專利名稱：用于治療凝血相關(guān)紊亂的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療與對(duì)凝血的不想要的激活相關(guān)的紊亂的組合物和方法。在一些情況下，凝血作用于某些炎性疾病和相關(guān)紊亂。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療此類紊亂的方法，所述方法通過施予治療有效量的嵌合或人化抗體來進(jìn)行，所述抗體能與組織因子(TF)特異性結(jié)合。本發(fā)明具有廣泛的重要應(yīng)用，其包括用于預(yù)防或治療炎癥，包括膿毒病和關(guān)節(jié)炎。
背景技術(shù)：
人們對(duì)凝血(coagulation)和炎癥之間的關(guān)系有著日益增加的認(rèn)識(shí)。例如，某些凝血因子被認(rèn)為能激活前炎性(pro-inflammatory)細(xì)胞并引起炎癥反應(yīng)。另一方面，一些前炎性細(xì)胞因子已被報(bào)道為能誘導(dǎo)TF表達(dá)并產(chǎn)生凝血因子。在某些靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行的研究，通過顯示出某些抗凝血?jiǎng)┠軠p少炎癥，來支持了這種關(guān)系的存在。見F.B.Taylor Jr.etal.，J.Clin.Invest.79918-925(1987)；M.Levi et al.，J.Clin.Invest.93114-120(1994)；and M.C.Minnema et al.，Blood 951117-23(2000)。
關(guān)于血液凝固已有很多報(bào)道。例如，凝血酶是被相信能提供凝血和炎癥之間聯(lián)系的血液蛋白。大多數(shù)凝血酶是通過對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的TF啟動(dòng)來產(chǎn)生的。其它關(guān)鍵的凝血因子包括因子VIIa和因子Xa。凝血酶被認(rèn)為在前凝血、抗凝血、炎癥和促有絲分裂應(yīng)答中具有多種作用。通常，見L.Styer，Biochemistry，3rdEd.，W.H.Freeman Co.，New York；and A.G.Gilman et al.，in The PharmacologicalBasis of Therapeutics，8thEd.，McGraw-Hill Inc.，New York。
某些有傳染性的試劑被認(rèn)為能妨礙TF啟動(dòng)的凝血級(jí)聯(lián)。幸運(yùn)的是，凝血級(jí)聯(lián)的局部激活通常能保持對(duì)這種妨礙的控制。但是，一些時(shí)候，異常的TF表達(dá)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的、可能威脅生命的血栓形成(thrombotic)紊亂。例如，已有人提出，對(duì)TF表達(dá)的細(xì)菌誘導(dǎo)能導(dǎo)致膿毒病(sepsis)、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、廣泛的纖維蛋白沉著(widespread fibrin deposition)和其它并發(fā)癥。TF表達(dá)的增加被認(rèn)為是協(xié)助這些紊亂發(fā)展的重要因素。炎性紊亂發(fā)展的例子是急性肺損傷(ALI)到急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)展，接著是涉及其它器官系統(tǒng)，例如腎的進(jìn)行性損傷，導(dǎo)致膿毒病的進(jìn)行性更為嚴(yán)重的形式。見，例如，Welty-Wolf，K.et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med.1641988(2001)。
人們已在企圖理解凝血相關(guān)紊亂，例如膿毒病。
例如，膿毒病是用于表征由對(duì)感染、損傷或這兩者的宿主免疫應(yīng)答所促進(jìn)的一系列臨床征狀(condition)的術(shù)語(yǔ)。膿毒病已被描述為凝血、纖維蛋白溶解和炎癥的不受控制的級(jí)聯(lián)。在所述級(jí)聯(lián)中的某些步驟，自發(fā)擴(kuò)增過程導(dǎo)致凝血異常、不想要的炎癥以及內(nèi)皮損傷的加速產(chǎn)生。該擴(kuò)增過程是炎性細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞)上TF的表達(dá)進(jìn)行正向調(diào)節(jié)的結(jié)果，導(dǎo)致對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的激活增加，其再依序?qū)е翽AR受體的激活以及對(duì)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)。見Osterud，B.et al.，Thromobsis Hemost.83861(2000)；Mechtcheriakova，D.et al，F(xiàn)ASEB J.15230(2001)；Shen，B.-Q.et al.，J.Biol.Chem.2765281(2001)。
更具體地，膿毒病已被認(rèn)為具有下述特征凝血和炎癥的系統(tǒng)性激活。纖維蛋白溶解可被抑制。一些研究已經(jīng)指向止血不平衡，其被認(rèn)為能促進(jìn)，例如，DIC和微血管的血栓形成。它們與相關(guān)的指征(indication)被相信能影響到正常的器官功能，其能導(dǎo)致死亡。
膿毒病及相關(guān)紊亂繼而被聯(lián)系到與醫(yī)院和門診部(out-patientclinics)接觸的病人上。因此，對(duì)這些紊亂進(jìn)行管理是很多健康管理者、臨床醫(yī)生和保險(xiǎn)公司的主要關(guān)注問題。
有報(bào)道稱，對(duì)凝血的不想要的激活是某些炎性疾病的重要特征。例如，血管外纖維蛋白沉著已被發(fā)現(xiàn)于具有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、腎小球性腎炎(glomerulonephritis)、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、Sjogren’s綜合征和炎性腸病的病人的自身免疫損傷中。見
Weinberg，et al.，Arthritis Rheum.34996-1005(1991)；Wakefield，et al.，J Clin Pathol 47129-133(1994)；Schoph，et al.，ArchDermatol Res 285305-309(1993)；Zeher，et al.，Clin Immunol Immunopathol71149-155(1994)；More，et al.，J.Clin Pathol 46703-708(1993)。
此外，提高的TF水平被認(rèn)為與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)。見Segal，et al.，J Rheumatol 272827-2832(2000).See alsoNakano，et al.，Clin Exp Rheumatol 17161-170(1999)；Morris，et al.，Ann RheumDis 5372-79(1994)；Furmaniak-Kazmierczak，et al.，J.Clin Invest 94472-480(1994)；Bokarewa，et al.，Inflamm Res 51471-477(2002)。
已有建議稱，某些炎性征狀可通過阻止血栓形成來治療。見R.Gordon et al.，The New England Journal of Medicine 344699-709，759-762(2001)。某些抗TF抗體已被報(bào)道為對(duì)降低某些類型的炎癥具有一些幫助。見前文的Levi，M.et al.。
人們已在努力發(fā)展能結(jié)合凝血因子的抗體。
例如，Wong H.et al.的U.S.Pat.Nos 5,986,065和6,555,319以及PCT/US98/04644(WO 98/40408)公開了多種此類抗體。具體而言，提供了對(duì)組織因子(TF)具有顯著結(jié)合親和性和特異性的鼠抗體、嵌合抗體衍生物以及其片段。嵌合抗原結(jié)合分子的使用被相信能降低人類患者中不想要的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。也見S.L.Morrison and V.Oi，Adv.Immunol.4465(1989)(報(bào)道了制造人-小鼠嵌合抗體的方法)。
多種方法已被用于制造對(duì)于人類來說在免疫學(xué)上更能被接受的抗體。一些方法使用了重組DNA技術(shù)。例如，一種策略將非人類抗體進(jìn)行克隆和修飾，以使其更接近類似于人類抗體?？傮w而言，這些抗體已被稱為“人化的”。見Studnicka et al.的U.S Pat.Nos.5,766,886；Queen et al.的5,693,762；Waldeman et al.的5,985,279；Winter的5,225,539；Pedersen，et al.的5,639,641；和其中關(guān)于制造及使用人化抗體所引用的參考文獻(xiàn)。
用于制造人化抗體的其它策略也已被報(bào)道。見E.Padlan Mol.Immunol.28489(1991)；Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Junghans et al.，supra；and Roguska，et al.，PNAS(USA)91969(1994)。還見公開的美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0109860 A1和2003/0082636。
還不清楚，現(xiàn)有抗體是否足夠強(qiáng)大到能阻止或降低對(duì)凝血的不想要的激活。更具體地，還不清楚此類抗體是否足夠有效以預(yù)防或治療膿毒病和炎性疾病，例如關(guān)節(jié)炎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療與不想要的對(duì)凝血的激活相關(guān)的紊亂的組合物和方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療此類紊亂的方法，所述方法通過向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的嵌合或人化抗體來進(jìn)行，所述抗體與組織因子(TF)結(jié)合。本發(fā)明具有一系列廣泛的重要應(yīng)用，包括用于治療膿毒病以及炎性疾病，例如關(guān)節(jié)炎。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，能與天然人類TF最顯著的抗原決定部位特異性結(jié)合的抗體及其抗原結(jié)合片段適于預(yù)防或治療與不想要的對(duì)凝血的激活相關(guān)的紊亂。優(yōu)選的抗體和片段與天然人類TF特異性結(jié)合，基本上不與非天然的或變性的TF結(jié)合。更為特殊的適合在本發(fā)明中使用的抗體和片段與人類TF結(jié)合，使得因子X(FX)和因子IX(FIX)中的至少一種不能與TF-因子VIIa復(fù)合體有效結(jié)合。額外優(yōu)選的抗體和片段能降低或阻礙TF的功能，典型地，通過降低或阻礙FX與TF分子結(jié)合或接觸的路徑來實(shí)現(xiàn)。適用于本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的抗體和片段不會(huì)顯著抑制或阻礙TF和因子VIIa之間的相互作用或結(jié)合，或抑制或阻礙TF-因子VIIa復(fù)合體的活性，相對(duì)非FX或FIX的物質(zhì)而言。
如上文討論的，據(jù)信，對(duì)凝血的不想要的激活是膿毒病和一系列特定炎性疾病的基礎(chǔ)。更具體地，不想要的TF介導(dǎo)的凝血被認(rèn)為在很多情況下起始和/或延長(zhǎng)此類紊亂。因此，本發(fā)明的目的是提供與TF特異性結(jié)合以降低或失活很多(如果不是全部的話)TF關(guān)聯(lián)的功能的抗體和其片段。此類功能包括但不限于阻止或抑制FIX和FX中的至少一種與TF復(fù)合體結(jié)合。不欲受理論束縛的情況下，我們相信，通過阻止或抑制上述因子中的至少一種與TF復(fù)合體結(jié)合，不想要的對(duì)凝血的激活可被減少，或者在某些情況下被消除。這即是，通過根據(jù)本發(fā)明來阻止或抑制此類不想要的過程，相信可能可以預(yù)防、治療或減輕與膿毒病和特定炎性疾病相關(guān)聯(lián)的癥狀。
