專利名稱：嵌段酶－探針復合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用酶標記探針的技術。如此產(chǎn)生的嵌段酶-探針復合物廣泛用于采用免疫反應的免疫檢測，如酶免疫檢測、免疫組化等。
背景技術：
在免疫學檢測或測定方法中通常已廣泛使用用酶標記探針的酶標探針。例如，用辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶等標記的探針可用于免疫組化和酶免疫測定的檢測步驟。
免疫組化和酶免疫測定已經(jīng)長期廣泛用作在活體中檢測自身抗原或外來抗原的方法。由于這些采用免疫反應的檢測方法具有高特異性和靈敏度，可無需分離而檢測體內(nèi)的少量物質(zhì)。然而，許多物質(zhì)存在于體內(nèi)的量非常少，以致于普通的免疫組化和酶免疫測定不能檢測，已進行了一些研究以發(fā)現(xiàn)提高檢測方法靈敏度的方法以檢測這些物質(zhì)。
例如，健康人血清中腫瘤標記物如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白的濃度為5-20ng/ml。然而，健康個體血清中人胃泌素釋放肽前體(ProGRP)的濃度約為14 pg/ml，需要高1000倍的靈敏度以檢測ProGRP。此外，對于外來抗原，例如丙肝病毒，在血液中的量很小，因此需要高靈敏度的抗原檢測方法。為了檢測該抗原，需要可檢測100-1000個拷貝的病毒RNA和約0.03-0.3 pg/ml蛋白質(zhì)濃度的靈敏度水平。
為提高免疫檢測方法的靈敏度以檢測以這樣的微量存在于體內(nèi)的抗原或物質(zhì)，已經(jīng)進行了多種努力。Ishikawa等(非專利文獻1)詳細描述了對提高酶免疫檢測靈敏度的研究。影響酶免疫檢測靈敏度的因素包括檢測系統(tǒng)類型、標記的檢測靈敏度、標記方法的類型、免疫反應時間以及抗原和抗體間的親和力。此外，影響用夾心法測定抗原的靈敏度提高的條件包括抗體與固相連接的條件；抗原反應效率；酶標抗體的反應效率；標記抗體與固相的非特異性吸附的降低；標記抗體的添加量；免疫反應時間；溫度、pH、離子強度和免疫反應緩沖液的選擇；立體化學構型和抗原決定基團的數(shù)量。
除了上述研究以外，為了提高酶免疫檢測的靈敏度，人們努力在檢測步驟中在酶和抗體的交聯(lián)方面改進標記方法。已知制備標記抗體的各種方法，具體地說，Ishikawa等報道的制備標記抗體的方法已經(jīng)廣泛應用于普通診斷試劑。在通常所述方法中，一至幾個酶主要結(jié)合于抗體(在IgG的情況下，分子量約為150,000，在Fab’的情況下，分子量約為46,000)，例如其中三個辣根過氧化物酶(HRP)(分子量40,000)分子與一個IgG分子結(jié)合在一起的復合物的總分子量為40,000×3+150,000＝270,000。同時，其中三個堿性磷酸酶(ALP)分子(分子量100,000)與一個IgG分子結(jié)合在一起的復合物的總分子量為100,000×3+150,000＝450,000。然而，Ishikawa等的描述顯示，優(yōu)選通過以1個分子∶1個分子的比例將抗體結(jié)合于酶，尤其是采用去除Fc部分后的Fab’部分，實現(xiàn)靈敏度最高的測定，并開發(fā)了一種將一個抗體分子共價連接于一個酶分子方法(非專利文件2)。在酶與抗體1∶1結(jié)合的抗體酶標記法的情況下，例如共價連接的一個HRP分子和1個Fab’分子的復合物的總分子量為40,000+46,000＝86,000。通常，主要采用總分子量為200,000或更小的酶標記復合物。
為了開發(fā)高靈敏度的免疫檢測方法，以各種方式試驗了通過增加步驟以增強信號。例如，采用生物素和抗生物素蛋白的高親和力，主要將幾個生物素分子引入第二抗體，生物素化的第二抗體與待分析物質(zhì)反應后，去除過量的生物素化第二抗體。然后加入抗生物素蛋白-酶，形成生物素化第二抗體-抗生物素蛋白-酶復合物，并通過增加連接于第二抗體的酶分子數(shù)提高靈敏度。可以用抗生物素蛋白-生物素-酶復合物替代抗生物素蛋白-酶。同時，Butler等描述了作為過氧化物酶-抗過氧化物酶抗體的抗體-酶復合物(非專利文獻3)。Bobrow等將過氧化物酶標記的第二抗體與待分析物質(zhì)進行反應，并在去除過量過氧化物酶標記的第二抗體后，加入生物素-酪胺(tyramide)，使自由基化的生物素-酪胺與過氧化物酶標記的第二抗體周圍的封閉蛋白結(jié)合，并在洗滌后用過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白放大酶信號(非專利文獻4)。然而，這些方法都由缺點，如增加步驟數(shù)量和測定時間。
已經(jīng)報道了一種使酶結(jié)合于某種載體，并然后使抗體結(jié)合于酶聯(lián)載體以增加結(jié)合于抗體的酶分子數(shù)量的方法，并且按照這一方法，可以最少步驟提高靈敏度(專利文獻1)。在此方法中，將馬來酰亞胺基或巰基(SH)引入具有氨基的載體中，并將一種酶酶連接于所述載體。將馬來酰亞胺基引入抗體結(jié)合載體所留有的至少一個氨基上。由于在這種方法中抗體和酶通過載體連接，可以看出與將酶和抗體直接連接的方法相比，可連接數(shù)量更多的酶分子，并因此提高靈敏度。然而，所述發(fā)明人提到載體的分子量適合為5,000-500,000，優(yōu)選10,000-300,000。在這種情況下，例如，將辣根過氧化物酶用作所述酶時，分子量約為40,000。即使載體的分子量為500,000，能夠與分子量為500,000的分子結(jié)合的分子量為40,000的分子數(shù)量在物理上和空間上受限是正常的，因此限制了能夠結(jié)合于載體的酶分子的數(shù)量。即，當所述載體與一種酶和一種抗體結(jié)合時，載體上的官能團必須為酶和抗體所共享，酶分子數(shù)量減少且信號會被降低。當更多酶分子結(jié)合于所述載體時，用于抗體結(jié)合的空間會更小，并且與抗原的反應能力會降低。這意味著，盡管抗體和酶盡可能結(jié)合于同一載體可能會更好，根據(jù)大分子的制備過程，傾向于發(fā)生聚集和沉淀，引起導致靈敏度降低的更高的檢測背景。
