專利名稱：Asc作為結腸直腸癌的標記的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及結腸直腸癌的診斷。它公開了含有胱天蛋白酶相關募集結構域的細胞凋亡相關斑點樣蛋白(＝ASC)在結腸直腸癌的診斷中的用途。而且，它尤其涉及通過測量樣品中的ASC，從源自個體的液體樣品診斷結腸直腸癌的方法。ASC的測量可以例如用于結腸直腸癌的早期檢測或經歷外科手術的患者的監(jiān)護。
背景技術：
盡管檢測和治療的進展，但癌癥仍然是主要的公共健康挑戰(zhàn)。在各種類型的癌癥中，結腸直腸癌(＝CRC)是西方世界最常見的癌癥之一。
結腸直腸癌最經常從腺瘤(息肉)發(fā)展成惡性癌。通常根據(jù)Dukes氏病期A至D來分類CRC的不同病期。
癌癥的分期是疾病關于程度、進展和嚴重性的分類。其將癌癥患者分組，從而可以對預后和選擇治療作出概括。
TNM系統(tǒng)是當前最廣泛使用的癌癥解剖學程度的分類。該系統(tǒng)代表國際接受的統(tǒng)一分期系統(tǒng)。它有三個基本變量T(原發(fā)腫瘤的程度)，N(局部淋巴結狀態(tài))以及M(存在或不存在遠處轉移)。TNM標準由UICC(International Union Against Cancer)公布，1997版本(Sobin，L.H.和Fleming，I.D.，TNM 80(1997)1803-4)。
特別重要的是，CRC的早期診斷轉變?yōu)楹煤芏嗟念A后。結腸直腸的惡性腫瘤起于良性腫瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期診斷的那些患者具有最好的預后。在已經存在遠處轉移時診斷的患者僅有10％的五年生存率，與此相比，如果處理得當，在早至Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0病期診斷的患者，在診斷后具有超過90％的五年生存機會。
就本發(fā)明來說，CRC的早期診斷指在惡化前狀態(tài)(腺瘤)或在完全沒有轉移(既非鄰近的也非遠處的)的腫瘤病期，即存在腺瘤、Tis、N0、M0或T1-4；N0；M0的病期，進行的診斷。Tis表示原位癌。
更優(yōu)選地，在CRC尚未完全生長穿過腸壁時進行CRC診斷，且這樣既沒有臟層腹膜穿孔也沒有其它器官或結構受侵，即，在病期Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0(＝Tis-3；N0；M0)中作出診斷。
癌癥能夠越早得到檢測/診斷，總生存率就越高。對于CRC，這一點尤其正確。晚期腫瘤的預后差。超過三分之一的患者將在診斷后五年內死于進行性疾病，對應于約40％的五年生存率。目前的治療僅僅治愈一部分患者，而且對在疾病早期診斷的那些患者顯然具有最佳作用。
關于作為公共健康問題的CRC，有必要開發(fā)對結腸直腸癌更有效的篩選和預防措施。
目前，關于結腸直腸癌可用的最早檢測程序包括使用糞便血液檢驗或內窺鏡檢查程序。然而，在檢測糞便血液之前一般必須存在顯著的腫瘤大小。以愈創(chuàng)木脂為基礎的糞便潛血試驗的靈敏性約為26％，意味著74％具有惡性病變的患者將仍然未檢測到(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。癌變前和癌性病變的顯像代表早期檢測的最佳方法，但是結腸鏡檢查是昂貴、具有風險和并發(fā)癥的侵入性方法(Silvis，S.E.等，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.等，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
為了具有臨床效用，作為單獨標記的新的診斷標記應當至少與本領域已知的最佳單獨標記一樣好?；蛘?，如果單獨或分別與一個或多個其它標記聯(lián)合使用，一個新的診斷標記應當引起診斷靈敏性和/或特異性的改進。通過檢驗的接收器工作特性(receiver-operatingcharacterisitics)對其診斷靈敏性和/或特異性進行最佳評價，所述接收器工作特性將在下面詳細介紹。
最近，歐洲腫瘤標記研究組(European Group on TumorMarkers)(EGTM)已經綜述了生物化學標記在結腸直腸癌中的臨床應用(Duffy，M.J.，等，Eur.J.Cancer 39(2003)718-727)。
目前，主要可利用基于檢測腫瘤相關糖蛋白癌胚抗原(CEA)的診斷性血液檢驗來輔助CRC領域的診斷。在從結腸直腸癌、胃癌和胰癌和大部分乳腺癌、肺癌以及頭部和頸部癌患者得到的組織樣品中，95％樣品中CEA升高(Goldenberg，D.M.等，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。在非惡性疾病患者中也有過CEA水平升高的報導，而且許多結腸直腸癌患者具有正常的血清CEA水平，特別是在疾病的早期階段(Carriquiry，L.A.，和Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.等，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，等，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。據(jù)報導，從血清或血漿測量的CEA在檢測復發(fā)中的效用是有爭議的，且也未得到廣泛應用(Martell，R.E.，等，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.等，JAMA 270(1993)943-947)。
根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，血清CEA測定既不具有靈敏性也不具有特異性來使其用于無癥狀群體中結腸直腸癌的篩選檢驗(Reynoso，G.等，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血漿是臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來源。對有助于可靠的癌癥檢測或提供早期預后信息的早期CRC腫瘤標記的鑒定，可以產生將大大幫助該疾病診斷和控制的診斷性測定。因此，存在改進CRC的體外評價的急迫的臨床需求。由于早期診斷的患者的存活機會大大高于在疾病進展后期得到診斷的患者，所以改進CRC的早期診斷尤其重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是，研究是否可以鑒定用于評價CRC的生物化學標記。
令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)標記ASC的使用至少可以部分地克服從本領域技術水平已知的問題。
本發(fā)明因此涉及通過生物化學標記體外評價結腸直腸癌的方法，其包含a)測量樣品中ASC的濃度，和b)使用步驟(a)中測定的濃度，評價結腸直腸癌。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案是評價結腸直腸癌的方法，其包含下述步驟a)在適合對ASC特異性的結合劑和ASC之間形成復合物的條件下，使從個體獲得的液體樣品接觸所述結合劑，和b)將(a)中形成的復合物的量與結腸直腸癌的評價相關聯(lián)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案涉及通過生物化學標記體外評價結腸直腸癌的方法，其包含測量樣品中ASC的濃度和結腸直腸癌的一種或多種其它標記的濃度，并使用測定的濃度評價結腸直腸癌。
本發(fā)明還涉及包含至少ASC和CYFRA21-1的標記組在CRC的評價中的用途。
本發(fā)明還涉及包含至少ASC和NSE的標記組在CRC的評價中的用途。
本發(fā)明還提供了用于進行本發(fā)明的方法的試劑盒，其包含至少分別特異性地測量ASC和CYFRA21-1所需的試劑，和任選的用于實現(xiàn)測量的輔助試劑。
本發(fā)明還提供了用于進行本發(fā)明的方法的試劑盒，其包含至少分別特異性地測量ASC和NSE所需的試劑，和任選的用于實現(xiàn)測量的輔助試劑。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及體外評價結腸直腸癌的方法，其包含下述步驟a)測量樣品中ASC的濃度，b)任選地測量樣品中結腸直腸癌的一種或多種其它標記的濃度，和c)使用在步驟(a)和任選的步驟(b)中測定的濃度，評價結腸直腸癌。
如本文所使用的，下面術語的每一個在本部分中具有與它相關的含義。
冠詞“一個(a)”和“一個(an)”在本文中用于指一個(種)或超過一個(種)(即至少一個(種))冠詞的語法上的對象。作為實例，“一種標記”指一種標記或超過一種標記。
術語“標記”或“生物化學標記”在本文中用于指要用作分析患者實驗樣品的靶的分子。這樣的分子靶的實例是存在于樣品中的蛋白或多肽本身以及抗體。在本發(fā)明中用作標記的蛋白或多肽預期包括所述蛋白的任意變體以及所述蛋白或所述變體的片段，特別是免疫學上可檢測的片段。本領域的技術人員可認識到，受到損害(例如，在炎癥過程中)的由細胞釋放的蛋白或存在于胞外基質中的蛋白，可被降解或切割成這樣的片段。以無活性形式合成某些標記，其可以隨后通過蛋白水解來激活。如熟練的技術人員將明白的，蛋白或其片段也可以作為復合物的部分而存在。這樣的復合物也可以用作本發(fā)明意義上的標記。標記多肽的變體由相同基因編碼，但是它們的PI或分子量(MW)或二者不同(例如，作為可變mRNA或前mRNA加工的結果，例如可變剪接或限制性蛋白水解)，且另外或可選擇地，可以源自有差別的翻譯后修飾(例如，糖基化、?；?或磷酸化)。
術語“評價結腸直腸癌”用于指，本發(fā)明的方法將(單獨地或與其它標記或變量一起，例如，UICC(UICC(International UnionAgainst Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(編)，TNMClassification of Malignant Tumours，第5版，1997)所述的標準)，例如，輔助醫(yī)師確定或證實是否存在CRC，或輔助醫(yī)師進行預后、檢測復發(fā)(外科手術后患者的隨訪)和/或監(jiān)控治療，尤其是化療。
