一種熒光探針及其在檢測細胞溶酶體內(nèi)次氯酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了 一種可用于選擇性檢測次氯酸的熒光探針。在萘酰亞胺熒光母體上 引入偏堿性的嗎啉結(jié)構(gòu)使得探針能夠定位到細胞的溶酶體中，引入硒醚結(jié)構(gòu)作為與次氯酸 反應(yīng)的活性中心，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差別實現(xiàn)選擇性地檢測次氯酸，尤其是可以應(yīng) 用于檢測活細胞溶酶體中的次氯酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 次氯酸（HOCl)屬于一種活性氧（R0S，有十分重要的生理和病理學(xué)意義)，作為一種 高效的殺菌劑，在生命的免疫系統(tǒng)中起到重要的作用。細胞內(nèi)源性的次氯酸主要由白細胞 (如單核細胞，嗜酸性細胞，嗜中性粒細胞等）中的髓過氧化物酶(ΜΡ0,存在于溶酶體)/雙氧 水（H202)/氯離子（Cl-)系統(tǒng)來產(chǎn)生。細胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生的次氯酸，若超過一定的水平，則 會引起嚴(yán)重的疾病(如關(guān)節(jié)炎，癌癥，神經(jīng)退行疾病)。正是因為次氯酸具有如此重要的生理 和病理學(xué)意義，對存在于生物系統(tǒng)中的次氯酸檢測引起了人們的廣泛重視。
[0003] 熒光探針是有效檢測生命體內(nèi)次氯酸的手段之一。一個具有應(yīng)用前景的熒光探針 應(yīng)具有作用前后熒光變化明顯、對目標(biāo)分子響應(yīng)快、選擇性好、合成簡單、亞細胞定位等優(yōu) 點。近年來，能夠應(yīng)用于檢測活細胞中次氯酸的熒光探針如雨后春筍般出現(xiàn)了，然而這些探 針都不能夠定位到溶酶體（Lysosome)這一產(chǎn)生次氯酸的細胞器。因此開發(fā)能夠定位到溶 酶體中檢測次氯酸的熒光探針仍具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測細胞溶酶體內(nèi)次氯酸的 熒光探針，此探針可以在溶酶體生理條件下選擇性地與次氯酸作用，作用后熒光顯著增強。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：采用萘酰亞胺染料作為熒光母體，在萘酰亞胺母體上 引入偏堿性的嗎啉結(jié)構(gòu)使得探針能夠定位到細胞的溶酶體（pH在4. 0到5. 5之間)中，引入 硒醚結(jié)構(gòu)作為與次氯酸反應(yīng)的活性中心，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差別實現(xiàn)選擇性地檢測 次氯酸，尤其是可以應(yīng)用于檢測活細胞溶酶體中的次氯酸。
[0006] 所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下。
[0007]
[0008] 上述結(jié)構(gòu)式I表示的化合物應(yīng)用于檢測次氯酸，其特征在于反應(yīng)生成具有結(jié)構(gòu)式 II的化合物，從而導(dǎo)致熒光改變。此外，加入還原性物質(zhì)(如谷胱甘肽，GSH)后，結(jié)構(gòu)式II 可以變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)式I，從而實現(xiàn)探針的可逆性應(yīng)用。
[0009]
