專(zhuān)利名稱(chēng)：堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法
堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及ー種堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法。隨著酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，尋求ー種簡(jiǎn)捷高效的酶標(biāo)記抗體技術(shù)越來(lái)越重要。堿性磷酸酶(簡(jiǎn)稱(chēng)AP)作為ー 種免疫診斷試劑應(yīng)用廣泛的酶，將其偶聯(lián)至抗體上，是診斷試劑開(kāi)發(fā)中至關(guān)重要的一歩。將標(biāo)記抗體的方法基本上分為兩類(lèi)。一類(lèi)用雙功能基團(tuán)的化合物使酶與抗體隨機(jī)偶聯(lián)，如戊ニ醛ー步法。由于酶分子上游離氨基極少，而抗體分子上氨基則相對(duì)較多，為了彌補(bǔ)這ー缺陷，往往采用8-12個(gè)酶分子與I個(gè)抗體分子的比值進(jìn)行調(diào)整。戊ニ醛ニ步法的原理，主要是AP的氨基極少，而加入的戊ニ醛分子數(shù)相對(duì)較多，當(dāng)戊ニ醛中的ー個(gè)醛基與酶分子上的ー個(gè)氨基結(jié)合后，則余下的一個(gè)醛基再與另ー酶分子上的氨基作用的可能性極少，故很少產(chǎn)生酶與酶間的偶聯(lián)。當(dāng)除去未作用的戊ニ醛后，己醛化的酶與抗體作用而成為結(jié)合物，但這一方法標(biāo)記效果也并不理想。另ー類(lèi)用過(guò)碘酸鈉氧化酶分子中的含糖部分使酶本身產(chǎn)生多個(gè)醛基，酶的活性中心未受影響或影響不大，而醛化了的酶再與待標(biāo)記的抗體作用即可獲得結(jié)合物。這ー方法由Nakane等首創(chuàng)，其特點(diǎn)是標(biāo)記效果高而所得的結(jié)合物分子量較大。上述方法除標(biāo)記效果較差的戊ニ醛ー步法外，操作均較為復(fù)雜。本發(fā)明結(jié)合以上標(biāo)記方法，對(duì)酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)操作過(guò)程中涉及到的透析繁瑣操作進(jìn)行了方法改進(jìn)，簡(jiǎn)化了操作，縮短了時(shí)間。在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一歩提高標(biāo)記效果，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了ー種標(biāo)記效果好、操作簡(jiǎn)單的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了ー種堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，采用如下步驟A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6-6. 6的NaAc溶液中，使堿性磷酸酶的濃度為3-10mg/ml ；B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入等體積的過(guò)碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進(jìn)行氧化，氧化時(shí)間為20min ；C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入與步驟A所得溶液等體積的こニ醇-NaCl溶液；D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無(wú)水こ醇，混勻，并在室溫為_(kāi)20°C的條件下靜置I小時(shí)，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶；E)用含量為0. 5ml濃度為0. 05M，pH值為8_10的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻；F)按質(zhì)量比，酶抗體的比例范圍為I : I至I : 4的比例,加入待標(biāo)記的抗體溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)；G)按質(zhì)量比，NaBH4 :酶的比例范圍為0.1 I至0. 2 I的比例，加入NaBH4溶液，室溫放置1-3小時(shí)；H)加入0. 6ml的冰冷無(wú)水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時(shí)，4000g離心10分鐘；I)按所需酶標(biāo)抗體濃度用PBS溶解或凍干保存。所述こニ醇-NaCl溶液的配方為NaCl，こニ醇和水。所述的NaCl的含量為22g，こニ醇的含量為2. 3ml，水的含量100ml。所述待標(biāo)記的抗體溶液為HbcAb的PBS溶液。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，對(duì)酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)操作過(guò)程中涉及到的透析繁瑣操作進(jìn)行了方法改進(jìn)，簡(jiǎn)化了操作，縮短了時(shí)間。從而進(jìn)一步提高了標(biāo)記效果。圖I為本發(fā)明實(shí)施例一中表I的線(xiàn)形圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例ニ中表2的線(xiàn)形圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例三中表3的線(xiàn)形圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例四中表4的線(xiàn)形圖。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步描述。實(shí)施例一A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M，PH值為5. 6的NaAc溶液中。B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入0. 5ml濃度為0. 06M過(guò)碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進(jìn)行氧化，氧化時(shí)間為20min。C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入0. 5mlこニ醇-NaCl溶液。こニ醇-NaCl溶液的配方為，稱(chēng)取22g NaCl，加2. 3mlこニ醇，再加水至IOOml制得該溶液，室溫可長(zhǎng)期保存。D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無(wú)水こ醇，混勻，并在室溫為_(kāi)20°C的條件下靜置I小時(shí)，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶。E)用含量為0. 5ml濃度為0. 5M，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中、得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻。F)加待標(biāo)記的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0. 05ml，反應(yīng)2小時(shí)。 G)加4mg/ml的NaBH4溶液0. 25ml，室溫放置2小時(shí)。H)加入0. 6ml的冰冷無(wú)水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時(shí)，4000g離心10分鐘。I)加 0. 5mlPBS 溶解。在ELISA板上包被HbcAg抗原，進(jìn)行直接法ELISA進(jìn)行酶標(biāo)記效率的檢查，結(jié)果如下表和圖I所示。