術語“樣品”在本文中用于指為體外評價目的而得到的生物學樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或患者樣品優(yōu)選地可以包含任意的體液。優(yōu)選的試驗樣品包括血、血清、血漿、尿、唾液和滑液。優(yōu)選的樣品是全血、血清、血漿或滑液，其中血漿或血清是最優(yōu)選的。如熟練的技術人員將明白的，體外進行任意的這種評價。此后拋棄患者樣品?；颊邩悠穯为毜赜糜诒景l(fā)明的體外方法，且患者樣品材料不再輸回到患者體內。一般地，樣品是液體樣品，例如，全血、血清或血漿。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及通過生物化學標記體外評價CRC的方法，其包含測量樣品中的ASC濃度，和使用測定的濃度評價CRC。
“含有胱天蛋白酶相關募集結構域的細胞凋亡相關斑點樣蛋白”(ASC)也稱作“甲基化誘導的沉默的靶1”(TMS1)(Swiss-PROTQ9ULZ3)，其特征在于SEQ ID NO1給出的序列。該序列翻譯成理論分子量21,627 Da和理論等電點pH 6.29。
胱天蛋白酶相關募集結構域(CARD)介導銜接蛋白如APAF1(細胞凋亡蛋白酶激活因子1)和參與細胞凋亡的胱天蛋白酶前體形式(例如，CASP 9)之間的相互作用。ASC是含有CARD的銜接蛋白家族的成員。
通過免疫篩選前髓細胞(promyelocytic)細胞系，Masumoto等分離了編碼ASC的cDNA。推論的195-氨基酸蛋白含有N-末端熱蛋白-樣結構域(PYD)和87-殘基C-末端CARD。蛋白印跡分析顯示了22-kDa蛋白的表達，并表明ASC可以通過增加白血病細胞系對抗癌藥物的細胞凋亡刺激的易感性，具有促細胞凋亡(proapoptotic)活性(Masumoto，J.，等，J.Biol.Chem.274(1999)33835-33838)。
Conway等的甲基化-敏感的限制PCR和甲基化-特異性的PCR(MSP)分析表明，ASC的沉默與外顯子1周圍的CpG島的過度甲基化有關，且DNMT1(DNA胞嘧啶-5-甲基轉移酶-1)的超表達促進過度甲基化和ASC的沉默。乳腺癌細胞系(而不是正常的乳房組織)表現(xiàn)出ASC的完全甲基化，且不表達ASC信號。ASC在乳腺癌細胞系中的表達抑制生長，并減少存活集落的數(shù)目。Conway等的結論是，ASC在促進胱天蛋白酶-依賴性的細胞凋亡中起作用，且ASC的超表達抑制乳腺癌細胞的生長(Conway，K.E.，等，Cancer Research 60(2000)6236-6242)。
McConnell和Vertino顯示，ASC的誘導型表達抑制細胞增殖，并誘導可以被胱天蛋白酶抑制劑阻斷的DNA斷裂。免疫熒光顯微鏡術證實，細胞凋亡的誘導造成CARD-依賴性的從彌散性細胞質表達向球形核周聚集體的變化(McConnell，B.B.，和Vertino，P.M.，CancerResearch 60(2000)6243-6247)。
Moriani等不僅在乳腺癌細胞中而且還在胃癌中觀察到了ASC基因的甲基化。他們提出了ASC基因的異常甲基化在涉及促細胞凋亡的ASC基因的下調的乳腺癌和胃癌的發(fā)展中的直接作用(Moriani，R.，等，Anticancer Research 22(2002)4163-4168)。
Conway等檢查了用于TMS1甲基化的初生乳房組織，并將結果與健康組織中的甲基化相對比(Conway K.E.，等，Cancer Research60(2000)6236-6242)。Levine等發(fā)現(xiàn)，ASC沉默與特定CpG位點的甲基化無關，但是與ASC CpG島的密集甲基化有關。排它地含有甲基化的ASC拷貝的乳腺腫瘤細胞系不表達ASC，而在部分甲基化的細胞系中，ASC的表達水平與存在于細胞群體中的甲基化ASC等位基因的百分比直接相關(Levine，J.J.，等，Oncogene 22(2003)3475-3488)。
Virmani等檢查了肺癌和乳腺癌組織中的ASC的甲基化狀態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)，ASC的異常甲基化存在于46％乳腺癌細胞系和32％乳腺腫瘤組織中。甲基化罕見于非惡性乳腺組織中(7％)(Virmani，A.，等，Int.J.Cancer 106(2003)198-204)。
Shiohara等發(fā)現(xiàn)，ASC的上調與人嗜中性粒細胞中的炎癥和細胞凋亡密切相關(Shiohara，M.，等，Blood 98(2001)229a)。
Masumoto等觀察到了在上皮細胞和白細胞中大量表達的ASC的高水平(Masumoto，J.，等，Journal Histochem.Cytochem.49(2001)1269-1275)。
對技術人員顯而易見的是，本發(fā)明不應該解釋為局限于SEQ IDNO1的全長蛋白ASC。ASC的生理或人工片段、ASC的二級修飾以及ASC的等位基因變體也包括在本發(fā)明中。人工片段優(yōu)選包括合成地或由重組技術產生的肽，該肽至少包含一個具有診斷重要性的表位，該表位由至少6個鄰接的氨基酸組成，這6個氨基酸衍生自SEQID NO1公開的序列。這樣的片段可以有利地用于抗體的產生，或者作為免疫測定的標準。人工片段更優(yōu)選包含至少兩個適于建立夾心免疫測定的目的表位。
根據(jù)本發(fā)明的評價方法基于得自個體的液體樣品。與本領域已知的方法不同，使用特異性結合試劑從該液體樣品特異性地測量ASC。
特異性結合試劑為，例如，ASC受體、結合ASC的凝集素或ASC抗體。特異性結合試劑對其相應的靶分子具有至少107l/mol的親和力。特異性結合試劑優(yōu)選對其靶分子具有108l/mol的親和力，或甚至更優(yōu)選109l/mol的親和力。技術人員將理解，使用術語特異性的表示樣品中存在的其它生物分子不與ASC的特異性結合試劑發(fā)生顯著的結合。優(yōu)選地，與除靶分子之外的生物分子結合的水平導致與靶分子親和力的僅10％，更優(yōu)選僅僅5％或更低的結合親和力。最優(yōu)選的特異性結合試劑將同時滿足上述關于親和力和特異性的最小標準。
特異性結合試劑優(yōu)選是與ASC反應的抗體。術語抗體指多克隆抗體、單克隆抗體、這類抗體的片段、以及包含抗體結合結構域的遺傳構建體。
可以使用保留了上述特異性結合試劑標準的任何抗體片段。使用現(xiàn)有技術水平方法產生抗體，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)全書，尤其第43-78頁；Elsevier，Amsterdam)中所說明的。另外，熟練的技術人員充分認識到，以免疫吸附劑為基礎的方法可以用于抗體的特異性分離。使用這些方法，可以加強多克隆抗體的質量并因此加強其在免疫測定中的性能(Tijssen，P.，見上，第108-115頁)。
為達到在本發(fā)明中公開的成績，已使用在兔中產生的多克隆抗體。然而，顯然也可以使用來自不同物種，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗體，以及單克隆抗體。由于具有恒定特征的單克隆抗體能夠以任何需要量產生，所以它們代表了臨床常規(guī)測定開發(fā)中的理想工具。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，ASC的單克隆抗體的產生和使用是另一個優(yōu)選的實施方案。
技術人員現(xiàn)在將理解，ASC已鑒定為用于CRC診斷中的標記，可以使用可選的途徑以達到能夠與本發(fā)明成績相比的結果。例如，可以使用可選的策略以產生抗體。除了別的的以外，這些策略包含使用合成肽，該肽代表用于免疫的ASC表位?；蛘撸梢允褂肈NA免疫接種，也稱為DNA疫苗接種。
為了測量，在適于形成結合試劑ASC-復合物的條件下，將從個體獲得的液體樣品與ASC特異性結合試劑溫育。由于技術人員不進行任何創(chuàng)造性努力就可以輕易地確定這類適宜的溫育條件，所以這樣的條件無需說明。
作為本發(fā)明公開的方法的最后步驟，測量復合物的量，并將其與CRC的診斷關聯(lián)。技術人員將理解，測量特異性結合試劑ASC-復合物量的許多方法都在有關教科書中得到詳細說明(參閱，例如TijssenP.，見上，或Diamandis等編(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)。
優(yōu)選以夾心型測定形式檢測ASC。在這類測定中，使用第一種特異性結合試劑將ASC捕獲于一側，且在另一側使用第二種特異性結合試劑，該試劑經過標記，可以直接或間接檢測。
如上所述，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以在從個體樣品獲得的液體樣品中測量ASC。在CRC評價中，不需要組織和活組織檢查樣品來應用標記ASC。
在優(yōu)選的實施方案中，以血清為液體樣品材料，實施根據(jù)本發(fā)明的方法。在另一個優(yōu)選的實施方案中，以血漿為液體樣品材料，實施根據(jù)本發(fā)明的方法。在另一個優(yōu)選的實施方案中，以全血為液體樣品材料，實施根據(jù)本發(fā)明的方法。
另外，也可以使用技術人員已知的各種方法準備糞便，以產生液體樣品。這些由糞便產生的液體樣品也代表了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
本發(fā)明的發(fā)明人已經令人驚訝地能在體液樣品中檢測到蛋白ASC。更驚訝的是，他們能夠證實，ASC在從個體獲得的液體樣品中的存在可以與結腸直腸癌評價關聯(lián)。優(yōu)選地，ASC抗體用于定性(ASC是否存在)或定量(確定ASC的量)免疫測定。
已經證實，測量蛋白ASC的水平在CRC領域非常有用。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及作為標記分子的蛋白ASC在從個體得到的液體樣品評價結腸直腸癌中的用途。