專利文獻1日本專利申請?zhí)亻_號(KOKAI)2000-88850非專利文獻1超高靈敏度的酶免疫檢測方法(Ultra High Sensitive EnzymeImmunoassay Method)，Eiji Ishikawa，1993，Japan Scientific Societies Press非專利文獻2Imagawa等，J.Appl. Biochem.第4卷；400，1982非專利文獻3Butler(1981)，Methods Enzomol.，第73卷；482-523非專利文獻4Bobrow(1981)，J.Immunol. Methods，125，279-285發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題本發(fā)明發(fā)明人試驗性地按照上述專利申請所述制備方法制備了酶標探針，并將其應用于需要高靈敏度的ProGRP和HCV抗原檢測系統(tǒng)。然而，在測定微量生物物質(zhì)的檢測系統(tǒng)中，即使采用所述靈敏度高于常規(guī)探針的酶標探針，也不一定能獲得足夠的靈敏度。因此，本發(fā)明解決的問題是提供一種高度靈敏的酶標探針，該探針可用于高度靈敏的檢測系統(tǒng)。
解決問題的方法本發(fā)明人進行研究以獲得一種高度靈敏的酶標探針。結(jié)果是，本發(fā)明人產(chǎn)生了一種嵌段復合物，其中兩個或多個作為載體的分子通過與所述載體結(jié)合的酶連接起來，并且通過使探針結(jié)合于此嵌段復合物成功實現(xiàn)了所述目標，即高度靈敏的嵌段酶-探針復合物。
即，本發(fā)明是(1)一種嵌段酶-探針復合物，其中探針分子是與作為載體的兩個或多個分子量為20,000-4,000,000的分子通過酶連接起來的復合物相偶聯(lián)。
(2)如(1)所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述載體和所述酶分子通過該載體上的官能團和通過氧化該酶分子中的糖鏈形成的醛基結(jié)合。
(3)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述載體是選自下組的一種或多種載體葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍蛋白、聚賴氨酸、多肽和DNA。
(4)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述酶是選自下組的一種或多種酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶和螢光素酶。
(5)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述探針是選自下組的一種或多種探針抗體分子或其功能片段、蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、受體和抗生物素蛋白。
(6)如(1)-(5)中任一項所述的嵌段酶-探針復合物，其中兩種或多種探針偶聯(lián)。
(7)如(5)或(6)所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述抗體分子或其功能片段是選自下組的一種或多種抗-HCV核心抗原抗體、抗胃泌素釋放肽前體抗體和它們的功能片段。
(8)如(1)-(7)中任一項所述的嵌段酶-探針復合物，其中所述嵌段酶-探針復合物的分子量為440,000或更高。
(9)包含(1)-(8)中任一項所述的嵌段酶-探針復合物的免疫檢測試劑盒或核酸檢測試劑。
(10)一種產(chǎn)生(1)-(8)中任一項所述的嵌段酶-探針復合物的方法，所述方法包括以下步驟通過將分子量為20,000-4,000,000的載體與酶結(jié)合形成嵌段物；和將探針偶聯(lián)于所述嵌段物。
(11)如(10)所述的方法，其中通過所述載體與所述酶分子以載體∶酶＝1∶0.1-1∶20的重量比反應形成所述嵌段物。
此外，按照本發(fā)明(1)所述分子量為20,000-4,000,000的作為載體的兩個或多個分子的連接包括不由酶介導的連接。例如，可以由具有官能團的接頭或蛋白介導。此外，本發(fā)明包括嵌段酶-探針復合物，其中載體、酶和探針分別通過具有官能團的接頭分子結(jié)合。即，本發(fā)明是嵌段酶-探針復合物，其中載體通過酶或接頭互相結(jié)合，酶和探針結(jié)合于該分子，因此該復合物的一個分子中含有許多酶分子或探針分子。
可使酶結(jié)合于載體形成嵌段物，并使探針分子結(jié)合于此嵌段物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的嵌段酶-探針復合物。也可使酶和探針結(jié)合于載體形成偶聯(lián)物、然后將該偶聯(lián)物互相連接形成嵌段復合物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的嵌段酶-探針復合物。
在本發(fā)明中，可通過酶連接載體分子增加分子量，從而使較多的酶分子或探針與所述嵌段物結(jié)合。另一方面，由于探針結(jié)合于嵌段物表面，嵌段酶-探針復合物中很難發(fā)生位阻現(xiàn)象，因此產(chǎn)生復合物時可以不考慮探針分子的大小。對于嵌段酶-探針復合物的最終產(chǎn)物，分子量為440,000或更高的嵌段酶-探針復合物具有高效能，而且分子量為668,000或更高的嵌段酶-探針復合物具有較高靈敏度。原則上，嵌段酶-探針復合物的分子量越大，一個復合物分子上結(jié)合的酶分子越多，則靈敏度越高?？砂凑毡景l(fā)明所述方法產(chǎn)生具有大分子量的嵌段酶-探針復合物，并可采用諸如凝膠過濾等方法選擇具有較大分子量的嵌段酶-探針復合物。