[0010] 結(jié)構(gòu)式I可對次氯酸定性、定量的檢測。將濃度呈梯度變化的次氯酸水溶液分別 加入含結(jié)構(gòu)式I的水溶液中，反應(yīng)達到平衡后，分別測定各樣品的熒光強度，然后以次氯酸 的濃度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)后體系的熒光強度為縱坐標(biāo)作圖，即可根據(jù)熒光強度從圖中讀出待 測溶液中次氯酸的含量。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：該化合物在次氯酸存在下熒光發(fā)生顯著改變，可用于高選擇 性、高靈敏性地檢測次氯酸。加入還原性物質(zhì)(如谷胱甘肽，GSH)后，可以實現(xiàn)探針的可逆 性應(yīng)用。尤其是，該化合物可用于細胞內(nèi)的溶酶體中的次氯酸檢測，這對于深入研究次氯酸 在生物體內(nèi)生理和病理過程的動力學(xué)機理具有重要意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1本發(fā)明提供的熒光探針Lyso-NI-Se檢測次氯酸的原理示意圖；
[0013] 圖 2 實施例 1 中合成的探針 Lyso-NI-Se 的1H NMR(a)，13C NMR(b)，77Se NMR(c)譜 圖；
[0014] 圖3實施例2中熒光探針Lyso-NI-Se對次氯酸的選擇性示意圖；
[0015] 圖4實施例3中熒光探針Lyso-NI-Se水溶液的紫外可見吸收光譜（a)、熒光發(fā)射 光譜（b) 540nm處的熒光強度（c)隨次氯酸濃度的變化示意圖；
[0016] 圖5實施例3中pH對熒光強度的影響示意圖；
[0017] 圖6實施例3中熒光探針Lyso-NI-Se及其產(chǎn)物的耐光氧化示意圖；
[0018] 圖7實施例4中突光探針Lyso-NI-Se與次氯酸反應(yīng)速率的動力學(xué)示意圖（a);加 入GSH后熒光降低（b)。
【具體實施方式】
[0019] 實施例用于進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實施例。
[0020] 實施例1 (探針的合成）：
[0021] 如圖3所示，實施例所采用的探針化合物的結(jié)構(gòu)用代號Lyso-NI-Se表示。
[0022] Lyso-NI-Se的合成：向50mL三口燒瓶中加入0· 50g4_苯硒-苯胺，0· 40g碘化亞銅 和0. 80g氮-(乙氨基嗎啉)-4-溴-1，8-萘酰亞胺，0.1 Og氫氧化鉀，真空/氮氣置換三次， 加入20ml無水二甲基亞砜，開磁力攪拌，升溫至90°C，反應(yīng)60分鐘。過濾，將濾液減壓蒸發(fā)， 用二氯甲烷溶解，再次過濾并將濾液減壓蒸干，將所得固體經(jīng)硅膠柱層析純化(用二氯甲烷 和乙酸乙酯做洗脫劑)得目標(biāo)化合物L(fēng)yso-NI-Se (紅色固體)。IH NMR (500MHz，d6-DMS0) δ (ppm) : 9. 41 (s, 1H), 8. 76 (d, 1H, J=8. 5Hz), 8. 47 (d, J=7. 5Hz, 1H), 8. 27 (d, 1H, J=8. 5Hz), 7. 7 8 (t, 1H, J=7. 75Hz), 7, 56-7. 54 (m, 2H), 7. 46-7. 44 (m, 2H), 7. 39-7. 31 (m, 6H), 4. 15 (t, 2H, J =6. 75Hz), 3. 54-3. 53 (m, 4H), 2. 55 (t, 2H, J=7. 0Hz), 2. 46 (s, 4H) · 13C NMR(d6-DMS0, 500MHz) δ (ppm) : 163. 52, 162. 68, 146. 81, 140. 73, 134. 94, 133. 11, 131. 64, 131. 39, 130. 99, 129. 5 5, 129. 34, 128. 97, 127. 20, 125. 21, 123. 23, 122. 01, 121. 97, 111. 48, 108. 84, 66. 18, 55. 65, 53, 37, 36. 48. 77Se NMR(d6-DMS0, 400MHz) δ (ppm) :402. 49. HRMS (ESI) Calcd for C30H27N3O3S e[MH+]558. 1296, found558. 1303.