診斷的理想場景是這樣的情形，其中單一事件或過程會造成各種疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情況下，正確的診斷可能非常困難，尤其當疾病的病因學不能完全理解時，如在CRC的情況下。如熟練的技術人員將明白的，對于給定的疾病，例如在CRC領域中，沒有生物化學標記的診斷是100％特異性且同時100％靈敏性的。相反地，使用生物化學標記來以某種可能性或預測值評價疾病的存在與否。因此，在常規(guī)的臨床診斷中，通常綜合考慮各種臨床癥狀和生物學標記來診斷、治療和拉制潛在的疾病。
可以單獨地測定生物化學標記，或者，在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，可以使用基于芯片或珠的陣列技術，同時測量它們。然后，使用每種標記的單獨截止值，獨立地解釋生物標記的濃度，或者可以組合它們進行解釋。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，在包含下述步驟的方法中，進行根據(jù)本發(fā)明的結腸直腸癌的評價a)測量樣品中ASC的濃度，b)任選地測量樣品中結腸直腸癌的一種或多種其它標記，和c)使用在步驟(a)中測定的濃度和任選的在步驟(b)中測定的濃度，評價結腸直腸癌。
優(yōu)選地，通過測量ASC濃度和一種或多種其它標記的濃度，并使用ASC濃度和一種或多種其它標記的濃度評價CRC，來進行評價CRC的方法。
本發(fā)明也涉及通過生物化學標記體外評價CRC的方法，其包含，測量樣品中ASC的濃度和CRC的一種或多種其它標記的濃度，并使用測定的濃度評價CRC。
根據(jù)實施例部分顯示的數(shù)據(jù)，標記ASC在單變量分析(在約90％的特異性)中對CRC具有54.7％的靈敏性。在CRC的評價中，標記ASC在一個或多個下述方面是有益的篩選；診斷輔助；預后；化療的監(jiān)控，和隨訪。
篩選CRC是發(fā)達國家男性和女性的第二最常見的惡性腫瘤。因為它的高患病率、它的長期無癥狀階段和存在惡化前病變，CRC滿足許多篩選標準。顯然，與FOB測試或內窺鏡檢查相比，具有可接受的靈敏性和特異性的血清腫瘤標記更適用于篩選。
實施例部分給出的數(shù)據(jù)證實，單獨的ASC不足以允許進行普通篩選，例如，有危險患CRC的群體。最可能地，循環(huán)中的單個生物化學標記不能滿足篩選目的所要求的靈敏性和特異性標準。相反，必須預見到在CRC篩選中必須使用標記組。在本發(fā)明中確立的數(shù)據(jù)表明，標記ASC將形成適用于篩選目的的標記組的主要部分。本發(fā)明因此涉及ASC作為用于CRC篩選目的的CRC標記組的一種標記的用途。本發(fā)明的數(shù)據(jù)還表明，標記的某些組合在CRC的篩選中是有利的。因此，本發(fā)明還涉及包含ASC和CYFRA21-1的標記組、或包含ASC和NSE的標記組、或包含ASC和CYFRA21-1和NSE的標記組在篩選CRC目的中的用途。
診斷輔助手術前的CEA值具有有限的診斷價值。盡管如此，歐洲腫瘤標記委員會(European Committee on Tumor Markers)(ECTM)建議，應當在外科手術前測量CFA，以確立基線值和評價預后。因為根據(jù)本發(fā)明的數(shù)據(jù)，ASC作為單一標記可能至少是與CEA一樣好的單一標記或甚至更優(yōu)越，所以必須預見到，ASC可以用作診斷輔助，尤其是通過在外科手術前確立基線值。
本發(fā)明因而也涉及ASC在CRC外科手術前確立基線值中的用途。
預后確定CRC患者的預后的黃金標準是，Dukes氏定義的疾病的擴展、TNM或其它分期系統(tǒng)，如果要將標記(例如CEA)用于預測結果，它必須提供比現(xiàn)有的分期系統(tǒng)所提供的更強的預后信息，提供獨立于現(xiàn)有系統(tǒng)的信息，或提供在由現(xiàn)有標準定義的特定亞群內的預后數(shù)據(jù)，例如在Dukes氏B或結節(jié)陰性的患者中。
最近，美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee onCancer)(AJCC)一致會議提出，CEA應當加入結腸直腸癌的TNM分期系統(tǒng)中。應當如下命名CEA水平CX，不能評價CEA；CO，CEA未升高(＜5μg/l)，或CEA1，CEA升高(＞5μg/l)(Compton，C.，等，Cancer 88(2000)1739-1757)。
由于單獨的ASC明顯有助于區(qū)分CRC患者和健康對照或健康對照+非惡性的結腸疾病，所以必須預見到，它將輔助評價患有CRC的患者的預后。手術前的ASC水平最可能與CRC的一種或多種其它標記和/或TNM分期系統(tǒng)相組合，如AJCC為CEA所提議的。在優(yōu)選的實施方案中，ASC用于CRC患者的預后。
化療的監(jiān)控許多報告已經描述了CEA在監(jiān)控晚期CRC患者的治療中的用途(綜述見，Refs.Duffy，M.J.，Clin.Chem.47(2001)625-630；Fletcher，R.H.，Ann.Int.Med.104(1986)66-73；Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)。其中的大多數(shù)是回顧性的、非隨機化的，且包含少數(shù)患者。這些研究表明a)CEA水平降低同時接受化療的患者通常具有比CEA水平不降低的那些患者更好的結果，和(b)對于幾乎所有的患者，CEA水平的升高與疾病進展有關。
由于實施例部分顯示的數(shù)據(jù)，所以必須預見到，在化療的監(jiān)控方面，ASC將至少是與CEA一樣好的標記。本發(fā)明因此也涉及ASC用于監(jiān)控處于化療中的CRC患者的用途。
隨訪大約50％經歷外科手術切除的患者的目的是治愈、轉移性疾病的更遲復發(fā)(Berman，J.M.，等，Lancet 355(2000)395-399)。這些復發(fā)的大多數(shù)在診斷的前2-3年內發(fā)生，且通常局限在肝、肺或局部區(qū)域(locoregional area).由于復發(fā)性/轉移性疾病總是致命的，所以大量的研究已經集中在它的早期鑒別上，以及因而潛在地可治療的階段。結果，許多這樣的患者經歷手術后的監(jiān)護計劃，這經常包括使用CEA的常規(guī)監(jiān)控。
已經顯示，使用CEA的系列監(jiān)控以約80％的靈敏性和約70％的特異性檢測復發(fā)性/轉移性疾病，并提供5個月的平均超前時間(lead-time)(綜述見，Duffy，M.J.，等，同上，和Fletcher，R.H.，同上)。而且，CEA是無癥狀患者的復發(fā)的最常見的指示劑(Pietra，N.，等，Dis.Colon Rectum 41(1998)1127-1133和Graham，R.A.，等，Ann.Surg.228(1998)59-63)，且在檢測潛在地可治愈的復發(fā)性疾病方面，比放射學更節(jié)省成本。關于復發(fā)/轉移的位點，CEA對于肝轉移的檢測最靈敏(幾乎100％)。另一方面，CEA對于診斷局部區(qū)域的復發(fā)不太可靠，靈敏性僅僅是約60％(Moertel，C.G.，等，Jama 270(1993)943-7)。
作為患者便利、疾病檢測的成本和效率之間的折衷，EGTM組和ASCO組一樣(Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)提出，在原始診斷后，可以每2-3個月進行一次CEA測試，持續(xù)至少3年。3年后，以更低的頻率進行測試，例如每6個月。但是沒有證據(jù)支持該測試頻率。
如上面關于現(xiàn)有技術水平的討論所表明的，外科手術后CRC患者的隨訪是適當生物化學標記的最重要的應用領域之一。由于ASC在研究的CRC患者中的高靈敏性，所以預見到單獨的或與一種或多種其它標記相聯(lián)合的ASC將極大地有助于CRC患者的隨訪，尤其是外科手術后CRC患者的隨訪。包含ASC和CRC的一種或多種其它標記的標記組在CRC患者的隨訪中的用途，代表本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案。
本發(fā)明公開了，且因此在優(yōu)選的實施方案中涉及，ASC分別在CRC的診斷領域或在CRC的評價中的用途。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及與結腸直腸癌的一種或多種標記分子相聯(lián)合的作為結腸直腸癌的標記分子的ASC在從個體得到的液體樣品評價結腸直腸癌中的用途。在這點上，表述“一種或多種”代表1-20，優(yōu)選1-10，優(yōu)選1-5，更優(yōu)選3或4。ASC和一種或多種其它標記形成CRC標記組。
因而，本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案是，與結腸直腸癌的一種或多種標記分子相聯(lián)合的作為結腸直腸癌的標記分子的ASC在從個體得到的液體樣品評價結腸直腸癌中的用途?？梢耘cASC的測量相組合的優(yōu)選選擇的其它CRC標記是NSE、CYFRA21-1、NMMT、CA19-9、CA72-4和/或CEA。進一步優(yōu)選地，在CRC的評價中使用的標記組包含ASC和選自NSE、CYFRA21-1和NMMT的至少一種其它標記分子。
在下面更詳細地討論了優(yōu)選地與ASC相組合或形成包含ASC的CRC標記組的部分的標記。