優(yōu)選地，此類抗體和其片段是嵌合的或人化的，其通常適于在需要治療的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中使用，尤其在人類患者中。
已認(rèn)識(shí)到，膿毒病和相關(guān)征狀是對(duì)感染、創(chuàng)傷或這兩者的有效且可能威脅生命的免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的。典型地，脈管系統(tǒng)中的血液經(jīng)歷凝血，導(dǎo)致并發(fā)癥，例如炎癥、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血塊凝結(jié)(clotting)和器官窘迫(distress)。如果征狀未被迅速治療，在數(shù)小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)死亡就會(huì)隨之發(fā)生。在本發(fā)明之前，還不清楚是否有任何抗TF抗體或TF結(jié)合片段足夠強(qiáng)大到能預(yù)防或治療膿毒病和相關(guān)征狀的地步。
但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本文所述的抗TF結(jié)合抗體足夠強(qiáng)大(即，足夠特異地并恰當(dāng)親和地與人TF結(jié)合)，足以抑制或阻止對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的不想要的激活。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，此類活性是有好處的，其可被用于預(yù)防或治療膿毒病和相關(guān)征狀。如下文所討論的，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，此類抗體和片段顯示出在人類膿毒病的體內(nèi)動(dòng)物模型中，對(duì)炎癥、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、血塊凝結(jié)、器官窘迫和相關(guān)征狀具有良好的削弱作用。
還已發(fā)現(xiàn)，此類對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的有效阻止或抑制很有用于預(yù)防或治療某些炎性疾病。不欲被理論束縛的情況下，我們相信，通過用本發(fā)明來阻止或降低對(duì)凝血的不想要的激活，可能可以預(yù)防、治療或減輕與炎性疾病中的一種或組合相關(guān)聯(lián)的癥狀。重要地，本文所述的抗TF結(jié)合抗體已被發(fā)現(xiàn)是足夠強(qiáng)大的，足以抑制或阻止對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的不想要的激活，因此能協(xié)助預(yù)防、治療或減輕與關(guān)節(jié)炎和其它炎性疾病相關(guān)聯(lián)的癥狀。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療膿毒病和炎性疾病中的至少一種的方法。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種能與人類TF特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或它們的片段。更為優(yōu)選的抗體降低或阻止FX和FIX中的至少一種與復(fù)合體的結(jié)合。本發(fā)明的方法的實(shí)施很有用于預(yù)防、治療或降低與膿毒病和炎性疾病(包括但不限于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA))相關(guān)聯(lián)的癥狀的嚴(yán)重性。
本發(fā)明提供了其它重要的用途和優(yōu)點(diǎn)。
例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選的人化抗體、嵌合抗體及其片段能令人滿意地阻止FX和FIX中的至少一種與TF-FVIIa復(fù)合體的結(jié)合。優(yōu)選地，此類抗體和片段還抑制或阻止復(fù)合體對(duì)FX或FIX的激活。
令人吃驚地，當(dāng)在本文提供的人類膿毒病的體內(nèi)動(dòng)物模型中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，此類抗體足夠強(qiáng)大，足以預(yù)防、治療或減輕膿毒病和相關(guān)并發(fā)癥的癥狀。還令人吃驚地，此類優(yōu)選的抗體和片段足夠強(qiáng)大，足以預(yù)防、治療或減輕與特定炎性疾病相關(guān)聯(lián)的癥狀。重要地，本發(fā)明的優(yōu)選用途已經(jīng)確定并利用人類TF分子上的特定免疫目標(biāo)(表位)，其能被用于預(yù)防、治療或減輕與這些癥候(indication)相關(guān)聯(lián)的癥狀。
本發(fā)明是靈活的，其可被用于很多種情況下，其中膿毒病和炎性疾病可以是疑似的或占據(jù)主要地位的。
例如，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明可被用于醫(yī)院、診所和其它醫(yī)學(xué)環(huán)境下，其中膿毒病已成為主要的健康問題。尤其成問題的是抗生素抗性微生物(例如，細(xì)菌)的出現(xiàn)，其如果存在于血液中，就可以迅速產(chǎn)生膿毒性休克以及相關(guān)的并發(fā)癥。本發(fā)明的實(shí)施可用于在治療給予者確定合適的治療方案時(shí)將膿毒病或相關(guān)征狀維持在被治療的狀態(tài)(at bay)，或可能地，逆轉(zhuǎn)膿毒病的效果。因此，可以預(yù)見到，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供預(yù)防或治療膿毒病的方法，其中，可將本文公開的抗體和片段的施予與一種或多種抗生素的施予組合起來。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)了在緊急醫(yī)藥環(huán)境(例如，救護(hù)車、戰(zhàn)爭(zhēng))中的用途，其中本文公開的預(yù)防和治療方法可在護(hù)理地點(diǎn)施予。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，當(dāng)患者被轉(zhuǎn)移到醫(yī)院或診所以進(jìn)行評(píng)估和治療時(shí)，可對(duì)膿毒病和膿毒病相關(guān)征狀維持一定的控制。
在其它發(fā)明實(shí)施方式中，本發(fā)明可被用于預(yù)防、治療或減少與關(guān)節(jié)炎尤其是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的癥狀。例如，通過阻止或降低對(duì)凝血的不想要的激活，現(xiàn)在可能可以減少疼痛炎癥、典型地與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的病理性組織毀壞和重構(gòu)以及相關(guān)炎性疾病。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的試劑盒。在一種實(shí)施方式中，該試劑盒包括本文所提供的至少一種人化抗體、嵌合抗體或其片段。
本發(fā)明還提供了用于在哺乳動(dòng)物中減少細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或它們的片段。優(yōu)選地，因子X或因子IX與復(fù)合體的結(jié)合被抑制，所述施予足以減少哺乳動(dòng)物中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。合適的人化抗體、嵌合抗體和其片段是上文和下述討論及實(shí)施例中公開的。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中膿毒病相關(guān)征狀的方法。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或它們的片段。優(yōu)選的抗體和片段在本文中有所描述，其包括其中因子X或因子IX與復(fù)合體的結(jié)合會(huì)受到抑制的那些。優(yōu)選地，所述施予足以在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療所述征狀。
本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中膿毒病誘導(dǎo)的貧血癥的方法。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或它們的片段。優(yōu)選的抗體和片段在本文中有所描述，其包括其中因子X或因子IX與復(fù)合體的結(jié)合會(huì)受到抑制的那些。優(yōu)選地，所述施予足以在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療所述征狀。
本發(fā)明的其它方面見下文討論。


圖1A和1B顯示了H36.D2.B7的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸(SEQ ID NOS1和3)以及氨基酸(SEQ ID NOS2和4)的序列，H36.D2.B7是鼠的抗組織因子抗體，其具有以下劃線表示的(單下劃線用于核酸序列，雙下劃線用于氨基酸序列)高變區(qū)(hypervariableregions)(CDRs或互補(bǔ)決定區(qū)域)。
圖2是顯示了人化抗TF IgG1抗體表達(dá)載體(pSUN-34)的質(zhì)粒圖譜的圖。
圖3A-D是抗TF抗體的部分及完全人化的輕鏈(LC)可變結(jié)構(gòu)域的序列(SEQ ID NO.＿＿)。圖3A顯示了名為“LC-09”的序列，其代表完全人化的LC框架(SEQ ID NO.＿＿)。cH36和LC-09的輕鏈CDR序列顯示于圖3B-D中(分別地，SEQ ID NOS.＿＿)。
圖4A-D是顯示了抗TF抗體的部分及完全人化的重鏈(HC)可變結(jié)構(gòu)域的序列(SEQ ID NO.＿＿)的圖。圖4A顯示了名為“HC-08”的序列，其代表完全人化的HC框架(SEQ ID NO.＿＿)。cH36和HC-08的重鏈CDR序列顯示于圖4B-D中(分別地，SEQ IDNOS.＿＿)。
圖5A-B是顯示IgG1抗組織因子抗體(hOAT)中人類恒定(constant)結(jié)構(gòu)域的序列，其中圖5A顯示了人類kappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.＿＿)，圖5B顯示了人類IgG1重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.＿＿)。所述的圖顯示了hOAT(IgG1)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
圖6A-B是顯示IgG4抗組織因子抗體(hFAT)中人類恒定結(jié)構(gòu)域的序列，其中圖6A顯示了人類kappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO.＿＿)，圖6B顯示了人類IgG4重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO.＿＿)。
圖7A-D是顯示將活的E.coli注入致死性膿毒病模型之后，恒河猴中，血漿IL-6和IL-8(圖7A-B)濃度的變化(圖7A-B)；或IL-1β和TNF-α濃度的變化(圖7C-D)。
圖8A-C是顯示cH36能削弱膿毒病誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)的圖。在這些圖中，AaDO2以mmHg表示，時(shí)間以小時(shí)表示，肺系統(tǒng)順應(yīng)性(pulmonary system compliance，Cst)以ml/cm水表示，肺動(dòng)脈壓力(PAM)以mmHg表示。
圖9A-B是顯示了狒狒中腎髓過氧化物酶(A)和小腸濕/干重比例(B)的圖。