_標(biāo)執(zhí)體酶標(biāo)抗體 |~ 酶標(biāo)執(zhí)體 I酶標(biāo)沉體 [f
不加酶標(biāo)抗體
(1:1000 稀釋)(1:2000 稀釋)(1:4000 稀釋)(1:8000 稀釋)
1.8450.912 0.4950.1580.009AG (1:1)
1.8860.895 0.5010.2130.002AG (1:1)重復(fù)
0.8960.467 0.2580. 1330.005" AG (1:2)
0.8750.463 0.2740.1860.003AG (1:2)重復(fù)
0.5030.325 0.1850.0900.003AG (1:4)
0.4990.345 0.2060.1030.003AG (1:4)重復(fù)
0.3650.162 0.0750.0400.006AG (1:8)
0. 3450. 174 0.0980.0490.004Aft (1:8)重復(fù)實(shí)施例ニ A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0. 5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6的NaAc溶液中。B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入0. 5ml濃度為0. 06M過(guò)碘酸鈉溶液，并在室溫為4
攝氏度的條件下進(jìn)行氧化，氧化時(shí)間為20min。C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入0. 5mlこニ醇-NaCl溶液。こニ醇-NaCl溶液的配
方為，稱(chēng)取22g NaCl，加2. 3mlこニ醇，再加水至IOOml制得該溶液，室溫可長(zhǎng)期保存。D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為1.5ml的冰冷無(wú)水こ醇，混勻，并在室溫
為_(kāi)20°C的條件下靜置I小時(shí)，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶。E)用含量為0. 5ml濃度為0. 5M，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中
得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻。F)加待標(biāo)記的10mg/ml的HbcAb的PBS溶液0. 05ml，反應(yīng)2小時(shí)。G)加4mg/ml的NaBH4溶液0. 25ml，室溫放置2小時(shí)。H)加入0. 6ml的冰冷無(wú)水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時(shí)，4000g離心10分鐘。I)加 0. 5mlPBS 溶解。在ELISA板上包被HbcAg抗原，進(jìn)行直接法ELISA進(jìn)行酶標(biāo)記效率的檢查，結(jié)果下
表和圖2所示。
權(quán)利要求
1.ー種堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，采用如下步驟 A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0.5ml濃度為0. 05M, PH值為3. 6-6. 6的NaAc溶液中，使堿性磷酸酶的濃度為3-10mg/ml ； B)向步驟A中的酶溶液內(nèi)加入等體積的過(guò)碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進(jìn)行氧化，氧化時(shí)間為20min; C)向氧化后的酶溶液內(nèi)，加入與步驟A所得溶液等體積的こニ醇-NaCl溶液； D)向步驟C中的溶液內(nèi)，加入含量為I.5ml的冰冷無(wú)水こ醇，混勻，并在室溫為_(kāi)20°C的條件下靜置I小時(shí)，4000g離心lOmin，得到氧化好的酶； E)用含量為0.5ml濃度為0. 5M，pH值為8_10的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中得到的酶，并加戊ニ醛0. 1ml，混勻； F)按質(zhì)量比，酶抗體的比例范圍為I: I至I : 4的比例，加入待標(biāo)記的抗體溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)； G)按質(zhì)量比，NaBH4:酶的比例范圍為0. I I至0. 2 I的比例，加入NaBH4溶液，室溫放置1-3小時(shí)；H)加入0.6ml的冰冷無(wú)水こ醇，并在_20°C的室溫下靜置I小時(shí)，4000g離心10分鐘； I)按所需酶標(biāo)抗體濃度用PBS溶解或凍干保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，其特征在于所述こニ醇-NaCl溶液的配方為NaCl，こニ醇和水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，其特征在于所述的NaCl的含量為22g，こニ醇的含量為2. 3ml，水的含量100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，其特征在于所述待標(biāo)記的抗體溶液為fficAb的PBS溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的方法，采用如下步驟包括堿性磷酸酶的溶解過(guò)程，堿性磷酸酶的氧化過(guò)程以及堿性磷酸酶與待標(biāo)記的抗體溶液的反應(yīng)過(guò)程，本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比對(duì)酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)操作過(guò)程中涉及到的透析繁瑣操作進(jìn)行了方法改進(jìn)，簡(jiǎn)化了操作，縮短了時(shí)間。從而進(jìn)一步提高了標(biāo)記效果。
文檔編號(hào)G01N33/535GK102645531SQ20121009961
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者李子樵, 王志文 申請(qǐng)人:上海藍(lán)怡科技有限公司