NSE(神經元特異性烯醇化酶)糖酵解酶烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油酸水解酶，EC4.2.1.11，分子量約80kD)以多種二聚體同工型存在，其包含3種免疫學上不同的亞基，稱作α、β和γ。烯醇化酶的α-亞基存在于哺乳動物的許多類型的組織中，而β-亞基主要見于心臟和橫紋肌肉系統(tǒng)中。烯醇化酶同工型αγ和γγ稱作神經元特異性烯醇化酶(NSE)或γ-烯醇化酶，主要在神經元和神經內分泌細胞以及源自它們的腫瘤中可以高濃度地檢測到(Lamerz R.，NSE(Neuronen-spezifische Enolase)，γ-Enolase.InThomas L(ed)Clinical Laboratory Diagnosis，TH-Books，F(xiàn)rankfurt，1stEnglish Edition 1998979-981，5.deutsche Auflage 19981000-1003)。
NSE被描述為監(jiān)控小細胞支氣管癌的首選標記(Lamerz R.，同上)，而對于非小細胞支氣管癌，CYFRA21-1優(yōu)于NSE(Ebert W.，等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem 32(1994)189-199)。
升高的NSE濃度見于60-81％小細胞支氣管癌病例中。
NSE與轉移的位點或腦轉移沒有關聯(lián)，但是與臨床病期(即疾病的程度)有好的關聯(lián)。
作為對化療的響應，首個治療周期后24-72小時，NSE水平暫時升高，其原因是腫瘤細胞的溶解。在此后一周內或在首個治療周期結束時，血清值快速降低(其在治療前升高)。相反地，治療的非應答者表現(xiàn)出恒定升高的水平，或不能落入?yún)⒖挤秶鷥?。在緩解過程中，80-96％患者具有正常值。在復發(fā)的情況下，發(fā)現(xiàn)升高的NSE值。在有些情況下，該升高的發(fā)生具有1-4個月的潛伏期，且經常是指數(shù)的(倍增時間為10-94天)，且與存活時間段相關聯(lián)。在監(jiān)控小細胞支氣管癌的治療和疾病進程的過程中，NSE可以用作單一預后因子和活性標記診斷靈敏性93％，陽性預測值92％(Lamerz R.，同上)。
在成神經細胞瘤中，在62％患病兒童中發(fā)現(xiàn)超過30ng/ml的NSE血清值。中值隨疾病的病期而升高。病理性NSE值的量級或頻率和疾病病期之前存在顯著的關聯(lián)；與無病的存活存在負關聯(lián)。
68-73％精原細胞瘤患者具有臨床上顯著的NSE升高(LamerzR.，同上)。與該疾病的臨床進程存在有用的關聯(lián)。
NSE也已經在其它腫瘤中測量到在22％病例(在所有病期的癌)中，非肺的惡性疾病表現(xiàn)出大于25ng/ml的值。腦腫瘤(例如神經膠質瘤、腦膜瘤(miningioma)、神經纖維瘤和神經鞘瘤)僅僅有時伴有升高的血清NSE值。在原發(fā)性腦腫瘤或腦轉移和惡性黑素瘤和嗜鉻細胞瘤中，升高的NSE-值可以發(fā)生在CSF(腦脊液)中。對于14％限于器官的和46％轉移性腎癌，已經報道了升高的NSE濃度，其與作為獨立的預后因子的等級相關聯(lián)。
在良性疾病中，已經在良性肺病和腦病患者中發(fā)現(xiàn)了升高的血清NSE濃度(＞12ng/ml)。已經在腦血管腦膜炎、彌散性腦炎、脊髓小腦變性、腦缺血、腦梗死、腦內血腫、蛛網膜下腔出血、顱腦損傷、炎性腦病、器質性癲癇、精神分裂癥和Jakob-Creutzfeld病中發(fā)現(xiàn)了升高的值，主要在液體中(Lamerz R.，同上)。
根據(jù)生產商的說明書，使用Roche產品號12133113，已經在Elecsys分析儀上測量了NSE。
CA19-9糖抗原19-9使用單克隆抗體1116-NS-19-9，定義了測量的CA19-9值。測量了具有約10,000道爾頓的分子量的糖脂上的1116-NS-19-9-反應性決定簇。該粘蛋白相當于Lewis-a血型決定簇的半抗原，且是許多粘膜細胞的組分(Koprowski，H.，等，Somatic Cell Genet 5(1979)957-971)。
3-7％群體具有Lewis a-陰性的/b-陰性的血型構型，且不能表達具有反應性決定簇CA19-9的粘蛋白。當解釋該發(fā)現(xiàn)時，必須予以考慮。
粘蛋白發(fā)生在胎兒胃、腸和胰上皮中。低濃度也可見于肝、肺和胰的成年組織中(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，BoeringerMannheim，目錄號1536869(engl)，1320947(dtsch).ISBN 3-926725-07-9 dtsch/engl.，Juergen Hartmann Verlag，Marloffstein-Rathsberg(1993)；Herlyn，M.，等，J.Clin.Immunol 2(1982)135-140)。
CA19-9測定值可以輔助有差別地診斷和監(jiān)控胰癌患者(靈敏性70-87％)(Ritts，R.E.，Jr.，等，Int.J.Cancer 33(1984)339-345)。腫瘤塊和CA 19-9測定值之間沒有關聯(lián)。但是，具有大于10,000U/mL的CA19-9血清水平的患者幾乎總是具有遠端轉移。
CA19-9的測定不能用于胰癌的早期檢測(Steinberg，W.M.，等，Gastroenterology 90(1986)343-349)。
在肝膽癌中，CA19-9值提供50-75％的靈敏性。在胃癌的情況下，推薦同時測定CA72-4和CEA。在結腸直腸癌中，單獨測定CEA是足夠的；僅僅在罕見的CEA-陰性的情況下，CA19-9的測定是有用的。
由于粘蛋白排它地通過肝排泄，所以在有些情況下，甚至輕微的膽汁郁積也導致明顯升高的CA19-9血清水平。升高的CA19-9值也見于許多良性和炎性的胃腸道和肝疾病中，以及囊性纖維化中。
根據(jù)生產商的說明書，使用Roche產品號11776193，已經在Elecsys分析儀上測量了CA19-9。
CEA癌胚抗原CEA是一種單體糖蛋白(分子量約180.000道爾頓)，其含有約45-60％的可變糖組分(Gold，P.和Freedman，S.O.，J.Exp Med 121(1965)439-462)。
CEA，如AFP，屬于在胚胎和胎兒時間段生成的癌胎(carcinofetal)抗原組。CEA基因家族由2個亞組中的約17個活性基因組成。第一組含有CEA和非特異性的交叉反應抗原(NCA)；第二組含有妊娠特異性的糖蛋白(PSG)。
CEA主要見于胎兒胃腸道和胎兒血清。它也以微量存在于健康成年人的腸、胰和肝組織中。出生后，CEA的形成受到抑制，且因此在健康成年人中幾乎難以測量到血清CEA值。
在結腸直腸腺癌的情況下，經常發(fā)現(xiàn)高CEA濃度(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。輕微至中等CEA升高(很少＞10ng/mL)發(fā)生在20-50％腸、胰、肝和肺的良性疾病中(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、潰瘍性結腸炎、Crohn氏病、肺氣腫)(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。吸煙者也具有升高的CEA值。
CEA測定的主要指示是結腸直腸癌的隨訪和治療控制。
不推薦CEA測定用于一般群體的癌癥篩選。正常范圍內的CEA濃度不能排除惡性疾病的可能存在。
在Roche Diagnostics生產的測定中的抗體與CEA反應，且與胎糞抗原(NCA2)反應(如同幾乎所有的CEA方法一樣)。與NCA1的交叉反應性是0.7％(Hammarstrom，S.，等，Cancer Res.49(1989)4852-4858和Bormer，O.P.，Tumor Biol.12(1991)9-15)。
根據(jù)生產商的說明書，使用Roche產品號11731629，已經在Elecsys分析儀上測量了CEA。
CYFRA21-1“CYFRA21-1”的測定特異性地測量存在于循環(huán)中的細胞角蛋白19的可溶片段。CYFRA 21-1的測量通常是基于兩種單克隆抗體的(Bodenmueller，H.，等，Int.J.Biol.Markers 9(1994)75-81)。在來自德國Roche Diagnostics的CYFRA 21-1測定中，使用了兩種特異性的單克隆抗體(KS19.1和BM19.21)，并測量具有約30,000道爾頓分子量的細胞角蛋白19的可溶片段。
細胞角蛋白是形成上皮中間絲的亞基的結構蛋白。迄今已經鑒別出20種不同的細胞角蛋白多肽。由于它們的特異性分布模式，它們非常適用作腫瘤病理學的區(qū)分標記。完整的細胞角蛋白多肽溶解度低，但是在血清中可以檢測到可溶片段(Bodenmueller，H.，等，同上)。
CYFRA21-1是非小細胞肺癌(NSCLC)的非常確定的標記。CYFRA 21-1的主要指示是監(jiān)控非小細胞肺癌(NSCLC)的進程(Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
高CYFRA21-1血清水平指示著非小細胞肺癌患者的晚期腫瘤病期和較差預后(van der Gaast，A.，等，Br.J.Cancer 69(1994)525-528)。正常的或僅僅輕微升高的值不能排除腫瘤的存在。
CYFRA21-1血清水平快速下降至正常范圍，證明成功的治療。恒定的CYFRA21-1值或CYFRA21-1值的輕微的或僅僅緩慢的降低，指示著腫瘤的不完全去除、或具有對應的治療和預后結果的多種腫瘤的存在。通過升高的CYFRA21-1值，經常可以比臨床癥狀學和成像方法更早地顯示疾病的進展。
已經接受，肺癌的初步診斷應當基于臨床癥狀學、成像或內窺鏡方法和手術中的發(fā)現(xiàn)。肺中不清楚的圓形病灶以及＞30ng/mL的CYFRA21-1值，以高可能性指示著原發(fā)性支氣管癌的存在。
CYFRA21-1也適用于肌侵入性(myoinvasive)膀胱癌的進程監(jiān)控。相對于良性肺病(肺炎、結節(jié)病、結核病、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫)，CYFRA21-1表現(xiàn)出良好的特異性。
輕微升高的值(最高達10ng/mL)罕見于明顯的良性肝病和腎衰竭中。與性別、年齡或吸煙無關。CYFRA21-1的值也不受妊娠的影響。