雖然取決于所采用的載體、酶和探針，嵌段復合物形成后分子量可能略有不同，但任何分子量都可接受，只要嵌段酶-探針復合物不在液體中沉淀或沉積，就不應設定分子量上限。葡聚糖用作載體時(下述實施例1和6)，就分子量而言，20,000,000根本沒有問題，并且分子量在40,000,000-100,000,000之間也沒有問題。
雖然最初是在尋找可用于免疫檢測和免疫組化領域的酶-探針復合物時實現(xiàn)了本發(fā)明，但并不限制將該復合物應用于其它領域。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的酶標抗體使得檢測活體內(nèi)痕量存在的抗原和蛋白質(zhì)成為可能，用常規(guī)酶標抗體不能檢測到這些抗原和蛋白質(zhì)。采用這種酶標抗體，可以測定以前無法測定的抗原和蛋白質(zhì)附圖簡要說明

圖1顯示了用凝膠過濾對本發(fā)明的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物進行分子量分析的結(jié)果；圖2顯示了采用酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物和常規(guī)的酶-抗體檢測核心抗原時靈敏度的比較結(jié)果；圖3顯示了一種單克隆抗體結(jié)合于載體-酶復合物時和兩種單克隆抗體結(jié)合于載體-酶復合物時的反應活性；圖4顯示了其中酶的氨基被封閉并然后結(jié)合于探針的復合物和其中酶的氨基未封閉并結(jié)合于探針的復合物的反應活性；以及圖5顯示了采用酶-抗ProGRP抗原單克隆抗體復合物和常規(guī)方法的酶-抗體檢測ProGRP時靈敏度的比較結(jié)果。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中的所述載體不受特別限制，只要其分子量在20,000-4,000,000的范圍內(nèi)。然而，由于需要結(jié)合大量酶分子以提高靈敏度，優(yōu)選某種水平的分子量。載體的例子包括多糖、高分子量蛋白質(zhì)和肽聚合物，它們的合適分子量為20,000-20,000,000，優(yōu)選20,000-4,000,000，更優(yōu)選70,000-2,000,000。此外，采用多糖或肽聚合物時，即使分子量相同，富含側(cè)鏈的分子的信號傾向于更強。
本發(fā)明所述多糖載體的例子包括葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、可溶性淀粉等。此外，本發(fā)明所述高分子量蛋白質(zhì)載體的例子包括β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍蛋白等。此外，聚賴氨酸以及各種肽聚合物可用作本發(fā)明所述的肽聚合物載體。
可用于本發(fā)明的酶不受特別限制，適合采用免疫檢測通常所用的辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、螢光素酶等。由于所述酶結(jié)合于兩個或多個載體，或載體和探針分子，所述酶需要含有兩個或多個官能團，例如糖鏈和氨基；或兩個或多個氨基；氨基和羧基；以及巰基和氨基。
可采用任何接頭或結(jié)合方式使載體與酶結(jié)合。然而，由于所述載體與酶結(jié)合后需要使探針結(jié)合于嵌段物，所述酶或載體上必須留有官能團。
可通過使酶分子通過肼基結(jié)合于分子量為(例如)20,000-4,000,000的載體產(chǎn)生酶分子介導的嵌段物，所述肼基存在于所述載體上或用合適的接頭分子引入該載體，或用合適的接頭分子引入所述酶分子中。可通過所述嵌段物的載體分子中或與載體連接的酶分子中的官能團結(jié)合探針分子，產(chǎn)生所述嵌段酶-探針復合物。
類似地，可通過將引入分子量為20,000-4,000,000的載體的肼基結(jié)合于通過氧化酶分子的糖鏈產(chǎn)生的醛基以使載體結(jié)合于酶分子，然后，通過結(jié)合于通過酶分子形成的嵌段物的載體分子中或結(jié)合于載體的酶分子中的官能團的接頭分子結(jié)合探針分子，從而產(chǎn)生嵌段酶-探針復合物。
在這種情況下，引入載體或酶的具有肼基的接頭分子可以是具有肼基(-NHNH2)的肼鹽，如硫酸肼和鹽酸肼；具有肼基的酰肼(-CO-NHNH2)；或者具有官能團和肼基的物質(zhì)。
同時，具有官能團如馬來酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、羧基、巰基等的物質(zhì)可用作將載體或酶分子連接于探針分子的接頭分子。
而且，在制備酶介導的嵌段酶時，酶與載體的重量比優(yōu)選為0.2-10倍，更優(yōu)選0.3-5倍，雖然這取決于載體上官能團如肼基的數(shù)量。
另一個例子是，通過氧化辣根過氧化物酶(HRP)的糖鏈制備酶介導的嵌段酶，它進而結(jié)合于分子量為20,000或更高的葡聚糖，此葡聚糖上引入了肼基。為了將馬來酰亞胺基引入嵌段酶的表面，將接頭分子如N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)連接于載體上殘留的肼基和HRP上殘留的氨基，并與探針分子中存在的或引入探針分子的SH基團反應，從而制備嵌段酶-探針復合物。以此方式，利用酶分子的糖鏈以及殘留肼基和殘留氨基制備嵌段酶-探針復合物。