圖10A-D是顯示了cH36能削弱狒狒中膿毒病和相關(guān)征狀的圖。cH36削弱了膿毒病誘導(dǎo)的凝血病(coagulopathy)的圖(纖維蛋白原以mg/DL表示，時(shí)間以小時(shí)表示，部分凝血酶原時(shí)間(PTT)以秒表示；TAT以微克/L表示)。
圖11A-B是顯示了通過cH36的治療使得血清IL-8(A)和IL-6(B)的升高被削弱的圖。
圖12是顯示了通過cH36治療使得支氣管肺泡灌洗(levage)IL-8、IL-6和TNFR1水平的升高被削弱的圖。
發(fā)明詳述如上文所討論的，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕與膿毒病或炎性疾病(例如關(guān)節(jié)炎)相關(guān)聯(lián)的癥狀的方法。本發(fā)明的實(shí)施包括向需要此類治療的哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種人化抗體、嵌合抗體或人類TF-結(jié)合片段，以預(yù)防或治療這些疾病和相關(guān)征狀。
已在努力理解膿毒病和膿毒病相關(guān)征狀的病因。例如，有一種認(rèn)為是，膿毒病級(jí)聯(lián)中的早期事件是被宿主免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的，因而促進(jìn)了血管內(nèi)皮的損傷過程。內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)暴露，膠原酶被釋放出來。表達(dá)組織因子(TF)的內(nèi)皮細(xì)胞被暴露，誘發(fā)了用于激活凝血級(jí)聯(lián)的外在途徑，并加速了凝血酶的產(chǎn)生。同時(shí)，內(nèi)皮損傷導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步惡化，導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞激活，嗜中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的黏著以及炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步地出現(xiàn)(elaboration)。這些炎癥過程進(jìn)一步促進(jìn)了血管內(nèi)皮障礙。內(nèi)穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源調(diào)節(jié)者，例如蛋白C和抗凝血酶III(ATIII)被消耗，其水平變得缺乏，因?yàn)樯眢w在企圖回到正常的功能狀態(tài)。在正常條件下，內(nèi)皮表面蛋白質(zhì)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)和內(nèi)皮蛋白C受體(EPCR)，會(huì)激活蛋白C及其調(diào)節(jié)作用。在膿毒病的情況下，內(nèi)皮損傷使得凝血酶調(diào)節(jié)蛋白和EPCR的該功能受損，因此導(dǎo)致失控。如果沒有受到反抗的話，內(nèi)皮損傷會(huì)積累。這種不受控制的炎癥和凝血的級(jí)聯(lián)加劇了膿毒病的發(fā)展，對(duì)大量患者來說，導(dǎo)致缺氧、彌散性缺血、器官機(jī)能障礙以及最終的死亡。
詞組“膿毒病相關(guān)征狀”表示，那些已知在膿毒病之前、伴隨膿毒病或在之后發(fā)生的征狀，其包括但不限于，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、纖維蛋白沉著、血栓形成和肺損傷，包括急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。能用本發(fā)明來預(yù)防或治療的一種特殊的肺損傷的種類是膿毒病誘導(dǎo)的急性肺損傷。見，例如，Welty-Wolf，et al.，Am J.Respir.Crit.Care Med.1641988(2001)。還包括在內(nèi)的有某些伴隨膿毒病的腎臟紊亂，例如急性腎小管壞死(acutetubular necrosis)(ACN)和相關(guān)征狀。
急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)是持續(xù)受到明顯關(guān)注的嚴(yán)重紊亂。具體而言，ALI和ARDS的重要特征是外源性凝血(extrinsic coagulation)的局部激活和對(duì)纖維蛋白溶解的抑制。隨著損傷的發(fā)展，這些干擾被報(bào)道為能導(dǎo)致纖維蛋白在肺的微血管、組織間隙(interstitial)和肺泡空間沉著，導(dǎo)致毛細(xì)管閉塞(capillary obliteration)和透明膜形成。外源性凝血途徑的組分(例如，組織因子(TF)、凝血酶和纖維蛋白)為炎癥細(xì)胞交通(traffic)的改變和血管滲透性的增加提供信號(hào)。前凝血?jiǎng)?procoagulant)和纖維蛋白還被認(rèn)為能促進(jìn)損傷中的其它關(guān)鍵事件，包括補(bǔ)體激活、前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、對(duì)纖維蛋白溶解的抑制和受損的肺的重構(gòu)。不欲被理論限制的情況下，據(jù)信，在ALI/ARDS期間，通過降低或阻止肺中這些初始化事件(外源性凝血)和下游作用(前炎性事件)，紊亂的纖維蛋白轉(zhuǎn)換(turnover)可被降低或阻止，嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能損傷的進(jìn)展可被降低或防止。凝血阻滯可以在多個(gè)位置靶向TF因子VIIa(TF-FVIIa)復(fù)合體，但是這些不同策略對(duì)肺損傷發(fā)展和炎癥的影響仍有待驗(yàn)證。實(shí)施例顯示了針對(duì)人類TF的嵌合單克隆抗體(cH36)及其Fab片段(cH36-Fab)對(duì)革蘭氏陰性膿毒病凝血初始化進(jìn)行阻止以及預(yù)防急性肺損傷的用途。
本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方式中欲用于通過降低或阻斷凝血級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵組分(即，RF)的活性，來預(yù)防或治療膿毒病和膿毒病相關(guān)征狀(例如，DIC、ALI和ARDS)。典型地，優(yōu)選的人化抗體、嵌合抗體及其片段能與人類TF特異性結(jié)合，以阻止FX或因子IX中的至少一種與TF復(fù)合體結(jié)合。典型地，此類優(yōu)選的抗體和片段還抑制或阻止該復(fù)合體的FX或FIX激活。因此，本發(fā)明的組合物和方法通過減少或預(yù)防關(guān)鍵分子組分的活性，降低或阻止對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的不想要的激活。
此類優(yōu)選的抗體與現(xiàn)有的抗體(例如O’Brien et al.的U.S.Pat No.6,274,142(“142”)中所提供的那些)不同。例如，142’專利報(bào)道了下述TF中和抗體，其不能與因子VII/VIIa結(jié)合或?qū)崿F(xiàn)因子IX或X的蛋白質(zhì)水解。相反，本發(fā)明的優(yōu)選抗體能顯著降低或阻止FX或FIX中的至少一種與TF復(fù)合體結(jié)合。還見PCT/US01/07501(WO01/70984)。
如前所述，不想要的凝血激活是某些炎性疾病的突出特征，特別是那些與自身免疫相關(guān)聯(lián)的。見Weinberg，et al.，Arthritis Rheum.34996-1005(1991)；Kincaid-Smith，Kidney Int 7242-253(1975)；Wakefield，et al.，J Clin Pathol 47129-133(1994)；Schoph，et al.，Arch Dermatol Res 285305-309(1993)；Zeher，et al.，ClinImmunol Immunopathol 71149-155(1994)；More，et al.，J Clin Pathol 46703-708(1993)。提高的TF水平已被報(bào)道與系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的疾病活性相關(guān)聯(lián)。見Segal，et al.，J Rheumatol 272827-2832(2000)。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是幫助控制組織因子介導(dǎo)的凝血，由此降低或在某些情況下阻止炎癥、病理性組織毀壞以及不想要的重構(gòu)，后者是多種炎性疾病的特點(diǎn)。
詞組“炎性疾病”(包括其復(fù)數(shù)形式)表示與不想要的TF介導(dǎo)的凝血激活相關(guān)聯(lián)的病理性征狀。優(yōu)選的炎性疾病通常與已知的或疑似的自身免疫征狀相關(guān)聯(lián)。典型地，如標(biāo)準(zhǔn)方法所測(cè)定的，此類疾病還與增加的前炎性細(xì)胞因子和/或趨化因子的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)。此類細(xì)胞因子的例子包括IL-1、TNFα、GM-CSF、M-CSF、IL-6、LIF、IL-15、IFNα和IL12。此類趨化因子的例子包括IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、ENA-78和PANTES。典型地，但非排除性地，新血管形成和血管外纖維蛋白沉著中的一種或多種與炎性疾病相關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的炎性疾病的更具體的例子包括關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選地，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)；腎小球性腎炎、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬、Sjogren’s綜合征和炎性腸病。關(guān)節(jié)炎可通過下述特征中的一種或其組合很容易地檢測(cè)到，所述特征包括滑膜炎癥的存在、血管翳形成和軟骨破壞。
本發(fā)明的優(yōu)選的用途將幫助降低、預(yù)防或減輕炎性疾病的癥狀，典型地，通過減少TF介導(dǎo)的凝血激活。此類通過TF的激活被相信能帶來多種壞處，其包括但不限于支持炎性分子產(chǎn)生、提高前炎性細(xì)胞活性、增加組織的破壞、增加不想要的重構(gòu)和促進(jìn)血管形成。本發(fā)明因此提供了一種新的基礎(chǔ)方法，用于通過提供與TF特異性結(jié)合并抑制其功能的組合物和方法，來應(yīng)對(duì)炎性疾病。
本發(fā)明的實(shí)施將特別有助于預(yù)防和治療炎性自身免疫疾病。近來的工作符合該創(chuàng)造性構(gòu)思。見Marty，et al.，J Clin Invest 107631-640(2001)；Varisco，etal.，Ann Rheum Dis 59781-787(2000)；Busso，et al.，Arthritis Rheum 48651-659(2003)。
如上文討論的，Wong，H.et al.的U.S.Pat.Nos.5,986,065和6,555,319和PCT/US98/04644(WO 98/40408)公開了一系列具有良好的與人類TF結(jié)合的特性的鼠抗TF抗體和抗原結(jié)合片段。此類抗體和片段可根據(jù)本發(fā)明使用。此外，此類抗體和片段可被用于治療實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)的膿毒病，例如，在相關(guān)嚙齒類模型中。但是，以及將被認(rèn)識(shí)到的，此類鼠抗體和片段通常不適合用于其它哺乳動(dòng)物中，例如靈長(zhǎng)類，以及特別是人類受試者。其它合適的抗體和片段由U.S.PatentApplication Publication No.20030082636、WO 03/037911和WO98/40408公開。
