jié)抑至8. 2。
[007引 （6)試劑性能檢測(cè)
[0074] 1、在日立7180型全自動(dòng)臨床生化分析儀上，采用下表中的測(cè)定參數(shù)，檢測(cè)試劑的 準(zhǔn)確度和精密度性能：
[00 巧]
[007引 結(jié)果顯示試刑盒反應(yīng)體《的具巧艮
巧的準(zhǔn)倘巧和精鑿巧，口j靠性較好；并且采用 該試劑盒多次檢測(cè)結(jié)果誤差很小，說(shuō)明該試劑盒檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性。
[0079] 3、用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果如下，說(shuō)明試劑盒具有應(yīng)用價(jià)值：
[0080]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒，其包括： 試劑1 :包括包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒； 試劑2 :包括包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑1包括包被抗甘膽酸單克隆抗 體的乳膠顆粒、緩沖液、免疫凝集促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑和防腐劑；較佳地，所述的試劑1由包被抗 甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒、緩沖液、免疫凝集促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑和防腐劑組成； 和/或，所述的試劑2包括包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、緩沖液、穩(wěn)定劑 和防腐劑：較佳地，所述的試劑2由包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、緩沖液、穩(wěn)定 劑和防腐劑組成。3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗甘膽酸單克隆抗體為兔抗甘膽 酸抗體； 所述的甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物是將甘膽酸與惰性載體通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)交 聯(lián)獲得；所述的惰性載體包括血藍(lán)蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一種或 多種；所述的化學(xué)交聯(lián)劑為EDAC和/或Sulfo-NHS。4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑1中，所述的包被抗甘膽酸單克隆抗 體的乳膠顆粒通過(guò)下述步驟制得：乳膠顆粒表面先經(jīng)過(guò)EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入 抗甘膽酸單克隆抗體，抗體的氨基端與活化后的乳膠顆粒產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，即得；所述的包被 抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒較佳地通過(guò)下述步驟制得：將乳膠顆粒加入到MES緩沖溶 液中，攪拌條件下加入EDAC和Sulfo-NHS，室溫反應(yīng)，離心除去上清液，加入含有抗甘膽酸 單克隆抗體的pH 8. 3硼酸緩沖液，室溫包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3硼酸緩沖液，終止 反應(yīng)，離心清洗，超聲分散，即得； 和/或，試劑2中，所述的包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒通過(guò)下述步驟制 得：乳膠顆粒表面先經(jīng)過(guò)EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物，偶 聯(lián)物的氨基端與活化后的乳膠顆粒產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，即得；所述的包被甘膽酸-惰性載體偶 聯(lián)物的乳膠顆粒較佳地通過(guò)下述步驟制得：將乳膠顆粒加入到MES緩沖溶液中，攪拌條件 下加入EDAC和Sulfo-NHS，室溫反應(yīng)，離心除去上清液，加入含有甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物 的pH 8. 3硼酸緩沖液，室溫包被，再加入含甘氨酸的pH 8. 3硼酸緩沖液，終止反應(yīng)，離心清 洗，超聲分散，即得； 試劑1和試劑2中，所述的乳膠顆粒選自粒徑為50~500nm、表面帶有化學(xué)交聯(lián)基團(tuán)的 聚苯乙稀核殼結(jié)構(gòu)的球狀聚合物；所述的乳膠顆粒較佳地為PolyMicrospheres公司的型 號(hào)為CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D或CB0267D羧基微球；所述的乳膠顆粒的質(zhì)量體 積濃度較佳地為〇· 01 %~5 %，更佳地為0· 05 %~0· 3 %。5. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑1和試劑2中，所述的緩沖液為 3-(N-嗎啉基）-丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸緩沖液、Tris緩沖液、磷酸 鹽緩沖液和甘氨酸緩沖液中的一種或多種；所述的緩沖液的濃度為10~300mmol/L，較佳 地為30~100mmol/L ;所述的緩沖液的pH為6~9 ; 所述的免疫凝集促進(jìn)劑包括聚乙二醇、硫酸葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多 種；所述免疫凝集促進(jìn)劑的質(zhì)量體積濃度為〇. 1~7%。6. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑1和試劑2中，所述的穩(wěn)定劑選自 20~300mmol/L甘氛酸、20~300mmol/L雙甘氛妝、0. 05~1 %牛血清白蛋白、0. 05~1 % 吐溫 _20、0· 05 ~1 % Triton X-100、10 ~300mmol/L 鹿糖、10 ~300mmol/L 海藻糖、10 ~ 300mmol/L甘露糖、0· 2~20mmol/L EDTA、0. 5%~2%氯化鈉和1%~10%甘油中的兩種 或兩種以上；所述的百分比為質(zhì)量百分比； 試劑1和試劑2中，所述的防腐劑選自疊氮鈉、Proclin-300中的一種或兩種，所述的 防腐劑的質(zhì)量百分比濃度為〇. 1%~1%。7. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑1的組成為：150mmol/L 3-(N-嗎啉基）-2-羥基丙磺酸緩沖液pH 6. 90、0. 01 %包被抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆 粒、0· 9%氯化鈉、0· 5%吐溫-20、1 % PEG-6000、2mmol/LEDTA、100mmol/L蔗糖、20mmol/L 海 藻糖和0. 2%疊氮鈉；所述的百分比為質(zhì)量百分比。8. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑2的組成為：1. 5 %包被甘膽 酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒、30111111〇1/1甘氨酸緩沖液？!17.6、0.3%吐溫-20、0.15% Proclin-300、200mmol/L鹿糖和20mmol/L海藻糖；所述的百分比為質(zhì)量百分比。9. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的測(cè)定甘膽酸濃度的試劑盒還 包括試劑盒校準(zhǔn)品和試劑盒質(zhì)控品，所述的試劑盒校準(zhǔn)品組成為：40mg/L或60mg/L甘膽 酸、50mmol/L Tris緩沖液pH 8. 2、0. 2%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA 和0· 15% Proclin-300 ;所述的試劑盒質(zhì)控品組成為：3mg/L或10mg/L甘膽酸、50mmol/L Tris緩沖液pH 8. 2、0. 5%牛血清白蛋白、100mmol/L甘露糖醇、2mmol/L EDTA和0. 15% Procl in-300 ;所述的百分比為質(zhì)量百分比。10. -種測(cè)定甘膽酸濃度的方法，其包括下述步驟：將待測(cè)樣品首先與權(quán)利要求1~9 中任一項(xiàng)的試劑1混合，反應(yīng)；再加入權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)的試劑2后，試劑1中包被 抗甘膽酸單克隆抗體的乳膠顆粒與試劑2中包被甘膽酸-惰性載體偶聯(lián)物的乳膠顆粒的反 應(yīng)濁度下降；通過(guò)測(cè)定該反應(yīng)濁度下降的程度，與試劑盒校準(zhǔn)品的反應(yīng)濁度對(duì)比，即可計(jì)算 出待測(cè)樣品中甘膽酸的濃度；較佳地，所述的測(cè)定甘膽酸濃度的方法是以非疾病診斷或治 療目的的測(cè)定方法。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105988000SQ201510093395
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年3月2日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】上海高尼企業(yè)管理服務(wù)有限公司