可用任何交聯(lián)劑使嵌段物和探針結(jié)合，并可采用任何結(jié)合方式。優(yōu)選采用在水溶液中高度穩(wěn)定的雜雙功能(heterobifunctional)交聯(lián)劑或同雙功能(homobifunctional)交聯(lián)劑。
抗體(單克隆抗體、多克隆抗體)及其片段(F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等)、各種受體、各種抗生物素蛋白(抗生物素蛋白D、鏈霉抗生物素蛋白等)、蛋白A、蛋白G、蛋白L、各種凝集素(伴刀豆球蛋白A、小扁豆凝集素、植物血凝素等)、能夠結(jié)合于各種待測核酸的探針等可用作探針。
可采用結(jié)合于待分析的靶抗原或物質(zhì)的任何抗體?？捎玫鞍酌溉缥傅鞍酌负湍竟系鞍酌赣煽贵w獲得抗體片段如F(ab’)2和Fab?？贵w的重鏈(H鏈)通常通過S-S鍵互相連接，可用還原劑破壞此鍵。還原劑包括半胱胺和巰基乙醇。用還原劑將F(ab’)2切割成Fab’，以產(chǎn)生新的巰基(SH)。本發(fā)明也可采用這些抗體片段如F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等。
為了以非限制性方式詳細描述本發(fā)明，下面顯示了產(chǎn)生酶-探針復合物的方法及其特征描述的例子。
實施例1用葡聚糖T2000作為載體制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物稱量0.3g葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000；Amersham)，溶解于6 ml 0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。加入3ml高碘酸鈉溶液并混合，將該混合物室溫靜置2小時以進行反應，然后進行凝膠過濾(Sephadex G25，Amersham)，以收集空組分。將鹽酸肼(Wako Pure Chemical Industris Inc.)加入空組分以將肼引入葡聚糖。理論上，分子量為2,000,000的葡聚糖分子上最多可引入22,000個肼。稱量100mg過氧化物酶(HRP，Toyobo Co.Ltd.)，混合并溶解于3ml 0.1M碳酸氫鈉溶液中。加入1.5ml高碘酸鈉溶液并混合，將該混合物室溫靜置2小時以進行反應。通過凝膠過濾(SephadexG25)使該混合物脫鹽，然后加入約150mg事先獲得的葡聚糖酰肼并混合。該混合物在室溫下反應2小時，還原后，加入甘氨酸至最終濃度為0.1M。4℃透析該混合物3次，每次4小時，以獲得嵌段的載體HRP偶聯(lián)物。由于此反應中未結(jié)合的HRP為10％或更少，同時根據(jù)回收率，似乎約12-16個HRP結(jié)合于一個葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000)分子。將溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中的1mg N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS，Dojindo Laboratories)加入5mg偶聯(lián)物中，室溫下反應2小時，然后通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，以將馬來酰亞胺引入載體HRP偶聯(lián)物中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入3.5mg抗HCV核心抗原單克隆抗體的F(ab’)2(由等量的c11-10 F(ab’)2和c11-14 F(ab’)2組成)的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以將F(ab’)2轉(zhuǎn)化為Fab’。對該混合物進行凝膠過濾(Sephadex G25)，通過收集空組分獲得Fab’。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的載體HRP偶聯(lián)物在4℃反應過夜，進行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm，Amersham)以去除游離的Fab’。此時，在空組分附近洗脫出本發(fā)明HRP-Fab復合物。由于此反應中游離的Fab’占10％或更少，同時根據(jù)回收率，似乎約6-10個Fab’結(jié)合于一個葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000)分子。將牛血清白蛋白(BSA)加入收集的組分中，至濃度為0.5％，將該混合物儲存于4℃。在403nm處測定這樣制備的HRP-Fab復合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算復合物中HRP的濃度。
實施例2用葡聚糖T70作為載體制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物稱量0.3g葡聚糖T70(平均分子量70,000；Amersham)，以類似于實施例1的方式獲得HRP-Fab復合物。在403nm處測定HRP-Fab復合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算復合物中HRP的濃度。