詞組“抗原結(jié)合片段”指抗體的、與抗原特異性結(jié)合的至少一部分。此類片段的例子包括抗體V結(jié)構(gòu)域。合適的V結(jié)構(gòu)域結(jié)合配偶體的例子包括C結(jié)構(gòu)域及其可接受的片段。其它合適的片段包括V結(jié)構(gòu)域的如下部分其對(duì)V結(jié)構(gòu)域而言的組合分子質(zhì)量(combinedmolecular mass)為大約15千道爾頓至大約40千道爾頓之間，優(yōu)選為大約20千道爾頓至大約30千道爾頓之間，更優(yōu)選地，大約15千道爾頓，這是通過多種標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)出的，所述方法包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或尺寸排除色譜(其中使用適當(dāng)大小的標(biāo)記片段)、質(zhì)譜分析或氨基酸序列分析。其它特異性抗原結(jié)合片段包括Fab、F(v)、Fab’、F(ab’)2和某些單鏈構(gòu)建體，包括抗體V結(jié)構(gòu)域。
此外，合適的抗原結(jié)合片段包括抗原結(jié)合V結(jié)構(gòu)域的至少一部分單獨(dú)或其與同源的(cognate)恒定(C)結(jié)構(gòu)域或其片段的組合(“同源的(cognate)被用于表示相同的免疫球蛋白重(H)或輕(L)鏈的兩組分之間的關(guān)系”)。典型的C結(jié)構(gòu)域片段具有大約5千道爾頓至大約50千道爾頓之間的分子質(zhì)量，更優(yōu)選地，大約10千道爾頓至大約40千道爾頓之間，這是通過多種標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)出的，所述方法包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或尺寸排除色譜(其中使用適當(dāng)大小的標(biāo)記片段)、質(zhì)譜分析或氨基酸序列分析。此外，合適的抗原結(jié)合片段還在下文以及Wong H.et al.的U.S.Pat.Nos 5,986,065和6,555,319以及PCT/US98/04644(WO 98/40408)中公開。還見U.S.Patent ApplicationPublication No.20030082636和下述國(guó)際申請(qǐng)WO 03/037911和WO98/40408。
如還提到的，一種用于最小化靈長(zhǎng)類動(dòng)物宿主(例如人類患者)的任何潛在的免疫排斥的方法是制造嵌合抗體。詞組“嵌合抗體”或相關(guān)的詞組(包括復(fù)數(shù)形式)指本文所公開的抗體，已用來自屬于不同物種(通常地，靈長(zhǎng)類，優(yōu)選地，人)的免疫球蛋白基因片斷對(duì)其輕鏈和重鏈基因進(jìn)行了構(gòu)建，典型地，通過遺傳工程來進(jìn)行。例如，來自小鼠抗體(例如H36)的基因的可變(V)結(jié)構(gòu)域可與人類恒定(C)結(jié)構(gòu)域連接，例如γ1、γ2、γ3或γ4。典型的治療用嵌合抗體因此是雜交蛋白，其由來自小鼠抗體的V或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與來自人類抗體的C或效應(yīng)物(effector)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，雖然其它哺乳動(dòng)物物種也可以使用。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的嵌合抗體是下面實(shí)施例中公開的抗組織因子抗體cH36。
用于本發(fā)明的合適的嵌合抗體可通過已知策略中的一種或組合來制造。如U.S.Pat.Nos 5,986,065和6,555,319以及PCT/US98/04644(WO 98/40408)中所公開的，可從多種來源容易地獲得高度有用的鼠抗TF抗體，包括American Type Culture Collection(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110)。所述抗體已被保藏，ATCC編號(hào)為HB-12255?；蛘?，可以根據(jù)例如U.S.Pat.Nos 5,986,065和6,555,319中所公開的程序，從頭制備合適的抗體(根據(jù)需要，多克隆的或單克隆的)。
還見U.S.Patent Application Publication No.20030082636和下述國(guó)際申請(qǐng)WO 03/037911和WO 98/40408。
以ATCC H36保藏的抗體在下文中被稱為H36。其還被稱為H36.D2和H36.D2.B7。被命名為H36的抗體是由母克隆產(chǎn)生的抗體，H36.D2是從一級(jí)克隆獲得的，而H36.D2.B7是從二級(jí)克隆獲得的。在抗體抑制TF的能力或其它物理性質(zhì)的方面，這三種克隆產(chǎn)生的抗體之間，沒有觀察到不同。在普通用途中，H36通常被用于表示由這些克隆中的任何種類或能生產(chǎn)抗體的相關(guān)細(xì)胞系產(chǎn)生的抗TF抗體。H36的小鼠-人嵌合版本被稱為cH36(也作Sunol-cH36)。關(guān)于H36抗體的更為具體的信息，還見U.S.Pat.No.5,986,065和PCT/US98/04644(WO 98/40408)。
優(yōu)選的嵌合抗體組合了來自合適的抗體(例如H36)的鼠可變結(jié)構(gòu)域和人類恒定結(jié)構(gòu)域。這種操作通常通過使用標(biāo)準(zhǔn)的核酸重組技術(shù)來獲得。多種不同種類的此類嵌合抗體可以通過如下方法來制備包括，例如，通過制造人類可變結(jié)構(gòu)域嵌合體，其中，可變結(jié)構(gòu)域中的部分，尤其是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域是人類來源的，僅有高變區(qū)是非人類來源的。見
S.L.Morrison，Science，2291202-1207(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4214(1986)；Teng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozobor et al.，Immunology Today 472-79(1983)；Olsson et al.，Meth.Enzymol.923-16(1983)；U.S.Pat.No.5,986,065；和PCT/US98/04644(WO 98/40408)。
編碼H36可變與恒定區(qū)域的核酸已被公開于，例如U.S.Pat No.5,986,065和PCT/US98/04644(WO 98/40408)。還見U.S.PatentApplication Publication No.20030082636、WO 03/037911和WO98/40408。
在一種實(shí)施方式中，抗TF嵌合抗體將包括人類輕鏈恒定(C)結(jié)構(gòu)域，即，Cк、Cλ或其片段。通常，人化輕鏈片段將具有大約80至大約250個(gè)氨基酸之間的氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選地，大約95至大約235個(gè)氨基酸之間，更優(yōu)選地，大約104至大約225個(gè)氨基酸之間。人化輕鏈片段的大小可用多種標(biāo)準(zhǔn)方法來測(cè)定，包括SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或尺寸排除色譜(其中使用適當(dāng)大小的標(biāo)記片段)、質(zhì)譜分析或氨基酸序列分析。
典型地，用于本發(fā)明的方法中的嵌合抗體還包括具有大約80至大約650個(gè)氨基酸之間的氨基酸長(zhǎng)度的人類重鏈可變(V)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地，大約95至大約540個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地，大約102至大約527個(gè)氨基酸，這是通過，例如，標(biāo)準(zhǔn)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳或尺寸排除色譜(其中使用適當(dāng)大小的標(biāo)記片段)、質(zhì)譜分析或氨基酸序列分析等測(cè)定的。
編碼合適的人類輕鏈C和V結(jié)構(gòu)域的核酸序列已被報(bào)道。見，例如，Kabat et al.in Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest Fifth Edition，U.S.Dept.of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991)NIH Publication No.91-3242；和GenBank.見，the NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)-Genetic Sequence Data Bank(Genbank)at the National Library of Medicine，38A，8N05，Rockville Pike，Bethesda，MD 20894.見，Benson，D.A.et al.，Nucl. Acids.Res.251(1997)for amore specific description of Genbank。
本文中報(bào)道的、用于制造嵌合抗體和其它抗體及片段的合適的重組技術(shù)已被公開。通常見Sambrook et al.in Molecular CloningA Laboratory Manual(2d ed.1989)；和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，(1989)。
對(duì)于其中需要針對(duì)抗TF抗體的最小化免疫應(yīng)答的一些發(fā)明應(yīng)用而言，制備人化抗體將是有用的。詞語(yǔ)“人化”表示下述免疫球蛋白，其包括至少一個(gè)人類FR亞群(subset)(優(yōu)選地，至少兩個(gè)或三個(gè)同樣的，更優(yōu)選地，四個(gè)人類FR亞群)，以及來自非人類來源的一個(gè)或多個(gè)CDR，所述來源通常是嚙齒類動(dòng)物，例如大鼠或小鼠的免疫球蛋白。典型地，本發(fā)明中優(yōu)選的人化免疫球蛋白將包括兩個(gè)或多個(gè)CDR，優(yōu)選為三個(gè)。恒定結(jié)構(gòu)域無須存在，但通常其有用于輔助預(yù)期用于體內(nèi)的人化抗體功能。如果存在的話，優(yōu)選的恒定結(jié)構(gòu)域，與人類免疫球蛋白的恒定結(jié)構(gòu)域高度相同，即，在氨基酸序列上至少大約90％相同，優(yōu)選地，至少大約95％或更高程度的相同。因此，人化免疫球蛋白的幾乎所有部分，可能除了CDR，優(yōu)選都與天然存在的人類免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分高度相同。
用于測(cè)定氨基酸序列相同性的方法是本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的，其包括，視覺觀察以及計(jì)算機(jī)輔助方法，其中使用BLAST和FASTA(可從National Library of Medicine(USA)網(wǎng)頁(yè)獲得)。用于大多數(shù)實(shí)施方式中的優(yōu)選的匹配程序可從關(guān)于國(guó)際ImMunoGeneTics(IMGT)數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)頁(yè)獲得，用于該實(shí)施方式的更為優(yōu)選的匹配程序是被稱為Match的程序，其可從Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。見G，Wu T.“Kabatdatabase and its applicationFuture directions”.Nucleic Acids Res.29205-206(2001)。
詞組“人化抗體”指，包括人化輕鏈和人化重鏈免疫球蛋白的抗體。見。前述S.L.Morrison、前述Oi et al.、前述Teng et al.、前述Kozbor et al.、前述Olsson et al.和前面提到的其它參考文獻(xiàn)。因此，“人化抗體片段”表示抗體的一部分，優(yōu)選地，與抗原特異性結(jié)合的部分。
可通過下述方法中的一種或組合來人化H36或cH36抗體，所述方法例如見，U.S Pat.Nos.5,766,886、5,693,762、5,985,279、5,225,539、EP-A-0239400、5,985,279和5,639,641，或者公開于公開的U.S.申請(qǐng)?zhí)?0030190705中的。關(guān)于對(duì)抗體進(jìn)行人化的其它信息，還見E.PadlanMol.Immunol.28489(1991)；Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；前述Junghans et al.和Roguska，et al.PNAS(USA)91969(1994)。