最近已經發(fā)現(xiàn)，CYFRA21-1也可以在乳腺癌領域中用于檢測疾病復發(fā)和評價治療功效(Nakata，B.，等，British J.of Cancer(2004)1-6)。
根據(jù)生產商的說明書，使用Roche產品號11820966，已經在Elecsys分析儀上測量了CYFRA21-1。
如上面進一步提及的，CYFRA21-1是NSCLC領域的確定的標記。當開發(fā)和確立NSCLC的CYFRA21-1時，已經使用了源自某些非惡性肺病患者的非惡性疾病對照。已經認為，這對于區(qū)分良性和惡性肺病是重要的(H.Bodenmüller，等，同上)。
僅僅最近才可能檢測源自CRC患者的樣品中的顯著百分比的標記CYFRA21-1.另外，CYFRA21-1在從個體得到的這種液體樣品中的存在，可以用于評價結腸直腸癌。特別地，認為與其它標記CYFRA21-1的組合是CRC領域非常有用的標記。
NNMT蛋白煙酰胺N-甲基轉移酶(NNMT；Swiss-PROTP40261)具有29.6kDa的表觀分子量和5.56的等電點。
NNMT催化煙酰胺和其它吡啶的N-甲基化。該活性對于許多藥物和異生素化合物的生物轉化是重要的。據(jù)報道，該蛋白主要在肝中表達，并位于細胞質中。已經從來自人肝的cDNA克隆了NNMT，且其含有792-核苷酸可讀框，其編碼具有29.6kDa的計算分子量的264-氨基酸蛋白(Aksoy，S.，等，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。關于該酶在人癌癥中的潛在作用，文獻中知之甚少。在一篇論文中，將升高的肝NNMT酶活性報道為小鼠癌性惡病質的標記(Okamura，A.，等，Jpn.J.Cancer Res.89(1998)649-656)。在一篇近期的報告中，證實了在輻射敏感的細胞系中，輻射引起的NNMT基因的下調(Kassem，H.，等，Iht.J.Cancer 101(2002)454-460)。
最近已經發(fā)現(xiàn)(WO 2004/057336)，NNMT可以用于評價CRC。在WO 2004/057336中描述的免疫測定，已經用于測量本研究的樣品(CRC，健康對照和非惡性結腸病)。
如熟練的技術人員會明白的，存在許多使用兩種或更多種標記的測量的方式，以改善在研究中的診斷問題。在一個非常簡單的、但是仍然經常有效的方案中，如果樣品對至少一種研究的標記是陽性的，則假定是陽性結果。這可以是例如當診斷感染性疾病(如AIDS)時的情況。
但是，經常地，評價標記的組合。優(yōu)選地，數(shù)學地組合為標記組的標記(例如ASC、CYFRA21-1和NSE)測得的值，并將組合的值與潛在的診斷問題相關聯(lián)。通過任何適當?shù)默F(xiàn)有技術水平數(shù)學方法，可以組合標記值。眾所周知的將標記組合與疾病相關聯(lián)的數(shù)學方法使用下述方法，如判別式分析(DA)(即線性的-、二次的-、規(guī)則化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非參數(shù)方法(即k-最近鄰分類符)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(即邏輯回歸、CART、隨機森林(Random Forest)方法、Boosting/Bagging方法)、廣義線性模型(即邏輯回歸)、基于主組分的方法(即SIMCA)、廣義累加模型、基于模糊邏輯的方法、基于神經網絡和遺傳算法的方法。熟練的技術人員會無問題地選擇適當?shù)姆椒▉碓u價本發(fā)明的標記組合。優(yōu)選地，用于將本發(fā)明的標記組合與例如是否存在CRC相關聯(lián)的方法選自DA(即線性的-、二次的-、規(guī)則化的判別式分析)、Kernel方法(即SVM)、非參數(shù)方法(即k-最近鄰分類符)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(即邏輯回歸、CART、隨機森林方法、Boosting方法)或廣義線性模型(即邏輯回歸)。關于這些統(tǒng)計學方法的細節(jié)，參見下面的文獻Ruczinski，I.，等，J.of Computational and GraphicalStatistics，12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the AmericanStatistical Association 84(1989)165-175；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，F(xiàn)riedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics，2001；Breiman，L.，F(xiàn)riedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.(1984)Classification and regression trees，CaliforniaWadsworth；Breiman，L.，Random Forests，MachineLearning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation ofMedical Tests for Classification and Prediction，Oxford StatisticalScience Series，28(2003)；和Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，2nd Edition(2001)。
本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案是，使用生物學標記的潛在組合的最優(yōu)化的多變量截止值，并辨別狀態(tài)A和狀態(tài)B，例如病態(tài)和健康。在這類分析中，標記不再是獨立的，而是形成標記組?？梢源_定，組合ASC、NSE和CYFRA 21-1的測量，確實與健康對照相比，或者，如也評價的，與健康對照加非惡性疾病對照相比，特別地提高CRC診斷準確度。特別地，后一發(fā)現(xiàn)非常重要，因為非惡性疾病患者可能要求與CRC患者完全不同的治療。
測試的精確性最好由其接收器工作特性(ROC)說明(特別見Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲線圖是在整個觀察數(shù)據(jù)范圍內連續(xù)變化決定閾值(decisionthresh-hold)產生的所有靈敏性/特異性對的圖。
實驗室檢驗的臨床性能依賴于其診斷精確性、或將受試者正確分類為臨床相關亞群的能力。診斷精確性測量了檢驗將研究的受試者的兩種不同狀況正確區(qū)分的能力。這類狀況為例如健康和疾病或良性對惡性疾病。
在每個病例中，ROC圖通過在決定閾值的全部范圍將靈敏性對1-特異性作圖，描述了兩種分布之間的重疊。在y軸上是靈敏性或真陽性率[定義為(真陽性試驗結果數(shù))/(真陽性數(shù)+假陰性試驗結果數(shù))]。它也指疾病或狀況存在的確定性。它從受影響的亞群單獨計算。在x軸上是假陽性率或1-特異性[定義為(假陽性結果數(shù))/(真陰性數(shù)+假陽性結果數(shù))]。它是特異性的指標，并完全從未受影響的亞群計算。因為使用來自兩個不同亞群的檢驗結果，完全獨立地計算真和假陽性率，所以ROC圖不依賴于樣品中疾病的患病率。ROC圖上的每點代表對應于特定決定閾值的靈敏性/1-特異性對。具有最佳辨別力的檢驗(在結果的兩個分布中沒有重疊)具有經過左上角的ROC圖，在左上角，真陽性率為1.0，或者100％(理想的靈敏性)，且假陽性率為0(理想的特異性)。沒有辨別力的檢驗的理論圖(兩組結果的同樣分布)為從左下角至右上角的45°對角線。大多圖介于這兩個極端之間。(如果ROC圖完全落在45°對角線之下，則容易通過將“確定性”標準從“高于”反轉為“低于”來矯正這種情況，反之亦然。)從定性上，圖越接近左上角，檢驗的總精確度就越高。
定量實驗室檢驗診斷精確度的一個方便的目標是通過單獨的數(shù)字表達其性能。最普通的全面測量是ROC圖下的面積。按照慣例，該面積總是≥0.5(如果不是，則可以反轉決定規(guī)則使其≥0.5)。值在1.0(兩組檢驗值的理想分離)和0.5(在兩組檢驗值之間沒有明顯的分布差異)之間變化。該面積不僅依賴于該圖的特定部分，例如最接近對角線的點或在90％特異性的靈敏性，也依賴于全圖。這是對ROC圖有多么接近理想ROC圖(面積＝1.0)的定量的說明性表達。
組合測量ASC和其它新近發(fā)現(xiàn)的標記(如CYFRA21-1或NMMT)或已知的標記(如CEA和NSE)或其它待發(fā)現(xiàn)的CRC標記，分別導致且將導致CRC評價的其它提高。
三種標記ASC、CYFRA21-1和NSE的組合，顯著提高CRC的診斷準確度。
提供下列實施例、參考文獻、序列表和附圖以幫助對本發(fā)明的理解，其真實范圍于附加的權利要求中提出。應當理解，可以在不偏離本發(fā)明精神的情況下，在提出的方法中進行修飾。


圖1該圖顯示了以乳腺腫瘤樣品上樣的二維凝膠(左側)，和以匹配的對照樣品上樣的凝膠(右側)。這些凝膠放大部分中的圓形指示蛋白ASC的位置。在健康組織中，以同樣的方法不能檢測到該蛋白。ASC在二維凝膠中遷移，對應的等電點為約pH6，且表觀分子量為約22kDa。
圖2根據(jù)表1的對照患者的血清和血漿樣品(見實施例4)中的ASC定量的分布。A疾病對照，n＝87；B健康對照，n＝317。圖中的水平線指示著597pg/ml的截止值。
圖3ASC的測量值的分布。關于對照患者的集合，截止值線對應著597pg/ml和90％的特異性(表1)。AUICC I，n＝33；BUICC II，n＝23；CUICC III，n＝21；DUICC IV，n＝23；E腺瘤，n＝27。
圖4CEA的測量值的分布。關于對照患者的集合，截止值線對應著4ng/ml和90％的特異性(表1)。AUICC I，n＝33；BUICCII，n＝23；CUICC III，n＝21；DUICC IV，n＝23；E腺瘤，n＝28.