實施例3用葡聚糖T500作為載體通過改變載體與酶的比例制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物稱量0.3g葡聚糖T500(平均分子量500,000；Amersham)，以下述比例制備載體-酶偶聯(lián)物載體(150mg)∶酶(100mg)的重量比(0.66)，與實施例1相似；載體100mg∶三倍量的酶(300mg)的重量比(2.00)；載體100mg∶五倍量的酶(500mg)的重量比(3.33)。然后，以類似于實施例1的方式偶聯(lián)抗HCV核心抗原單克隆抗體。在403nm處測定HRP-Fab復合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算復合物中HRP的濃度。
實施例4用葡聚糖T500作為載體制備酶-抗ProGRP抗體復合物稱量0.3g葡聚糖T500(平均分子量500,000；Amersham)，以類似于實施例1的方式獲得載體-Fab復合物。將溶解于DMF中的1mg EMCS加入5mg此偶聯(lián)物中，室溫下反應2小時。然后通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，將馬來酰亞胺引入載體HRP偶聯(lián)物中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入抗ProGRP單克隆抗體(2B10)的F(ab’)2的溶液中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對該混合物進行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分以獲得Fab’。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的載體HRP偶聯(lián)物在4℃反應過夜，進行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm，Amersham)。收集空組分附近的組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，并儲存于4℃。在403nm處測定這樣制備的HRP-Fab復合物的吸光度，用403 nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算復合物中HRP的濃度。
對比實施例1用常規(guī)方法制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體Ishikawa等報道的制備標記抗體的方法已經(jīng)廣泛應用于普通診斷試劑。此方法(超高靈敏度的酶免疫檢測方法，Eiji Ishikawa，1993，Japan Scientific Societies Press)用作常規(guī)方法。稱量4mg HRP，并溶解于0.6ml 0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。加入溶解于DMF的1mg EMCS，室溫下反應2小時。通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，將馬來酰亞胺引入HRP的氨基。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入每個抗HCV核心抗原單克隆抗體(c11-10和c11-14)的F(ab’b)2的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對Fab’進行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的HRP在4℃反應過夜，對該混合物進行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm)，收集HRP-Fab組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，4℃保存。在403nm處測定這樣制備的HRP-Fab偶聯(lián)物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算偶聯(lián)物中HRP的濃度。
對比實施例2
用常規(guī)方法制備酶-抗ProGRP單克隆抗體以類似于對比實施例1的方式將馬來酰亞胺引入HRP的氨基中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入抗ProGRP單克隆抗體(2B10)的F(ab’)2的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對Fab’進行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分。此Fab’和引入了馬來酰亞胺的HRP在4℃反應過夜，對該混合物進行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm)，收集HRP-Fab組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，4℃保存。在403nm處測定這樣制備的HRP-Fab偶聯(lián)物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算偶聯(lián)物中HRP的濃度。