用于本發(fā)明的特定的人化抗體及其片段公開于下文中實(shí)施例部分。
優(yōu)選的嵌合抗體、人化抗體及其片段能與人類TF特異性結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”或類似的術(shù)語(yǔ)表示，本文中公開的、能與另一種分子結(jié)合，由此形成特異性結(jié)合對(duì)的分子。但是，通過，例如，Western印記ELISA、RIA、遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(mobility shift assay)、酶-免疫試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)、飽和試驗(yàn)或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)所確定的，該分子無法識(shí)別或結(jié)合其它分子。關(guān)于用于探測(cè)分子間特異性結(jié)合的方法的例子，通常見，Sambrook et al.in Molecular CloningA Laboratory Manual(2nded.1989)；和Ausubel et al.，supra；and Harlow and Lanein AntibodiesA Laboratory Manual(1988)Cold Spring Harbor，New York用于本發(fā)明的特別合適的嵌合抗體、人化抗體和片段具有下述特征中的至少一個(gè)1)關(guān)于TF的離解常數(shù)(dissociation constant，Kd)小于大約0.5nM；和2)關(guān)于TF的親合常數(shù)(Ka)小于大約10×1010M-1。進(jìn)行此類試驗(yàn)的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，其包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶免疫試驗(yàn)(EIA)、放射性免疫試驗(yàn)(RIA)和BIAcore分析。
此外合適的抗體將能在有時(shí)本文中稱為“標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)膿毒性休克試驗(yàn)(standard in vivo septic shock assay)”中增加存活時(shí)間。通常，此類試驗(yàn)包括將革蘭氏陰性細(xì)菌施予猴子，以誘導(dǎo)膿毒病。見Taylor et al.J.Clin.Invest.79918(1987)。更具體地，E.coli的劑量(大約1010CFU/kg)是新鮮制備的，以1-2小時(shí)的間隔，通過靜脈內(nèi)將其施予靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如狒狒或恒河猴。對(duì)對(duì)照組進(jìn)行鹽水或PBS注射。對(duì)治療組而言，在注入細(xì)菌前，例如，少于約1小時(shí)以前，快速推注至少1mg/kg抗體，優(yōu)選地，大約10mg/kg。然后對(duì)對(duì)照和治療組的猴子進(jìn)行大約一周的監(jiān)測(cè)，檢查其存活狀況。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)膿毒性休克試驗(yàn)的更為詳細(xì)的信息，見下述實(shí)施例。
本發(fā)明的一種優(yōu)選方法中使用能將猴子的存活時(shí)間(小時(shí)或天)提高至少大約2倍的人化抗體、嵌合抗體或片段，優(yōu)選地，至少大約3倍，更優(yōu)選地，至少大約5倍至10倍或更高，這是通過標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)膿毒性休克試驗(yàn)來測(cè)得的。
用于本發(fā)明的其他合適的抗體能在施予抗體至少大約5小時(shí)后，削弱(降低)受試哺乳動(dòng)物血漿中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素(IL-8)中至少一種的存在。用于從血漿中探測(cè)IL-6和IL-8以及對(duì)其進(jìn)行定量的方法是已知的，其包括免疫方法，例如RIA、EIA、ELISA等。
在一種方法中，以上文提到的方式在合適的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中誘導(dǎo)膿毒病，例如猴子，以及，優(yōu)選地，狒狒。在(用大約1010CFU/kg E.coli或鹽水)對(duì)對(duì)照狒狒進(jìn)行接種之前，對(duì)治療組快速推注至少1mg/kg抗體，優(yōu)選地，大約10mg/kg，這在注入細(xì)菌前，例如，在注射接種體前少于1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。通過標(biāo)準(zhǔn)方法來監(jiān)測(cè)狒狒的存活情況以及血漿中IL-6和IL-8的水平。
在另一種方法中，用被描述為“致敏膿毒病模型(primed sepsismodel)”的模型，在合適的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如狒狒中誘導(dǎo)類似膿毒病的征狀(見Welty-Wolf，K.et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med.1641988(2001)，進(jìn)一步的細(xì)節(jié)還描述于實(shí)施例4中)。
在用標(biāo)準(zhǔn)凝血酶原(PT)時(shí)間試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，尤其是將抗體或片段施予哺乳動(dòng)物大約5分鐘之后，其他優(yōu)選的人化抗體、嵌合抗體及其片段展示出大約50至大約350秒之間的血液凝固時(shí)間。特別有用的PT試驗(yàn)已被公開于例如U.S.Pat.Nos 5,986,065和6,555,319以及PCT/US98/04644(WO 98/40408)中。
通過標(biāo)準(zhǔn)血小板沉著試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，根據(jù)本發(fā)明使用的還優(yōu)選的抗體抑制了血小板沉著的至少大約50％。用于進(jìn)行所述試驗(yàn)的方法已被公開于，例如，未決的U.S.Pat.申請(qǐng)10/310,113中。
此外還優(yōu)選的抗體能在實(shí)驗(yàn)小鼠模型中抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。見實(shí)施例5。
“抗體”、“用于本發(fā)明的抗體”等詞組指能與目標(biāo)抗原結(jié)合的完整免疫球蛋白以及具有免疫活性的片段。免疫球蛋白及其具有免疫活性的(抗原結(jié)合)片段包括表位結(jié)合位點(diǎn)(即，能與識(shí)別抗原的抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn)或表位)。示例性的抗體片段包括，例如，F(xiàn)ab、F(v)、Fab’、F(ab’)2片段，通過減少免疫球蛋白的二硫鍵獲得的“半分子”，單鏈免疫球蛋白或其它合適的抗原結(jié)合片段(見，例如Bird etal.，Science，242423-426(1988)；Huston et al.，PNAS，(USA)，855879(1988)；Webber et al.，Mol.Immunol.，32249(1995))。
本發(fā)明的特定嵌合或人化抗體根據(jù)需要可以是多克隆的或單克隆的，其可以具有(不對(duì)其進(jìn)行限制)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型(isotype)或IgA、IgD、IgE、IgM。用于本發(fā)明的尤其優(yōu)選的抗體具有或可被加工為具有IgG1(被稱為“hOAT”)或IgG4(被稱為“hFAT”)同種型。此類抗體根據(jù)需要可以是多克隆的或單克隆的，以達(dá)到特定發(fā)明實(shí)施方式的目的。在一些情況下，單鏈抗體，例如人化單鏈將是優(yōu)選的。
本發(fā)明的實(shí)施可用于廣泛范圍的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如，猴子、黑猩猩或狒狒。更優(yōu)選地，靈長(zhǎng)類動(dòng)物是需要本文公開的方法的人類患者，即具有或疑似具有膿毒病或膿毒病相關(guān)征狀或炎性紊亂(disorder)或疾病的個(gè)體。
如上面所討論的，本發(fā)明的抗體及其合適的片段可被施予哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如人類，以預(yù)防或減少膿毒病和相關(guān)并發(fā)癥。根據(jù)一種實(shí)施方式，此類抗體與一種或多種藥學(xué)上可接受的非毒性載體共同使用，所述載體例如是滅菌水或鹽水、二元醇例如聚乙二醇、植物來源的油等。具體而言，具有生物兼容性、生物可降解性的丙交酯聚合物，丙交酯乙交酯共聚物或聚氧乙烯，聚氧丙烯共聚物可以是有用的賦形劑。其它可能有用的施予系統(tǒng)包括乙烯乙酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵和可植入的灌注系統(tǒng)(infusion system)和脂質(zhì)體。如果需要的話，一種或多種合適的抗體或片段將是溶液或懸浮液形式的(或可重構(gòu)為溶液或懸浮液的凍干形式)，并將優(yōu)選包括大約0.01％至10％(w/w)的本發(fā)明的抗體，優(yōu)選地，大約0.01％至5％(w/w)的抗體。
如所討論的，可根據(jù)本發(fā)明，將抗體或片段作為唯一活性試劑施用或與已知的其它抗膿毒病效法一起施用。例如，此類抗體或片段可在用一種或多種合適的抗生素干預(yù)(典型地，廣譜靜脈給藥抗生素療法)之前、之中或之后施予。優(yōu)選的抗生素包括那些已知具有廣譜抗微生物活性的抗生素，涵蓋抗革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性以及厭氧細(xì)菌。因此，在一種實(shí)施方式中，在施予本文公開的抗體及片段期間或之后，給予此類抗生素，優(yōu)選地，腸道外給予，劑量為足以獲得殺菌血清水平。在對(duì)患者進(jìn)行穩(wěn)定之后，多種被認(rèn)可的輔助療法(supportivetherapies)可被用于幫助痊愈，例如施予氧氣、靜脈注射液和增加血壓的藥物。透析在腎衰竭的事件中可能是必需的，如果發(fā)生了呼吸衰竭，機(jī)械換氣通常是需要的。
具有膿毒病和相關(guān)征狀發(fā)生“風(fēng)險(xiǎn)”的人包括但不限于非常老和非常年輕的個(gè)體。還處于風(fēng)險(xiǎn)中的是具有被攻擊的免疫系統(tǒng)(challenged immune systems)的那些個(gè)體，例如，感染有DNA或RNA病毒，例如HIV或皰疹的患者。幾乎任何的細(xì)菌生物都能導(dǎo)致膿毒病。某些真菌和(很少見)病毒能促進(jìn)膿毒病和相關(guān)征狀。通常，細(xì)菌或真菌釋放的毒素能導(dǎo)致直接的器官(例如，肺、腎)或組織損傷，并可導(dǎo)致低血壓和/或器官功能不良。這些毒素還使得身體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性應(yīng)答，其能導(dǎo)致膿毒性休克。
其它風(fēng)險(xiǎn)因素包括潛在的病癥，例如糖尿病，血癌(淋巴腺瘤或白血病)；以及泌尿生殖系統(tǒng)、肝或膽系統(tǒng)和腸系統(tǒng)的其它惡性腫瘤和疾病。其它的風(fēng)險(xiǎn)因素是新近的感染、長(zhǎng)時(shí)間的抗生素療法以及被暴露于新近的侵襲性手術(shù)或藥物方案。膿毒病和相關(guān)征狀的癥狀是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，其包括但不限于，發(fā)熱、寒戰(zhàn)、頭昏眼花、呼吸短促、心悸、發(fā)涼和/或蒼白的手足、發(fā)熱、焦躁(agitation)、嗜睡和精神混亂。