圖5該圖顯示了ASC的ROC-曲線結腸直腸癌對健康對照(實線；ROC88％)，結腸直腸癌對健康對照和疾病對照(虛線；ROC83％)和結腸直腸癌對健康對照、疾病對照和其它癌癥。x-軸指示著通過從1減去特異性值計算出的值。y-軸指示著靈敏性。在兩種情況下，1的值對應100％。結腸直腸癌109樣品。健康對照317樣品。疾病對照87樣品。其它癌癥272樣品。
圖6該圖顯示了ASC、CYFRA21-1和NNMT的ROC-曲線結腸直腸癌對健康對照和疾病對照。ASC由實線指示，CYFRA21-1由點線指示，而NNMT由虛線指示。x-軸指示著通過從1減去特異性值計算出的值。y-軸指示著靈敏性。在兩種情況下，1的值對應100％。結腸直腸癌109樣品。健康對照317樣品。疾病對照87樣品。其它癌癥272樣品。
圖7該圖顯示了ASC、CEA、CA19-9和NSE的ROC-曲線結腸直腸癌對健康對照和疾病對照。ASC由實線指示，CEA由點線指示，CA19-9由虛線指示，NSE由不規(guī)則的虛線指示。x-軸指示著通過從1減去特異性值計算出的值。y-軸指示著靈敏性。在兩種情況下，1的值對應100％。結腸直腸癌109樣品。健康對照317樣品。疾病對照87樣品。其它癌癥272樣品。
具體實施例方式
縮寫ABTS2，2’-疊氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽BSA 牛血清清蛋白cDNA互補DNACHAPS (3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸鹽)DMSO二甲亞砜
DTT 二硫蘇糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定HRP 辣根過氧化物酶IAA 碘乙酰胺IgG 免疫球蛋白GIEF 等電聚焦IPG 固定pH梯度LDS 十二烷基硫酸鋰MALDI-TOF基質輔助的激光解吸/電離-飛行時間質譜MES 基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳PBS 磷酸緩沖鹽水PI 等電點RTS 快速翻譯體系SDS 十二烷基硫酸鈉實施例1鑒定作為可能的癌標記的ASC使用來自乳腺腫瘤患者的患病組織和正常組織的樣品初步驗證ASC后，檢驗其它癌癥、且尤其是結腸直腸癌的標記(見下面的表6)。另外，分析了來自結腸直腸癌患者的血清和血漿樣品。結果，對于這類癌癥，數(shù)據(jù)顯示了ASC作為生物化學標記的效用。
實施例2產生標記蛋白ASC的抗體產生癌癥標記蛋白ASC的多克隆抗體，用于進一步通過免疫檢測測定，例如蛋白印跡和ELISA，使用所述抗體測量ASC的血清和血漿和血液水平。
重組蛋白表達和純化為了產生ASC抗體，進行該蛋白的重組表達以獲得免疫原。使用RTS100表達系統(tǒng)和大腸桿菌(E.coli)的組合，進行表達。在第一步中，分析DNA序列，并使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系統(tǒng)獲得高產量cDNA沉默突變變體推薦和各自的PCR引物序列。該系統(tǒng)是以網絡為基礎的商業(yè)服務(www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對，利用“RTS 100 E.coli Linear Template GenerationSet，His-tag”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國，Cat.No.3186237)系統(tǒng)，從cDNA產生線性PCR模板，以用于編碼ASC蛋白的核苷酸序列的體外轉錄和表達。對于蛋白印跡檢測和隨后的純化，表達的蛋白含有His-標記。鑒定最佳的表達變體。根據(jù)生產商的說明書執(zhí)行從PCR到表達和檢測的所有步驟。根據(jù)生產商的說明書，將各自的PCR產物克隆到pBAD TOPO載體(Invitrogen，Karlsruhe，德國，Cat.No.K 4300/01)中，所述PCR產物含有所有必需的T7調節(jié)區(qū)域(啟動子、核糖體結合位點和T7終止子)。對于使用T7調節(jié)序列的表達，將構建體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中(Studier，F(xiàn).W.等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)，且分批培養(yǎng)轉化的細菌以表達蛋白，每批1L。
按照標準程序，在Ni-螯合柱上進行His-ASC融合蛋白的純化。簡要地說，通過離心，將1 L含有His-ASC融合蛋白表達載體的細菌培養(yǎng)物沉淀。在裂解緩沖液中將細胞沉淀重懸，隨后使用Ultra-Turrax勻漿，所述裂解緩沖液含有磷酸鹽，pH8.0，7M氯化胍(guadinium chloride)，咪唑和硫甘油。通過高速離心使不溶材料沉淀，并將上清液應用于Ni螯合層析柱。使用幾個床體積的裂解緩沖液洗滌柱子，隨后使用含有磷酸鹽，pH8.0和尿素的緩沖液洗滌。最后，在酸性條件下，使用含有SDS的磷酸鹽緩沖液洗脫結合的抗原。
合成血藍蛋白-肽-綴合物，以用于產生抗體使用異雙功能化學(馬來酰亞胺/SH-化學)進行合成。將選擇的含有半胱氨酸的ASC-肽偶聯(lián)到來自似鮑羅螺(Concholepasconcholepas)的3-馬來酰亞胺基己?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MHS)激活的血藍蛋白(Sigma，B-8556)上。
在100mM NaH2PO4/NaOH，pH7.2中，制備10mg/ml的血藍蛋白。每ml血藍蛋白中加入100μl MHS(12.3mg，溶于DMSO中)，并溫育1小時。對100mM NaH2PO4/NaOH，pH6.5透析樣品過夜，并用透析緩沖液調至6mg/ml。將選擇的含有半胱氨酸的ASC-肽溶于DMSO(對于1500道爾頓的肽，5mg/ml)。每ml MHS-激活的血藍蛋白(6mg/ml)加入20μl 100mM EDTA，pH7.0和100μl選擇的含有半胱氨酸的ASC-肽。1小時后，通過每ml反應混合物中加入10μl 0.5M半胱氨酸/HCl，封閉剩余的馬來酰亞胺基團。該制劑不經進一步純化，用于免疫接種。
重組融合蛋白表達和純化為了產生ASC抗體，進行SlyD-ASC融合蛋白的重組表達以獲得免疫原，這類似于Scholz，C.，等，J.Mol.Biol.345(2005)1229-1241所述的方法。因此，構建了含有編碼SlyD-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHH的基因的表達載體。為了純化和蛋白印跡檢測，該構建體含有羧基末端His-標記(HHHHHH)。在SlyD和ASC之間，插入額外的GS-接頭((GGGS)5-GGG)和因子Xa的切割位點(IEGR)。在T5-啟動子控制下的大腸桿菌中進行表達。
在第一步中，使用載體pSO60(攜帶編碼SlyD-(GGGS)5-GGG-SlyD的表達盒的pET24)作為模板進行PCR。使用引物1(SEQID NO2)和引物2(SEQ ID NO3)，得到單SlyD，其分別攜帶在5’-末端的EcoRI-位點和核糖體結合位點、和在3’-末端的BamHI-位點、IEGR-編碼序列和SacI-位點。將產生的PCR-產物作為EcoRI/SacI-片段克隆進pQE80L(Qiagen，Hilden)，從而得到pQE80-SlyD。