實施例5通過凝膠過濾對實施例1中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物進行分子量分析用Sephacryl S-500 Superfine(amersham)(1.6×60)柱對實施例1中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物進行凝膠過濾。這種Sephacryl S-500 Superfine柱主要用于分離大分子量的分子與小顆粒。根據(jù)Pharmacia的“凝膠過濾理論和實踐”(Gelfiltration theory and practice)，對于多糖而言，此柱的分級范圍是4×104-2×107。用PBS作為載體以1ml/分鐘的流速進行凝膠過濾。收集4ml/2分鐘組分。測定403nm處的吸光度，用HRP的分子吸收系數(shù)計算HRP濃度(μg/ml)。將各組分稀釋至1μg/ml當量的HRP濃度，研究反應活性。檢測方法如下。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。加入其中重組HCV核心抗原(c11)的濃度被調(diào)整為0 fmol/L和1200 fmol/L的樣品，室溫下振蕩孵育60分鐘。用含有0.05％吐溫20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入200μl稀釋至1μg/ml HRP當量濃度的各組分和1μg/ml HRP當量濃度的常規(guī)制備的酶-抗體偶聯(lián)物作為第二抗體，孵育30分鐘。各孔用洗滌溶液再洗滌6次，加入200μl底物溶液(鄰苯二胺，過氧化氫)并孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(Corona MTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。表1和圖1顯示了各凝膠過濾組分的HRP濃度和上述檢測的結(jié)果(核心抗原1200fmol/L和0fmol/L之間吸光度的差異)。3個分子量標記物的分子量是甲狀腺球蛋白，668,000；鐵蛋白，440,000；BSA，68,000。此外，同時測定的核心抗原為0 fmol/L和1200 fmol/L的情況下常規(guī)方法制備的1μg/ml酶-抗體偶聯(lián)物的吸光度分別為0.000和0.050。因此，常規(guī)方法測定的1200fmol/L和0fmol/L核心抗原的吸光度的差異為0.050。圖1驗證了分子量越大，1200fmol/L核心抗原的吸光度越高。
表1

在19之后的組分中，與常規(guī)方法相比信號增加了三倍或更少，但在組分2-18中，信號增加了3倍或更多。由于甲狀腺球蛋白(分子量668,000)和鐵蛋白(分子量440,000)分別顯示出在組分17和組分18附近的峰值，這說明在分子量約為440,000或更高時本發(fā)明的效果比常規(guī)方法優(yōu)越約5.9倍或更高，在分子量約為668,000或更高時本發(fā)明的效果比常規(guī)方法優(yōu)越約7.7倍。
本實施例中葡聚糖T2000的平均分子量為2,000,000，當14個分子量為40,000的HRP分子結(jié)合于這種載體，另有8個分子量為46,000的Fab’分子結(jié)合于這種嵌段的載體-酶時，酶-探針復合物的分子量約為2,900,000。這被認為是本實施例中酶-探針復合物的基本單元。
另一方面，用于本實施例中凝膠過濾的Sephacryl S-500 Superfine柱的分級范圍是4×104-2×107，如表1中明確表示，包含空組分的第一組分顯示出高活性。包含空組分的第一組分含有分子量至少為2×107或更高的酶-探針復合物。由于本實施例中酶-探針復合物的基本單元的分子量是2,900,000，可以解釋為包含空組分的第一組分中存在的酶-探針復合物形成了分子量較高的酶-探針復合物，其中至少兩個或多個酶-探針復合物共價連接，這就是嵌段酶-探針復合物。
另外，用于本實施例的載體葡聚糖T2000必然含有分子量小于平均分子量2,000,000的葡聚糖和其降解產(chǎn)物。它們顯然也參與了酶-探針復合物或嵌段酶-探針復合物的形成，因此本實施例中包括分子量小于2,900,000(酶-探針復合物的基本單元的平均分子量)的酶-探針復合物。本發(fā)明中也包括它們。
實施例6改變載體與酶的比例時酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物的反應活性采用實施例3制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物，研究稀釋至2μg/ml當量酶濃度后這些復合物的反應活性。以下是測試方法。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。將重組HCV核心抗原(c11)的濃度調(diào)整為0fmol/L、25.9fmol/L、77.8fmol/L、233.3fmol/L和700fmol/L，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用含有0.05％吐溫20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌6次后，加入稀釋至2μg/ml酶當量濃度的各酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物，孵育30分鐘。然后用洗滌溶液洗滌各孔6次，加入200μl底物溶液(鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(Corona MTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。