使用方法中的一種或組合，治療給予者可對(duì)本發(fā)明用于預(yù)防或治療膿毒病和相關(guān)征狀的成功進(jìn)行評(píng)估。典型地，前述癥狀中的一種或多種被減輕或消除可被作為膿毒病或相關(guān)征狀已被處理的標(biāo)志。優(yōu)選地，獲得此類治療的患者存活時(shí)間是未獲得此類干預(yù)的患者的至少約兩倍。
如所討論的，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物中減少細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，例如，通過向哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種能與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物中，因子X或因子IX與復(fù)合體的結(jié)合被抑制，該施用足以降低細(xì)胞因子的產(chǎn)生。合適的人化抗體、嵌合抗體或其片段公開于本文中。用于在哺乳動(dòng)物中監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)生的可接受的方法是已知的，其包括實(shí)施例部分列出的特定方法。
根據(jù)本發(fā)明的治療用抗體和片段可被用于非腸道或靜脈內(nèi)施予，特別是以液體溶液的形式。此類組合物可以方便地以單位劑量施予，可根據(jù)制藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法來制備。見Remington’s PharmaceuticalSciences，(mack Publishing Co.，Easton PA，(1980))。術(shù)語(yǔ)“單位劑量”指，物理分散單位中的本發(fā)明的治療組合物，其適合作為單位劑量用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如，人類，每個(gè)單位含有計(jì)算出能產(chǎn)生想要的治療效果的預(yù)先確定量的活性物質(zhì)以及所需的稀釋劑和載體。單位劑量取決于多種因素，包括將被治療的膿毒病的類型和嚴(yán)重程度、個(gè)體的普通健康狀況、治療歷史等。典型地，將被施予的抗體的精確量可由醫(yī)生的判斷來決定，但是，單位劑量通常將取決于施予途徑，其在每天10ng/kg體重至50mg/kg體重的范圍內(nèi)，更典型地，在每天100ng/kg體重至10mg/kg體重的范圍內(nèi)。用于強(qiáng)化注射中的最初施予的合適方案也是可變的，但是下述方案是典型的最初的施予，接著是通過隨后的注射或其它施予進(jìn)行的以一個(gè)或多個(gè)小時(shí)為間隔的重復(fù)劑量?；蛘?，可進(jìn)行足夠的連續(xù)或間歇靜脈內(nèi)輸注，以保持血液中抗體(或合適的片段)的濃度在至少大約10納摩爾/升至10微摩爾/升之間。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗體和片段在用于公開的方法和試驗(yàn)中時(shí)，是相當(dāng)純的?？贵w是“相當(dāng)純的”表示，已與天然情況下伴隨其的組分分離開的抗體或蛋白質(zhì)。例如，通過使用標(biāo)準(zhǔn)免疫親合或蛋白質(zhì)A親合純化技術(shù)，可用天然TF作為抗原或蛋白質(zhì)A樹脂，從雜交瘤或細(xì)胞培養(yǎng)基中純化出本發(fā)明的抗體。類似地，通過使用本發(fā)明的抗體，用標(biāo)準(zhǔn)免疫親合純化技術(shù)，可以獲得相當(dāng)純的形式的天然TF。具體而言，當(dāng)總蛋白中的至少50％(給定樣品中，總蛋白的重量％)是本發(fā)明的抗體或蛋白質(zhì)時(shí)，抗體或蛋白質(zhì)就是相當(dāng)純的。優(yōu)選地，抗體或蛋白質(zhì)占總蛋白的至少60重量％，更優(yōu)選地，至少75重量％，進(jìn)一步更優(yōu)選地，至少90重量％，最優(yōu)選地，總物質(zhì)的至少98重量％。純度可以通過已知方法容易地測(cè)得，例如，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、柱色譜(例如親合色譜、尺寸排除色譜)、質(zhì)譜或HPLC分析。優(yōu)選地，抗體和片段將以滅菌形式使用。
本發(fā)明的抗體的分子量將根據(jù)多種因素變動(dòng)，例如，其預(yù)期的用途，抗體是否包括綴合的(conjugated)或重組融合的毒素、藥物、放射性同位素或可探測(cè)到的標(biāo)記等。分子量還將根據(jù)對(duì)抗體進(jìn)行的翻譯后修飾(如果存在的話，例如糖基化)的本質(zhì)和程度而有所變動(dòng)。修飾是下述宿主的功能，所述宿主包括用于與產(chǎn)生非糖基化抗體的E.coli一起表達(dá)的宿主和產(chǎn)生糖基化抗體的真核宿主，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物。通常，本發(fā)明的抗體將具有大約20至150kDa之間的分子量。此類分子量可以通過分子尺寸方法，例如SDS-PAGE，接著進(jìn)行蛋白質(zhì)染色或Western印記分析容易地測(cè)定。
可將前述用于制造人化cH36抗體的方法容易地改造以制造根據(jù)本發(fā)明的其它人化抗體和抗原結(jié)合片段，這是顯而易見的。
A.制備人化抗組織因子結(jié)合抗體人化抗組織因子結(jié)合抗體的制備和用途被描述了。還見下面的實(shí)施例1-3。
簡(jiǎn)言之，優(yōu)選的抗體與人類組織因子結(jié)合，以形成結(jié)合復(fù)合體。組織因子可以是天然存在的或重組的人類組織因子(rhTF)。優(yōu)選地，因子X或因子IX與復(fù)合體的結(jié)合受到抑制。在一種優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式中，人化抗體具有小于大約1nM的針對(duì)hTF的表觀親合常數(shù)(KA，M-1)，優(yōu)選地，小于大約0.5nM，更優(yōu)選地，在大約0.01nM至大約0.4nM之間。關(guān)于測(cè)定人化抗體的親合常數(shù)的更多信息，見下文實(shí)施例1-3?！疤禺愋越Y(jié)合”指，用標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)，例如RIA、Western印記或ELISA進(jìn)行測(cè)量時(shí)，人化抗體與TF(或rhTF)形成可被探測(cè)到的結(jié)合復(fù)合體，而不與其它抗原結(jié)合。
更優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明制造的人化抗TF結(jié)合抗體，通過表面等離子(surface plasmon)分析(具體而言，根據(jù)下文中實(shí)施例3的方案的BIAcore分析)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，展示出至少大約1×10-8M-1的針對(duì)天然人類TF的表觀親合常數(shù)(KA，M-1)，更優(yōu)選地，通過表面等離子分析進(jìn)行測(cè)定時(shí)，至少大約5×108M-1，又更優(yōu)選地，通過表面等離子共振分析進(jìn)行測(cè)定時(shí)，針對(duì)天然人類TF的表觀親合常數(shù)(KA，M-1)為至少大約3×109M-1。本發(fā)明抗體的上述相當(dāng)高的結(jié)合親合性與以前報(bào)道的抗體的低得多的結(jié)合親合性明顯相反。
已通過本發(fā)明的方法人化的特定組織因子結(jié)合抗體，即H36.D2.B7的核酸(SEQ ID NOS.1和3)和氨基酸(SEQ ID NOS.2和4)序列。例如，見附圖的圖1A和1B，以及PCT申請(qǐng)WO 98/40408。SEQ IDNOS.1和2分別是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列，SEQ IDNOS.3和4分別是重鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸和氨基酸序列，在所有這些序列中，用下劃線表示高變區(qū)(CDRs或互補(bǔ)決定區(qū)域)。
本發(fā)明的其它組織因子結(jié)合人化抗體將與圖1A和1B所示的輕鏈或重鏈的其中之任一或全部具有高度的氨基酸序列相同性。更具體地，此類抗體包括與SEQ ID NOS.2和/或4具有至少大約百分之七十的同源性(氨基酸序列相同性)的那些，更優(yōu)選地，與SEQ ID NOS.2和/或4具有大約百分之八十或更高同源性，進(jìn)一步更優(yōu)選地，與SEQID NOS.2和/或4具有大約百分之八十五、九十或九十五或更高同源性。
本發(fā)明的更特殊的組織因子結(jié)合人化抗體將與SEQ ID NOS.2和4的高變區(qū)(圖1A和1B中的雙下劃線部分)具有高度的氨基酸序列相同性。特定抗體將具有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域上的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)高變區(qū)，其與H36.D2.B7的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)相應(yīng)的高變區(qū)具有高度的序列相同性(至少90％或95％的氨基酸序列相同性)或與它們相同，(所述相應(yīng)的高變區(qū)在圖1A中以下劃線表示，還顯示于下文中)1)LASQTID(SEQ ID NO.5)；2)AATNLAD(SEQ ID NO.6)；和3)QQVYSSPFT(SEQ ID NO.7)。
能與組織因子結(jié)合的、已通過本文所述的方法人化的其它特定的抗體將具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)高變區(qū)，其與H36.D2.B7的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)相應(yīng)的高變區(qū)具有高度的序列相同性(至少90％或95％的氨基酸序列相同性)或與它們相同，(所述相應(yīng)的高變區(qū)在圖1B中以下劃線表示，還顯示于下文中)
1)TDYNVY(SEQ ID NO.8)；2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO.9)；和3)DVTTALDF(SEQ ID NO.10)。
優(yōu)選地，編碼本文公開的部分或全部抗體或片段的某些核酸將具有足夠(優(yōu)選地，至少大約100、200或250個(gè)堿基對(duì))的長(zhǎng)度，以在下述中度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件(本文中被稱為“正常嚴(yán)謹(jǐn)度”條件)下與SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.3的序列結(jié)合在37℃的溫度下，使用包含溶于0.9M鹽水/0.12M檸檬酸鈉(6xSSC)緩沖液中的20％甲酰胺的雜交緩沖液，在37℃用2xSSc緩沖液洗一次的時(shí)候，保留結(jié)合。
更具體地，某些核酸(優(yōu)選地，至少大約100、200或250個(gè)堿基對(duì))在下述高度嚴(yán)謹(jǐn)條件(本文中被稱為“高嚴(yán)謹(jǐn)度”條件)下將與SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3的序列結(jié)合在42℃的溫度下，使用包含溶于0.9M鹽水/0.12M檸檬酸鈉(6xSSC)緩沖液中的20％甲酰胺的雜交緩沖液，在37℃用1xSSc緩沖液洗兩次的時(shí)候，保留結(jié)合。
優(yōu)選地，合適的核酸包含至少20個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選地，至少大約50個(gè)堿基對(duì)，進(jìn)一步更優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸包含至少大約100、200、250或300個(gè)堿基對(duì)。
本發(fā)明的優(yōu)選的核酸通常將表達(dá)本發(fā)明的抗體，所述抗體展示出如本文所公開的優(yōu)選的結(jié)合親合力和其它屬性。更多信息還見U.S.Pat.No.5,986,065和PCT/US98/04644(WO 98/40408).