其次，從作為模板的pBC14(攜帶ASC的pET24)擴增ASC。使用引物3(SEQ ID NO4)和引物4(SEQ ID NO5)，插入在5’-末端的BamHI-位點和IEGR-編碼序列、以及在3’-末端的GGGS-HHHHHH-編碼序列和額外的HindIII-位點。
將該PCR-產物作為BamHI/HindIII片段克隆進pQE80-SlyD，從而得到最終的表達構建體(pQE80-SlyD-ASC)。根據(jù)生產商的說明書，進行所有PCR-和克隆-步驟。
為了在T5啟動子控制下的表達，用最終構建體轉化大腸桿菌C600細胞(Stratagene，Heidelberg)。以每批1升，培養(yǎng)表達菌株，以用于蛋白生產。
按照標準程序，在Ni-螯合柱上進行His-SlyD-ASC融合蛋白的純化。簡要地說，通過離心，將1L含有SlyD-ASC-His-融合蛋白的表達載體的細菌培養(yǎng)物沉淀。將細胞沉淀重懸在裂解緩沖液中，隨后使用Ultra-Turrax勻漿，所述裂解緩沖液含有Tris/HCl，pH8，CHAPS，EDTA和溶菌酶。通過加入氯化鎂和DNA酶，酶促降解DNA。通過離心，沉淀內含體。將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液，pH8.0，7M氯化胍，并裝載于Ni-螯合柱上。用幾個床體積的磷酸鹽緩沖液，pH8.0，7M氯化胍，洗滌柱。然后，將磷酸鹽緩沖液，pH8.0，7M氯化胍替換為磷酸鹽緩沖液，pH8.0，NaCl，以誘導基質結合的蛋白的重新折疊。使用磷酸鹽緩沖液，pH8.0，NaCl，咪唑，洗脫重新折疊的融合蛋白。
抗ASC單克隆抗體的生產a)小鼠的免疫接種使用100μg ASC、融合蛋白或血藍蛋白-肽-綴合物(見上面)腹膜內初次免疫12周齡A/J小鼠。初次免疫六周后，繼之以另外兩次腹膜內免疫，這兩次免疫間隔一個月。在此過程中，向每只小鼠施用吸附至氫氧化鋁的100μg ASC或血藍蛋白-肽-綴合物、以及109個百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。隨后，在融合前第三和第二天，每只小鼠使用100μg ASC或血藍蛋白-肽-綴合物的PBS緩沖液溶液靜脈內進行最后兩次免疫。
b)融合和克隆將根據(jù)a)免疫的小鼠脾細胞與根據(jù)Galfre，G.和Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46的骨髓瘤細胞融合。在此過程中，將約1×108個免疫的小鼠脾細胞與2×107個骨髓瘤細胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并離心(10分鐘，300×g，4℃)。以不含胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基將細胞洗滌一次，并在50ml錐形管中于400×g再次離心。棄上清液，輕敲以溫和地松散細胞沉淀，經移液添加并混合1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)。于37℃水浴1分鐘后，于室溫在4-5分鐘時間段內逐滴添加5ml不含F(xiàn)CS的RPMI1640。然后在大約1分鐘內逐滴添加5ml含有10％FCS的RPMI1640，充分混合，以培養(yǎng)基(RPMI 1640+10％FCS)填充至50ml，隨后于4℃以400×g離心10分鐘。將沉淀的細胞置于含10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并接種于次黃嘌呤-重氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基(100mmol/l次黃嘌呤，1μg/ml重氮絲氨酸于RPMI 1640+10％FCS中)。白細胞介素6作為生長因子以100U/ml添加于培養(yǎng)基中。
約10天后，將原代培養(yǎng)物對特異性抗體進行檢驗。使用熒光激活細胞分選儀將ASC陽性原代培養(yǎng)物克隆到96孔細胞培養(yǎng)板中。在此過程中，白細胞介素6再次作為生長添加劑以100U/ml添加于培養(yǎng)基中。
c)從細胞培養(yǎng)物上清液中分離免疫球蛋白以每毫升1×105個細胞的密度，將獲得的雜交瘤細胞接種到含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，并于發(fā)酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，Order No.144-050)中增殖7天。在培養(yǎng)物上清液中獲得平均濃度為每毫升100μg的單克隆抗體。使用蛋白化學中的常規(guī)方法(例如根據(jù)Bruck，C.等，Methods inEnzymology 121(1986)587-695)，從培養(yǎng)物上清液中純化該抗體。
多克隆抗體的產生a)免疫接種為了免疫接種，以1∶1比率制備蛋白溶液(100μg/ml ASC、融合蛋白或血藍蛋白-肽-綴合物)和完全弗氏佐劑的新鮮乳劑。在1、7、14和30、60和90天，以1ml乳劑免疫各兔。抽出血液，并將所得的抗ASC血清用于實施例3和4中說明的進一步實驗。
b)通過辛酸和硫酸銨的依次沉淀，從兔血清純化IgG(免疫球蛋白G)以4體積乙酸鹽緩沖液(60mM，pH4.0)稀釋1體積兔血清。以2M Tris堿調節(jié)pH至4.5。在劇烈攪動下逐滴添加辛酸(25μl/ml稀釋樣品)。30分鐘后，將樣品離心(13000×g，30分鐘，4℃)，棄沉淀，并收集上清液。通過添加2M Tris堿將上清液pH調節(jié)至7.5并過濾(0.2μm)。
通過在劇烈攪動下逐滴添加4M硫酸銨溶液至2M的終濃度，將上清液中的免疫球蛋白沉淀。通過離心收集沉淀的免疫球蛋白(8000×g，15分鐘，4℃)。
棄上清液。以10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl溶解沉淀并徹底透析。將透析液離心(13000×g，15分鐘，4℃)并過濾(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中制備10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl生物素-N-羥基琥珀酰亞胺(3.6mg/ml溶于DMSO中)。于室溫30分鐘后，將樣品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上層析。收集含有生物素化IgG的級分。根據(jù)相同程序將單克隆抗體生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黃毒苷化(digoxygenylation)在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH7.5中制備10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl洋地黃毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Roche Diaghostics，Mannheim，德國，Cat.No.1333054)(3.8mg/ml溶于DMSO中)。于室溫30分鐘后，將樣品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上層析。收集含有洋地黃毒苷化的IgG的級分。根據(jù)相同程序，將單克隆抗體以洋地黃毒苷標記.