比較采用載體與酶重量比為0.66、2.00和3.33的載體-酶偶聯(lián)物制備的抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物的反應活性時，重量比為2.00和3.33的復合物的反應活性為重量比為0.66的復合物的反應活性的77.6％和70.5％，這表明酶量越多，反應活性越低。即使載體∶酶重量比為2.00、3.33或更高的復合物的靈敏度仍然比常規(guī)方法高得多。然而，酶相對于載體過量存在時，因為更多的酶結(jié)合于一個載體分子，產(chǎn)生更多的作為最小單元的酶-載體。然而，推測產(chǎn)生其中最小單元通過酶互相結(jié)合的復合物如載體-酶-載體-酶-載體-酶的概率較小。就是說，正如實施例5的凝膠過濾分析中所述，本發(fā)明的酶-探針復合物的反應活性較高可解釋為因為形成了分子量較高的酶-探針復合物，其中至少兩個或多個作為所述復合物最小單元的酶-探針復合物共價連接起來，換言之，因為形成了嵌段酶-探針復合物。
實施例7用實施例1和2中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物和常規(guī)的酶-抗體進行核心抗原檢測的靈敏度的比較將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，以2.5μg/ml HRP加入200μl實施例1和2中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物或常規(guī)方法制備的酶-抗體，作為第二抗體，孵育30分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(Corona MTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。圖2顯示了結(jié)果。如果將0fmol/L和OD0.030之間的差異定為檢測限，常規(guī)的酶-抗體、實施例2的酶-抗體復合物和實施例1的酶-抗體復合物分別可檢測到約263fmol/L、約75fmol/L和約10fmol/L(0.2pg/ml)。即，本發(fā)明的靈敏度比常規(guī)方法高3.5-26.3倍。由于易于測定HCV感染以及寬范圍的病毒定量，具有更高靈敏度的此種方法的實用性得到了提高。
實施例8用其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物和其中兩種單克隆抗體分別結(jié)合的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物檢測核心抗原的靈敏度的比較在實施例1或2中，兩種抗HCV核心抗原單克隆抗體{c11-10F(ab’)2和c11-14F(ab’)2}一起與嵌段載體-酶反應。此外，這兩種單克隆抗體分別與嵌段載體-酶反應，并制備了酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物。研究了其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的制備物以及其中c11-10和c11-14單克隆抗體以1μg/ml的濃度單獨結(jié)合的制備物的反應活性。也通過將單獨結(jié)合的c11-10單克隆抗體的制備物和單獨結(jié)合的c11-14單克隆抗體的制備物混合來研究反應活性，其中各抗體的濃度為0.5μg/ml(共1μg/ml)。結(jié)果見圖3。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，加入200μl其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的制備物、其中c11-10和c11-14單克隆抗體單獨結(jié)合的制備物以及等量的單獨結(jié)合的c11-10單克隆抗體制備物和c11-14單克隆抗體制備物的混合物，其HRP濃度為1μg/ml。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(CoronaMTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。
與單獨存在時相比，單獨結(jié)合的c11-10和c11-14單克隆抗體各為0.5μg/ml的混合物中反應活性稍有提高(約1.2倍)。然而，與混合的制備物相比，兩種抗體結(jié)合在一起的制備物的反應活性提高了大約2-2.5倍。因此，結(jié)合探針以使兩種或多種單克隆抗體和其片段結(jié)合于嵌段載體-酶更有效。
實施例9其中單克隆抗體特異性結(jié)合于嵌段載體-酶上的載體的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復合物的反應活性HRP中的氨基數(shù)量非常少，嘗試用氨基將馬來酰亞胺基引入HRP的Ishikawa等的結(jié)果表明，其中至多有1-3個基團(Eiji Ishikawa，Methods for BiochemistryExperiments 27，酶標記方法，Japan Scientific Societies Press)。用2-甲基馬來酸酐封閉HRP中的這幾個氨基后，以類似于實施例3的方式用葡聚糖T500作為載體制備載體-酶偶聯(lián)物，載體∶酶重量比為0.66，然后結(jié)合抗HCV核心抗原單克隆抗體。測定403nm處的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計算復合物中HRP的濃度。將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，以總濃度2μg/ml當量HRP濃度加入200μl標記抗體，孵育20分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(Corona MTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。作為對比參照，用類似于實施例3的方式以載體∶酶重量比0.66制備載體-酶偶聯(lián)物，并隨后結(jié)合抗HCV核心抗原單克隆抗體后使用(圖4)。