其它合適的核酸將與圖1A和1B所示的輕鏈或重鏈序列中之任一或全部具有相當(dāng)高的序列相同性。更具體地，優(yōu)選的核酸將包含與SEQID NOS.1和/或3具有至少大約百分之七十同源性(核苷酸序列相同性)的序列，更優(yōu)選地，與SEQ ID NOS.1和/或3具有大約百分之八十或更高的同源性，進(jìn)一步更優(yōu)選地，與SEQ ID NOS.1和/或3具有大約百分之八十五、九十或九十五或更高的同源性。
還有特定的核酸序列將與SEQ ID NOS.1和3的高變區(qū)(在圖1A和1B中以下劃線表示)具有高度的序列相同性。此類核酸包括下述這些所述核酸用于編碼抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并具有用于編碼高變區(qū)的一條、兩條或三條序列，其與編碼H36.D2.B7的相應(yīng)高變區(qū)的一條、兩條或三條序列具有高度的序列相同性(至少90％或95％的核苷酸序列相同性)或與它們相同，(這些相應(yīng)高變區(qū)在圖1A中以下劃線表示，還顯示于下文中)1)CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQ ID NO11)；2)GCTGCCACCAACTTGGCAGAT(SEQ ID NO12)；和3)CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(SEQ ID NO13)。
更特定的核酸還編碼抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并具有用于編碼高變區(qū)的一條、兩條或三條序列，其與編碼H36.D2.B7的相應(yīng)高變區(qū)的一條、兩條或三條序列具有高度的序列相同性(至少90％或95％的序列相同性)或與它們相同，(這些相應(yīng)高變區(qū)在圖1B中以下劃線表示，還顯示于下文中)1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO.14)；2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO.15)；和3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO.16)。
用于本發(fā)明的方法的結(jié)合TF的更特定的人化抗體是下述這些其構(gòu)架區(qū)域(FRs)1、2、3和4中的每一個(gè)都與圖3A所示的輕鏈FR序列(SEQ ID NO.＿＿)，優(yōu)選地，圖3A中以“LC-09”表示的序列具有至少大約90％的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，至少大約95％或更高的相同性。此外特定的人化抗體包括輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其與圖5A(SEQ ID NO.＿＿)或圖6A(SEQ ID NO.＿＿)所示的序列具有至少大約90％的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，至少大約95％或更高的序列相同性。
進(jìn)一步特定的人化抗體是下述這些其構(gòu)架區(qū)域(FRs)1、2、3和4中的每一個(gè)都與圖4A所示的重鏈序列(SEQ ID NO.＿＿)，優(yōu)選地，圖4A中以“HC-08”表示的序列具有至少大約90％的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，大約95％或更高的相同性。此外的人化抗體具有重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其與圖5B(SEQ ID NO.＿＿)或圖6B(SEQ IDNO.＿＿)所示的序列具有至少大約90％的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，至少大約95％或更高的序列相同性。
在某些實(shí)施方式中，人化抗體將具有如公布的U.S.申請(qǐng)?zhí)?0030190705所公開的IgG1(hOAT)或IgG4(hFAT)同種型。
本發(fā)明還提供了本文公開的人化抗體的功能性片段。此類片段的例子包括但不限于，以小于大約1nM的親和常數(shù)(Kd)與TF結(jié)合的那些，優(yōu)選地，小于大約0.5nM，更優(yōu)選地，在大約0.01nM至大約0.4nM之間。具體優(yōu)選的是抗原結(jié)合Fab、Fab’和F(ab)2片段。
如所討論的，本發(fā)明涉及下述人化抗體，其包括至少一種鼠的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)，例如，CDR1、CDR2、CDR3。在一種發(fā)明實(shí)施方式中，抗體與人類組織因子(TF)特異性結(jié)合，形成復(fù)合體。典型地，因子X或因子IX與TF或TF-FVIIa的結(jié)合以及由TF-FVIIa對(duì)其的活化受到抑制。如上文提到的，優(yōu)選的CDR(輕鏈和重鏈)來自嚙齒類來源，典型地，來自小鼠。
在本發(fā)明的人化抗體的一種實(shí)施方式中，抗體還包括至少一個(gè)人類構(gòu)架區(qū)域(FR)亞群。優(yōu)選地，所有的FRs(輕鏈和重鏈)都是人類的。
在更為特殊的實(shí)施方式中，與人類TF結(jié)合的重鏈高變區(qū)的第一個(gè)CDR(CDR1)與圖4B所示的CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。典型地，重鏈高變區(qū)的第二個(gè)CDR(CDR2)與圖4C所示的CDR2氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。還優(yōu)選地，重鏈高變區(qū)的第三個(gè)CDR(CDR3)與圖4D所示的CDR3序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，更優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。
在另一種發(fā)明實(shí)施方式中，與人類TF結(jié)合的輕鏈高變區(qū)的第一個(gè)CDR(CDR1)與圖3B所示的CDR1氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，至少大約95％相同或更高。典型地，輕鏈高變區(qū)的第二個(gè)CDR(CDR2)與圖3C所示的CDR2氨基酸序列(SEQID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，大約95％相同或更高。優(yōu)選地，輕鏈高變區(qū)的第三個(gè)CDR(CDR3)與圖3D所示的CDR3氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，更優(yōu)選地，與該序列至少95％相同或更高。
適合用于本發(fā)明方法的其它人化抗體包括與人類TF結(jié)合的重鏈高變區(qū)的第一個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR1)，該FR1與作為“FR1 HC-08”所顯示的、圖4A中的氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，F(xiàn)R1包含下述氨基酸改變中的至少一種E1到Q；Q5到V；P9到G；L11到V；V12到K；Q19到R；以及T24到A。優(yōu)選地，F(xiàn)R1包括這些改變中的兩種、三種、四種、五種或六種，具有全部這些氨基酸改變對(duì)于很多應(yīng)用來說是優(yōu)選的。
其它人化抗體適當(dāng)?shù)嘏c人類TF結(jié)合，其包括重鏈高變區(qū)的第二個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR2)，該FR2與作為“FR2 HC-08”顯示的、圖4A中所顯示的序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，該FR2具有下述氨基酸改變中的至少一種H41到P和S44到G。優(yōu)選的FR2包括這兩種氨基酸改變。
本發(fā)明還涉及對(duì)與人類TF結(jié)合的人化抗體的使用，其中，重鏈高變區(qū)的第三個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR3)與作為“FR3 HC-08”所顯示的、圖4A中的序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，F(xiàn)R3包含下述氨基酸改變中的至少一種S76到T；T77到S；F80到Y(jié)；H82到E；N84到S；T87到R；D89到E和S91到T。優(yōu)選地，F(xiàn)R3包括這些氨基酸改變中的兩種、三種、四種、五種或六種，具有全部七種上述氨基酸改變通常是優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及適當(dāng)?shù)嘏c人類TF結(jié)合的人化抗體，其中，重鏈高變區(qū)的第四個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR4)與作為“FR4 HC-08”顯示的、圖4A中所顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。優(yōu)選地，F(xiàn)R4包括如下氨基酸改變L113到V。
其它人化抗體與人類TF結(jié)合，還涉及輕鏈高變區(qū)的第一個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR1)，其與作為“FR1 LC-09”所顯示的、圖3A中的氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少大約90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，F(xiàn)R1包含下述氨基酸改變中的至少一種Q11到L；L15到V；E17到D；和S18到R。優(yōu)選的FR1包括此類氨基酸改變中的兩種或三種，具有全部四種氨基酸改變通常是優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及對(duì)與人類TF結(jié)合的人化抗體的使用，其中，輕鏈高變區(qū)的第二個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR2)與作為“FR2 LC-09”所顯示的、圖3A中的氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少大約90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。優(yōu)選的FR2具有下述氨基酸改變Q37到L。
還包括在本發(fā)明內(nèi)的是對(duì)與人類TF結(jié)合的特殊人化抗體的使用，其中，輕鏈高變區(qū)的第三個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR3)與作為“FR3 LC-09”所顯示的、圖3A中的氨基酸序列(SEQ ID NO.＿＿)至少大約90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，F(xiàn)R3包含下述氨基酸改變中的至少一種K70到D；K74到T；A80到P；V84到A和N85到T。優(yōu)選地，F(xiàn)R3包括此類氨基酸改變中的兩種、三種或四種，具有全部五種氨基酸改變通常是優(yōu)選的。
其它適用于本文公開的方法的人化抗體能與TF結(jié)合，并包括輕鏈高變區(qū)的第四個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR4)，其與作為“FR4 LC-09”所顯示的、圖3A中的序列(SEQ ID NO.＿＿)至少大約90％相同，優(yōu)選地，與該序列至少大約95％相同或更高。在一種實(shí)施方式中，F(xiàn)R4包含下述氨基酸改變中的至少一種，優(yōu)選地，所有的如下改變A100到Q和L106到I。
本發(fā)明還涉及前述人化抗體的人類TF結(jié)合片段。此類片段的例子包括Fab、Fab’和F(ab)2。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明制造的另外優(yōu)選的人化抗TF抗體，見公布的U.S.申請(qǐng)?zhí)?0030190705和其中引用的參考文獻(xiàn)。
遵循Budapest Treaty，下述三種核酸載體，pSUN36(人化抗TF抗體Ig G1-HC表達(dá)載體)、pSUN37(人化抗TF抗體Ig G4-HC表達(dá)載體)和pUSN38(人化抗TF抗體LC表達(dá)載體)已被保藏于10801University Boulevard，Manassas VA 20110-2209的American TypeCulture Collection(ATCC)。這些載體被分配了如下的編號(hào)PTA-3727(pSUN36)；PTA-3728(pSUN37)和PTA-3729(pSUN38)。
用于制造和使用本發(fā)明的抗TF抗體的合適的表達(dá)和純化策略已被公開于例如公布的U.S.申請(qǐng)?zhí)?0030190705中。
如所討論的，本發(fā)明還提供了用于進(jìn)行本文提供的方法中的一種或多種的有用的試劑盒。在一種實(shí)施方式中，所述試劑盒包括至少一種能與人類組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合受到抑制。還典型地，人化抗體、嵌合抗體或其片段被提供于藥學(xué)上可接受的載體(vehicle)中，例如鹽水、水或緩沖液。所述試劑盒可以包括藥學(xué)上可接受的用于在使用前溶解人化抗體、嵌合抗體或其片段的載體。
下述非限制性的實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述。在下述實(shí)施例以及別處中，將本發(fā)明的方法用于對(duì)鼠抗組織因子抗體H36的人化。見U.S Patent Nos.5,986,065和6,555,319；U.S.Patent ApplicationPublication No.20030082636；WO 03/037911和WO 98/40408，以及公布的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)?0030190705，和其中引用的參考文獻(xiàn)，以及上述討論。一些情況下，為方便的緣故，將H36或cH36的Fab片段分別稱為“H36-Fab”和“cH36-Fab”。