[0023] 實施例2 (Lyso-NI-Se對次氯酸的選擇性）：
[0024] 先后將 4000 μ L 磷酸鹽緩沖溶液（pH=5.0,濃度為 0. 1M)、4000uL Lyso-NI-Se 的乙腈溶液（10 μ Μ)、80 μ L活性氧溶液加入到IOmL比色管中，混勻后取3mL溶液加入 lcm X lcm X 4cm的比色皿中，測量該工作液的熒光發(fā)射光譜，λ ex=430nm，光柵寬度為 5nm，4nm〇
[0025] Lyso-NI-Se對HClO的選擇性實驗結(jié)果如圖4所示，縱坐標(biāo)表示波長為540nm處 的熒光強度。圖3表明Lyso-NI-Se對HClO具有很好的選擇性，體系熒光顯著增強。測定 條件下，相比于HC10,其他活性氧（當(dāng)量遠遠超過HC10)導(dǎo)致的熒光增強可以忽略。
[0026] 實施例3 (Lyso-NI-Se對次氯酸的定量檢測）：
[0027] 先后將4000 μ L磷酸鹽緩沖溶液（ρΗ=5· 0,濃度為0· 1M)、4000uL Lyso-NI-Se的乙 腈溶液（10 μ Μ)、80 μ L含不同濃度的次氯酸的溶液加入到IOmL比色管中，混勻后取3mL溶 液加入lcm X lcm X 4cm的比色皿中，測量該工作液的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜 (λ ex=430nm，光柵寬度為 5nm，4nm)。
[0028] 圖4表明該探針可以檢測人體生理水平的次氯酸。隨次氯酸加入量（0到8. 0 μ Μ) 增加吸收光譜（a)和熒光光譜（b)的變化情況，540nm處的熒光強度隨次氯酸加入量增加而 增強（c)。
[0029] 圖5說明在pH為4. 0到5. 5的溶酶體pH條件下，Lyso-NI-Se的熒光在次氯酸作 用下可以顯著增強，PH對該探針的影響十分有限。
[0030] 圖6說明在實驗條件下，探針本身或者探針與次氯酸作用后得到的產(chǎn)物均耐光氧 化。
[0031] 圖7表明Lyso-NI-Se與次氯酸的反應(yīng)十分迅速（a);加入GSH后工作液的熒光強 度又可以降低（b )，表明該探針為可逆探針。
[0032] 實施例4 (探針Lyso-NI-Se可定位于細胞溶酶體，并能檢測外源性次氯酸）：
[0033] 小鼠巨噬細胞RAW264. 7按照American type Tissue Culture Collection規(guī)定進 行培養(yǎng)。用中性紅(一種能夠定位細胞溶酶體的熒光探針)復(fù)染細胞來驗證探針Lyso-NI-Se 可以定位到細胞溶酶體。對照組細胞：用含有5. OyMLyso-NI-Se的細胞培養(yǎng)液孵育 RAW264. 7細胞30分鐘后，將細胞用PBS洗滌3次，置于共聚焦熒光顯微鏡下拍照；另一組 細胞：用含有5. 0 μ M Lyso-NI-Se的細胞培養(yǎng)液孵育RAW264. 7細胞30分鐘，將細胞用PBS 洗滌3次后，加入5. 0 μ M次氯酸鈉，一分鐘后置于共聚焦熒光顯微鏡下拍照。結(jié)果顯示：探 針與中性紅復(fù)染的皮爾森系數(shù)很高；同時加入次氯酸鈉的細胞熒光圖像亮度明顯高于對照 組。
【主權(quán)項】
1. 一種熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：2. 權(quán)利要求1所述的熒光探針在檢測次氯酸中的應(yīng)用，其特征是：結(jié)構(gòu)式I表示的化 合物與次氯酸反應(yīng)后生成具有結(jié)構(gòu)式II結(jié)構(gòu)的化合物，從而導(dǎo)致熒光增強；3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，結(jié)構(gòu)式II表示的化合物可以被還原性物質(zhì)還原，其特 征是：結(jié)構(gòu)式II表示的化合物與還原性物質(zhì)反應(yīng)后生成具有結(jié)構(gòu)式I結(jié)構(gòu)的化合物，從而 導(dǎo)致熒光降低。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述還原性物質(zhì)谷胱甘肽、硫化氫、半胱 氨酸中的一種或二種以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：用于檢測次氯酸的測定包括以下工序： (a) 使具有通式I結(jié)構(gòu)的化合物與次氯酸反應(yīng)； (b) 測定由上述工序中的反應(yīng)引起的熒光變化。6. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述的熒光探針在檢測細胞溶酶體內(nèi)次氯酸中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述檢測環(huán)境為生理范圍內(nèi)的pH=4-10,溫度為20-40°C，熒光激發(fā)和發(fā)射波長均位于 可見波段。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種可用于選擇性檢測次氯酸的熒光探針。在萘酰亞胺熒光母體上引入偏堿性的嗎啉結(jié)構(gòu)使得探針能夠定位到細胞的溶酶體中，引入硒醚結(jié)構(gòu)作為與次氯酸反應(yīng)的活性中心，利用反應(yīng)物與產(chǎn)物的熒光差別實現(xiàn)選擇性地檢測次氯酸，尤其是可以應(yīng)用于檢測活細胞溶酶體中的次氯酸。
【IPC分類】C07D221/14, G01N21/64, G01N33/52, C09K11/06
【公開號】CN104974743
【申請?zhí)枴緾N201410128546
【發(fā)明人】曲宗金, 韓克利, 李鵬, 樓張蓉
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月1日