實施例3檢測人血清和血漿樣品中ASC的蛋白印跡使用德國Invitrogen，Karlsruhe的試劑和設備，進行SDS-PAGE和蛋白印跡。在還原NuPAGE(Invitrogen)LDS樣品緩沖液中1∶20稀釋人血漿樣品，并于95℃加熱5分鐘。在MES運行緩沖系統(tǒng)中的4-12％NuPAGE凝膠(Bis-Tris)上，運行10μl等分試樣。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE轉移緩沖系統(tǒng)，將凝膠分離的蛋白混合物印跡于硝化纖維素膜上。于PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌3次，并以SuperBlock封閉緩沖液(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)封閉。在SuperBlock封閉緩沖液中稀釋生物素化的第一抗體(0.01-0.2μg/ml)，并與膜溫育1小時。在PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌3次。使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP-綴合物(20mUABTS/ml，溶于SuperBlock封閉緩沖液中)，標記特異性結合的生物素化的第一抗體。溫育1小時后，在PBS/0.05％Tween-20中將膜洗滌3次。使用化學發(fā)光的底物(SuperSignal West Femto Substrate，Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)和放射自顯影膠片，檢測結合的鏈霉抗生物素蛋白-HRP-綴合物。曝光時間從10分鐘至過夜。
實施例4測量人血清和血漿樣品中ASC的ELISA為了檢測人血清或血漿中的ASC，開發(fā)了夾心法ELISA。為了捕獲和檢測抗原，分別使用生物素和洋地黃毒苷綴合等分試樣的抗ASC多克隆抗體(見實施例2)。
將鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔微孔滴定板與100μl生物素化的抗-ASC多克隆抗體溫育60分鐘，后者以10μg/ml溶于10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。溫育后，以0.9％NaCl，0.1％Tween 20將板洗滌3次。然后，將孔與作為標準抗原的重組蛋白(見實施例2)的連續(xù)稀釋液或稀釋的患者液體樣品溫育2小時。ASC結合后，使用0.9％NaCl，0.1％Tween-20將板洗滌3次。為了結合的ASC的特異性檢測，將孔與100μl洋地黃毒苷化的抗-ASC多克隆抗體溫育60分鐘，后者以10μg/ml溶于10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。此后，將板洗滌3次以去除未結合的抗體。在下一步中，在10mM磷酸鹽，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中，將孔與20mU/ml抗-洋地黃毒苷-POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德國，目錄號1633716)溫育60分鐘。隨后使用相同緩沖液將板洗滌3次。為了檢測抗原-抗體復合物，將孔與100μl ABTS溶液(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德國，目錄號11685767)溫育，并于30-60分鐘后使用ELISA讀出器在405nm測量OD。
實施例5標記評價，靈敏性和特異性；ROC分析，以評價關于診斷準確度的臨床效用通過分析從充分表征的患者群體得到的各液體樣品，評價準確度。對照集合A(見表1)含有317位個體，其包含271位血液供體和46位已經經過結腸鏡檢查的患者。對照集合B包含87位患有非癌性疾病的患者。
109位結腸直腸癌患者(集合C)包含不同病期的腫瘤(表2，表4)。而且，在分析中包含27個癌前病期樣品(集合D)。為了分析關于其它癌癥的特異性，在樣品群體中包含272位具有其它腫瘤的患者(集合E)。群體總結在表2中；表3提供了胃腸癌患者的細節(jié)。
通過ElecsysSystems免疫測定分析儀的可商業(yè)得到的測定(Roche Diagnostics，CA19-9-測定目錄號11776193，CYFRA21-1測定目錄號11820966，CEA-測定目錄號1731629)，測量CA19-9、CYFRA21-1和CEA。使用實施例4的方法和WO2004/057336所述的抗體，測量NNMT。已經開發(fā)了自制夾心免疫測定，以用于ASC的測量。該測定以微量滴定板的形式進行。使用鏈霉抗生物素蛋白-包被的微量滴定板。在該夾心測定中，使用生物素化的ASC多克隆抗體作為捕獲抗體，且使用洋地黃毒苷化的ASC多克隆抗體作為第二種特異性的結合配偶體。最后，通過抗-洋地黃毒苷辣根過氧化物酶綴合物和適當?shù)倪^氧化物酶底物，顯現(xiàn)形成的夾心復合物。
表1患者集合，對照

表2患者集合，癌癥患者


表3患者集合，具有其它胃腸癌癥的患者

表4結腸直腸癌-疾病的病期

圖2總結了用對照(表1)血清和血漿樣品得到的數(shù)據(jù)。該圖表明，比健康對照更多的疾病對照樣品表現(xiàn)出高ASC值?？紤]該發(fā)現(xiàn)，將截止值定義為所有對照(即健康和疾病對照)的90％百分位。
特別地關于疾病對照，表5對比了標記ASC的特異性和NNMT、CA19-9、CEA和CYFRA21-1的特異性。關于ASC，每種其它標記的截止值定義為所有對照的90％百分位。
表5ASC和其它腫瘤標記在疾病對照(患者集合B)中的特異性

通過測試診斷出患有其它癌癥的患者的血清和血漿樣品，評價ASC的特異性。將特異性與使用的其它標記相對比。表6總結了結果。
表6ASC和其它腫瘤標記關于其它癌癥(患者集合E)的特異性

為了評價ASC的靈敏性，分析診斷出患有不同病期的CRC的患者的血清和血漿樣品。表7a/b和8總結了結果。在圖3和圖4中，分別顯示了ASC和CEA的測量值的分布。
表7a關于結腸直腸癌的靈敏性

表7b關于癌前病期的靈敏性

根據(jù)Zweig，M.H.，和Campbell，同上，進行ROC分析。經曲線下面積(AUC)測量發(fā)現(xiàn)，ASC區(qū)分結腸直腸癌組和健康對照組中的患者的辨別能力(88％)，至少與測試的其它標記一樣好或甚至更好。當比較結腸直腸癌集合和所有對照(包括疾病對照)時，ASC的辨別能力仍然至少等于(即使不勝過)標記CYFRA 21-1。另外，ASC的辨別能力顯著勝過NNMT。結果參見表8和圖5和6。
表8ROC分析

從顯示的數(shù)據(jù)可以清楚看出，除了指示腫瘤以外，ASC在腸疾病對照中也升高。盡管對腸疾病對照的特異性更低，但結腸癌樣品和對照(健康+疾病)之間的區(qū)分勝過常規(guī)的腫瘤標記CEA和CA19-9。
實施例6標記組如實施例5所顯示的，對于作為結腸標記組的一個成員進行的評價，ASC是有前途的候選物，其與一種或多種其它標記相組合。為此，進行初步的多變量分析。
使用規(guī)則化的判別式分析(RDA)，它是普通判別式分析的一般化，即二次的-和線性的判別式分析(McLachlan，G.J.，DiscriminantAnalysis and Statistical Pattern Recognition，Wiley Series inprobability and mathematical statistics，1992)，生成分類算法。在RDA中，使用協(xié)方差矩陣的平常最大可能性(插入(plug-in))估計的替代方案。這些替代方案的特征在于2個參數(shù)(λ，γ)，它們的值根據(jù)單獨的情況定制，其通過共同地使基于樣品的將來錯分類危險估計最小化來實現(xiàn)(Friedman，J.H.，Regularized DiscriminantAnalysis，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175)。作為一種替代方法，Support Vector Machines算法(Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，F(xiàn)riedman，Jerome，The Elements ofStatistical Learning，Springer Series in Statistics，2001)可以被擬合以得到可比較的分類結果。RDA分析是基于106份CRC樣品和404份健康/疾病對照的。
從分類問題的最佳單一標記開始，并在90％特異性水平時的靈敏性增加不再有顯著改變時結束，逐步構建標記組。為了得到集中的分布，用自然對數(shù)(log)函數(shù)轉化每一種單一標記。
表9提供了通過對比CRC樣品和健康/疾病對照樣品得到的RDA數(shù)據(jù)，其中特異性設定在90％。應當指出，ASC在所有測試的腫瘤標記中具有最好的ROC曲線下面積。
表9單變量分析

表10和11顯示了多變量分析的結果。令人驚訝地，對2、3、4和5種不同標記的最佳組合的搜索，導致下述觀察，即包含CEA(以及CA19-9)的組合顯得較次。在本樣品集合的基礎上發(fā)現(xiàn)的最佳組合包括CYFRA21-1、NSE和ASC。在表11中示例地解釋了該結果，該表反映了包含CEA的不同組合的結果。
表10多變量分析(1)

表11多變量分析(2)；預選的標記ASC、NNMT、CEA

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序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>ASC作為結腸直腸癌的標記的用途<130>23111<150>EP05008660.2<151>2005-04-20<150>EP04030619.3<151>2004-12-23<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>195<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>含有CARD的細胞凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)<400>1Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Pro Leu20 25 30Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu Ser Met Asp35 40 45Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr Leu Glu Thr Tyr
50 55 60Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp Met Gly Leu Gln Glu65 70 75 80Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His Gln Gly Ser Gly Ala Ala85 90 95Pro Ala Gly Ile Gln Ala Pro Pro Gln Ser Ala Ala Lys Pro Gly Leu100 105 110His Phe Ile Asp Gln His Arg Ala Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn115 120 125Val Glu Trp Leu Leu Asp Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu130 135 140Gln Tyr Gln Ala Val Arg Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg145 150 155 160Lys Leu Phe Ser Phe Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu165 170 175Leu Leu Gln Ala Leu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu180 185 190Glu Arg Ser19權利要求
1.體外評價結腸直腸癌的方法，其包含下述步驟a)測量樣品中含有胱天蛋白酶相關募集結構域的細胞凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)的濃度，b)任選地測量樣品中結腸直腸癌的一種或多種其它標記的濃度，和c)將在步驟(a)中測定的濃度和任選地在步驟(b)中測定的濃度與結腸直腸癌的診斷相關聯(lián)。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其進一步特征在于，所述樣品選自血清、血漿和全血。
3.根據(jù)權利要求1和2中的任一項的方法，其進一步特征在于，所述一種或多種其它標記選自NSE、CYFRA 21-1、NNMT、CA19-9、CA72-4和CEA。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其進一步特征在于，所述一種或多種其它標記是CYFRA21-1。
5.根據(jù)權利要求3的方法，其進一步特征在于，所述一種或多種其它標記是NSE。
6.作為標記分子的蛋白ASC在評價結腸直腸癌中的用途。
7.包含ASC和結腸直腸癌的一種或多種其它標記的標記組在評價結腸直腸癌中的用途。
8.根據(jù)權利要求7的標記組的用途，其中所述一種或多種其它標記選自NSE、CYFRA21-1、NNMT、CA19-9、CA72-4和CEA。
9.根據(jù)權利要求8的標記組的用途，所述標記組包含至少ASC、CYFRA21-1和NSE。
10.用于執(zhí)行根據(jù)權利要求2的方法的試劑盒，其包含特異性地測量ASC和結腸直腸癌的一種或多種其它標記所需的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及結腸直腸癌的診斷。它公開了蛋白ASC(含有胱天蛋白酶相關募集結構域的細胞凋亡相關斑點樣蛋白)在結腸直腸癌的診斷中的用途。它還涉及通過測量樣品中的ASC，從源自個體的液體樣品診斷結腸直腸癌的方法。ASC的測量可以例如用于結腸直腸癌的早期檢測或診斷。
文檔編號G01N33/574GK101088012SQ200580044558
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2004年12月23日
發(fā)明者H·安德里斯, M·-L·哈格曼, J·卡爾, U·庫納特, G·佩斯特林 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司