如圖4所示，其中氨基被封閉的酶-抗體復合物的反應活性約為氨基未封閉的制備物的88.1％，因此確證，抗體僅結(jié)合于載體時能獲得足夠的反應活性。由于本發(fā)明所述嵌段酶-抗體復合物中沒有采用大量過量的酶，抗體可結(jié)合于載體或酶，但看來作為探針的抗體僅結(jié)合于載體時顯示出了足夠的反應活性。
實施例10采用實施例4中制備的酶-抗ProGRP單克隆抗體復合物和常規(guī)的酶-抗體的檢測靈敏度的比較將200μl抗ProGRP單克隆抗體(2B10)以5μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.3(PBS)洗滌兩次后，將350μl0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時。吸除0.5％酪蛋白后，從8000 pg/mL起連續(xù)三倍稀釋重組ProGRP(31-98)，作為樣品加入，37℃孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌5次后，以總濃度1.5μg/ml HRP加入200μl實施例4中制備的酶-抗ProGRP單克隆抗體復合物或常規(guī)方法制備的酶-抗體，作為第二抗體，孵育30分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應，用酶標儀(Corona MTP32)測定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。結(jié)果見圖5。橫軸代表ProGRP的濃度，縱軸代表492nm處的吸光度。可以明顯看出，與常規(guī)方法制備的酶標抗體相比，實施例4中制備的酶抗體復合物顯示出極高的信號。如果將0 pg/mL和OD0.020之間的差異定為檢測限，那么常規(guī)的酶-抗體和實施例3的酶-抗體復合物分別可檢測到約115 pg/ml和約7pg/ml。即，本發(fā)明方法的靈敏度比常規(guī)方法高16.4倍。由于健康個體的血清中ProGRP的濃度約為14 pg/ml且截止值約為50 pg/ml(Jpn.J.Cancer Res.1995，86，698-705)，用常規(guī)方法不能檢測到健康個體或一些小細胞肺癌患者的樣品中的ProGRP。通過本發(fā)明則可能檢測到常規(guī)方法檢測不到的患者和健康個體的樣品中的ProGRP，從而驗證了本發(fā)明的有用性。
權利要求
1.一種嵌段酶-探針復合物，其中探針分子與其中兩個或多個分子量為20,000-4,000,000的作為載體的分子通過結(jié)合于所述載體的酶連接起來的復合物偶聯(lián)。
2.如權利要求1所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述載體和酶分子通過所述載體上的官能團和氧化所述酶分子中的糖鏈形成的醛基結(jié)合。
3.如權利要求1或2所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述載體是選自下組的一種或多種載體葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍蛋白、聚賴氨酸、多肽和DNA。
4.如權利要求1或2所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述酶是選自下組的一種或多種酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶和螢光素酶。
5.如權利要求1或2所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述探針是選自下組的一種或多種探針抗體分子或其功能片段、蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、受體和抗生物素蛋白。
6.如權利要求1-5中任一項所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，兩種或多種探針相偶聯(lián)。
7.如權利要求5或6所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述抗體分子或其功能片段是選自下組的一種或多種抗-HCV核心抗原抗體、抗胃泌素釋放肽前體抗體和它們的功能片段。
8.如權利要求1-7中任一項所述的嵌段酶-探針復合物，其特征在于，所述嵌段酶-探針復合物的分子量為440,000或更高。
9.一種包含權利要求1-8中任一項所述的嵌段酶-探針復合物的免疫檢測試劑盒或核酸檢測試劑。
10.一種產(chǎn)生權利要求1-8中任一項所述的嵌段酶-探針復合物的方法，所述方法包括以下步驟通過將分子量為20,000-4,000,000的載體與酶結(jié)合形成嵌段物；和將探針偶聯(lián)于所述嵌段物。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，通過以載體∶酶＝1∶0.1-1∶20的重量比使所述載體與所述酶分子反應形成所述嵌段物。
全文摘要
問題提供可用于以高靈敏度檢測活體中以極小量存在的抗原、蛋白質(zhì)等的嵌段酶標記物復合物。解決問題的方法提供了包含嵌段的嵌段酶探針復合物，所述嵌段由兩個或多個分子量為20,000－4,000,000的分子的載體和酶的組合組成，它們通過酶或接頭結(jié)合，其中探針分子與酶結(jié)合。
文檔編號G01N33/535GK101088009SQ20058004466
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權日2004年12月28日
發(fā)明者青柳克己 申請人:株式會社先端生命科學研究所