專利名稱：果糖濃度的測定方法及果糖診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領(lǐng)域內(nèi)對果糖濃度的檢測，尤其涉及利用酶比色法測定果糖濃度的方法，以及由此制得的果糖診斷試劑盒，屬于果糖濃度分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
國家相關(guān)部門于日前發(fā)布實(shí)施了《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒定》標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)糠氨酸和果糖兩種特定物質(zhì)在液態(tài)乳中的含量，來判定是否添加了“復(fù)原乳”，乳中果糖含量(mg/L)與糠氨酸含量(每100g蛋白質(zhì)所含毫克數(shù))比值小于2時，則可判定添加了復(fù)原乳。
摻雜使假乳往往口感較差，有些不法奶商常常在摻假奶中加入價格便宜的白砂糖來改善鮮奶口感。測蔗糖就是為了遏制部分奶商的這種不法行為。測蔗糖的方法之一是先將蔗糖在強(qiáng)酸性條件加熱分解生成葡萄糖和果糖，然后再測果糖含量。果糖為分析精液質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測定果糖濃度的方法，以及應(yīng)用該方法配制而成的果糖診斷試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，一種酶比色法測定果糖濃度的方法，利用果糖脫氫酶為作用酶和顯色酶，對待測樣品中的果糖進(jìn)行檢測，采用以下步驟進(jìn)行首先，將測定的樣品與含有輔酶、果糖脫氫酶的試劑混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，
然后，將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出果糖的濃度大小。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明果糖診斷試劑盒可以是單劑，由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，果糖脫氫酶1000～80000U/L。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將以上單劑中的各種成分進(jìn)行組合配制成雙劑，比如

雙劑的配方不僅僅限于上述表中所列，其中試劑I的成分輔酶可以放在試劑II；試劑II中的果糖脫氫酶也可以放到試劑I，如此可以形成多種配方，不再一一列舉。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
此外，為減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I/試劑II當(dāng)中通常加入穩(wěn)定劑，濃度在1～4000 mmol/L或0.1％～100％體積比范圍之內(nèi)。
無論是單劑還是雙劑，輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
用作穩(wěn)定劑的物質(zhì)可以是硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一種。
研究表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑還是雙劑，如下配方成分關(guān)系的診斷/檢測試劑盒較為理想，也是本發(fā)明的優(yōu)選方案緩沖液 100mmol/L，穩(wěn)定劑 500mmol/L輔酶3mmol/L，果糖脫氫酶 8000U/L。
利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技術(shù)，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定果糖濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的果糖診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行果糖濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要表現(xiàn)在(1)本發(fā)明完全利用酶比色法測定果糖濃度，測試結(jié)果準(zhǔn)確；(2)參與反應(yīng)的成分都是外加的，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試過程精確度高；(3)該方法簡便、易操作，可快速得到檢測結(jié)果，而且反應(yīng)是在緩沖液條件下進(jìn)行，不會污染環(huán)境；(4)該方法在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上便可快速檢測，不需要特殊或額外儀器，測試成本低廉，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用；(5)應(yīng)用本發(fā)明提供的測定方法可以制成液態(tài)試劑、干粉試劑等多種形式的試劑，用于測定各種樣品中果糖濃度的大小；(6)本發(fā)明提供的液態(tài)果糖診斷/檢測試劑盒，穩(wěn)定性好，很好地保證了應(yīng)用測試效果。配成雙劑以后，能夠進(jìn)一步降低各種成分之間的交叉影響，檢測結(jié)果更加可信，試劑更為穩(wěn)定，可以長時間儲存。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一種酶比色法測定果糖濃度的方法及果糖診斷試劑盒，運(yùn)用果糖脫氫酶(Fructose dehydrogenase；EC 1.1.1.124；EC 1.1.99.11)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。果糖脫氫酶酶解果糖并將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，測算果糖的濃度大小。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。這些例子僅是一些應(yīng)用范例，不能理解為對本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的一種限制。
實(shí)施例一(單劑)按以下成分和用量配制果糖診斷試劑盒三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，甘油 500mmol/L，NADP+3mmol/L，果糖脫氫酶 8000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測果糖樣品與試劑的體積比例為1∶25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出果糖的濃度大小。
實(shí)施例二(雙劑)按以下成分和用量配制果糖診斷試劑盒試劑I——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L，硫酸銨 50mmol/L，NAD+3mmol/L；試劑II——三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L乙二醇 500mmol/L果糖脫氫酶 8000U/L；試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測果糖樣品與試劑I、試劑II的體積比例為2∶20∶5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出果糖的濃度大小。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好、不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.果糖濃度的測定方法，其特征在于包括以下步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出果糖的濃度大小。
2.果糖診斷試劑盒，盒中試劑由以下成分組成緩沖液20～500mmol/L，穩(wěn)定劑1～4000mmol/L，輔酶 1～6mmol/L，果糖脫氫酶1000～80000U/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為硫酸銨、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一種。
4.權(quán)利要求2或3所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑或雙劑。
5.權(quán)利要求2或3所述的果糖診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒為干粉試劑盒或液體試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶比色法測定果糖濃度的方法及果糖診斷試劑盒，運(yùn)用果糖脫氫酶酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法，果糖脫氫酶酶解果糖并將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，測算果糖的濃度大小。該方法特異性高，不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染，測試結(jié)果精確、準(zhǔn)確性好。將診斷試劑盒制成雙劑可減少各成分的交叉影響，保持試劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/00GK101082573SQ20071002476
公開日2007年12月5日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司