本文中提到的所有文件都通過引用的方式被整體完全包括進(jìn)本文中。
實(shí)施例1 抗組織因子抗體的人化U.S.Pat.Nos.5,986,065和6,555,319中描述了怎樣制造和使用被稱為H36.D2(一些時(shí)候還稱為H36，如上所述)的特定鼠抗體。本實(shí)施例顯示了怎樣制造和使用該抗體的人化版本。人化的H36抗體具有多種用途，包括幫助最小化人類抗小鼠抗體(HAMA)免疫應(yīng)答的可能。這些和其它不想要的應(yīng)答引起了關(guān)于在人類治療應(yīng)用中使用H36抗體的問題。
A.制備嵌合抗組織因子抗體(cH36)前述H36抗體是IgG2a鼠抗體。先將H36轉(zhuǎn)化為用于臨床發(fā)展的小鼠-人類嵌合抗體。為達(dá)到該目的，克隆H36的重鏈和輕鏈基因(見U.S.Patent NO.5,986,065)。將重鏈可變結(jié)構(gòu)域與人類IgG4恒定(Fc)結(jié)構(gòu)域融合，將輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與人類kappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合。得到的IgG4к嵌合抗體被命名為cH36(也被稱為Sunol-cH36)。就H36或cH36在具有慢性疾病的患者中的多種用途而言，完全人化的cH36是優(yōu)選的，其將能降低或消除任何的人抗嵌合抗體(HACA)免疫應(yīng)答。對(duì)cH36的人化如下所述。
B.cH36抗體的人化策略對(duì)嵌合抗組織因子抗體cH36的人化可以通過本發(fā)明的“FR最好適合(best-fit)”方法來獲得。該方法最大程度上利用了下述事實(shí)具有已知氨基酸序列或人類IgG片段序列的大量的人類IgGs是公眾數(shù)據(jù)庫(kù)中可獲得的。cH36中小鼠重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的個(gè)體構(gòu)架區(qū)域的序列與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(see e.g.，Kabat et al.in Sequences of Proteins of Immunological Interest FifthEdition，U.S.Dept.of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991)NIH Publication No.91-3242或http://immuno.bme.nwu.edu)。中的相應(yīng)重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或人類構(gòu)架(或其片段)的序列相比。下述標(biāo)準(zhǔn)被用于選出用于人化的想要的人類IgG構(gòu)架區(qū)域亞群(1)錯(cuò)配的氨基酸的個(gè)數(shù)被保持為盡可能的低。(2)“游標(biāo)(vernier)”區(qū)域內(nèi)部的氨基酸(該區(qū)域內(nèi)的氨基酸可對(duì)CDR結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以及微調(diào)與抗原的適合程度，見Foote，J.and Winter，G.，J.of Mol.Bio.224(2)487-499 )保持不變。(3)當(dāng)對(duì)相似的候選者進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，保守氨基酸取代是優(yōu)先的。用于這種比較的匹配程序可在Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。見Johnson G，Wu T.“Kabat database and itsapplicationFuture directions.”Nucleic Acids Res.29205-206(2001)。程序發(fā)現(xiàn)并比對(duì)了Kabat’s數(shù)據(jù)庫(kù)中人類序列與小鼠序列之間的同源性區(qū)域。通過使用這種獨(dú)特的FR最好適合方法，可以預(yù)見到，目標(biāo)IgG的人化LC或HC可變結(jié)構(gòu)域可以具有來自少至一種人類IgG分子或多達(dá)四種不同的人類IgG分子的全部四種FRs。
B(i).對(duì)人類IgG Kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)域的選擇將cH36 LC的每個(gè)構(gòu)架區(qū)域中的氨基酸序列與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的FRs的氨基酸序列相比?；谏鲜鋈齻€(gè)標(biāo)準(zhǔn)來選擇最好適合的FR。
具有Kabat Database ID No.005191的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 LC FR1進(jìn)行人化。具有Kabat Database ID No.019308的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 LC FR2進(jìn)行人化。在cH36 LC FR1中制造出下述突變，以與具有Kabat Database ID No.015191的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列匹配Q11→L，L15→V，E17→D，S18→R。在cH36 LC FR2中制造出Q37→L的突變，以與具有Kabat Database ID No.019308的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列匹配(序列信息見表1A)。
具有Kabat Database ID No.038233的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 LC FR3進(jìn)行人化。具有Kabat Database ID No.004733的人類IgG kappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 LC FR4進(jìn)行人化。在cH36 LC FR3中制造出下述突變，以與具有Kabat Database ID No.038233的人類IgG kappa輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列匹配K70→D，K74→T，A80→P，V84→A，N85→T。在cH36 LC FR4中制造出A100→Q和L106→I的兩種突變，以與具有Kabat Database ID No.004733的人類IgGkappa輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列匹配(序列信息見表1B)。
B(ii).對(duì)人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)域的選擇將cH36 HC的每個(gè)構(gòu)架區(qū)域中的氨基酸序列與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的FRs的氨基酸序列相比?；谏鲜鋈齻€(gè)標(biāo)準(zhǔn)來選擇最好適合的FR。
具有Kabat Database ID No.000042的人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 HC FR1進(jìn)行人化。具有KabatDatabase ID No.023960的人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 HC FR2進(jìn)行人化。在cH36 HC FR1中制造出下述突變，以與具有Kabat Database ID No.000042的人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列匹配E1→Q，Q5→V，P9→G，L11→V，V12→K，Q19→R，T24→A。在cH36 HC FR2中制造出H41→P和S44→G的兩個(gè)突變，以與具有Kabat Database ID No.023960的人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列匹配(序列信息見表2A)。
具有Kabat Database ID No.037010的人類IgG重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 HC FR3進(jìn)行人化。具有KabatDatabase ID No.000049的人類IgG kappa重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被選出，用于對(duì)cH36 HC FR4進(jìn)行人化。在cH36 HC FR3中制<p>實(shí)施例284(6S，7S)-6-{[4-(4，5-二甲基-1，3-噻唑-2-基)哌啶-1-基]羰基}-N-羥基-5-氮雜螺[2.5]辛烷-7-甲酰胺使用與實(shí)施例1相似的方法制備該化合物，Ms(ESI)(M+H)+＝393.1。
以下表1中列出實(shí)施例的化合物。
表1


一旦決定了想要的人類構(gòu)架區(qū)域，下面三種技術(shù)就被用于獲得輕鏈和重鏈中想要的氨基酸取代(1)普通PCR被用于克隆，以將克隆或診斷用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入，以及以改變定位于可變結(jié)構(gòu)域末端的氨基酸殘基。(2)基于PCR的誘變被用于同時(shí)改變多個(gè)氨基酸位點(diǎn)，尤其是當(dāng)這些殘基位于可變結(jié)構(gòu)域中間的情況下。(3)定點(diǎn)誘變被用于將一種或兩種氨基酸取代同時(shí)引入。按照Stratagene’s“QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit”(Catalog#200518)來進(jìn)行定點(diǎn)誘變。
每個(gè)步驟之后，對(duì)經(jīng)過部分人化的克隆進(jìn)行測(cè)序，稍后將這些可變結(jié)構(gòu)域中的一些克隆進(jìn)表達(dá)載體。質(zhì)粒tKMC180被用于表達(dá)LC突變體，pJRS 355或pLAM 356載體被用于表達(dá)HC突變體，分別作為IgG1或IgG4。然后將這些克隆中的一些組合起來，在COS細(xì)胞中短暫表達(dá)，以通過ELISA來確定表達(dá)水平。
抗TF重和輕可變結(jié)構(gòu)域的最終完全人化的形式被克隆到某些時(shí)候在本文中被稱為“大載體(mega vector)”的材料中，并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO和NSO細(xì)胞，用于IgG表達(dá)。然后用穩(wěn)定的細(xì)胞系來生產(chǎn)足以用于分析的量的人化抗TF。得到的人化版本是100％人類來源的(不考慮CDR序列的話)。人化的IgG4 kappa版本被命名為hFAT(humanized IgGFourAnti-Tissue Factor Antibody，人化IgG四抗組織因子抗體)，IgG1 kappa版本被命名為hOAT(humanized IgGOneAnti-Tissue Factor Antibody，人化IgG-抗組織因子抗體)。cH36的這些完全人化的版本將被用于治療慢性指征(indication)，例如血栓形成、癌癥以及炎性疾病。
C.產(chǎn)生人化的抗TF抗體重鏈1.用質(zhì)粒pJAIgG4TF.A8(用于嵌合H36的表達(dá)載體)作為模板，用引物TFHCls2和TFHC1as2，來對(duì)抗TF mAb cH36重鏈(HC)可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和向pGem T-easy中的克隆。引物TFHC1s2引入了起始密碼子上游的BsiW1位點(diǎn)，以及構(gòu)架(FR)1中的E1到Q的氨基酸改變。引物TFHC1as在FR4中引入了L113到V的氨基酸改變。該步驟產(chǎn)生了構(gòu)建體HC01。
2.用前面的構(gòu)建體(HC01)和下述四種引物進(jìn)行基于PCR的誘變，產(chǎn)生了構(gòu)建體HC02。上游PCR使用引物TFHC1s2和TFHC7as。
下游PCR用引物TFHC7s和TFHC1as2。用上游和下游PCR產(chǎn)物作為模板，使用引物TFHC1s2和TFHC1as2進(jìn)行PCR，產(chǎn)生了HC02。用引物TFHC7s和TFHC7as向FR2中引入了兩種氨基酸改變H41到P以及S44到G。
3.用HC02作為模板，用下述四種引物進(jìn)行基于PCR的誘變，產(chǎn)生構(gòu)建體HC03。上游PCR使用引物TFHC1s2和TFHC5as2。下游PCR用引物TFHC5s和TFHC1as2。用上游和下游PCR產(chǎn)物作為模板，使用引物TFHC1s2和TFHC1as2進(jìn)行PCR，產(chǎn)生了HC03。用引物TFHC5s和TFHC5as2向FR3中引入了三種氨基酸改變T87到R、D89到E和S91到T。還在位點(diǎn)87引入了BglII位點(diǎn)。
4.用引物TFHC2s和TFHC3as，用pGem中的HC03作為模板來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TFHC2s位于pGem克隆位點(diǎn)的上游。TFHC3as位于構(gòu)架3中，在FR3中引入了兩種氨基酸改變H82到E和N84到S。將得到的PCR條帶克隆進(jìn)pGem，然后用BsiWI和BglII來消化合適尺寸的插入物。將該片段克隆進(jìn)HC03產(chǎn)生了HC04。
5.用HC04作為模板以及下述引物進(jìn)行基于PCR的誘變，得到了HC05。上游PCR使用引物TFHC1s2和TFHC6as。下游PCR使用引物TFHC6s和TFHC1as2。用上游和下游PCR產(chǎn)物作為模板，用引物TFHC1s2和TFHC1as2進(jìn)行誘變PCR，產(chǎn)生了HC05。該步驟在FR3中引入了如下氨基酸改變S76到T，T77到S和F80到Y(jié)。
6.用HC05作為模板以及下述四種引物進(jìn)行基于PCR的誘變，得到了HC06。上游PCR使用引物TFHC2s和TFHC2as2。下游PCR使用引物TFHC3s2和TFHC1as2。用TFHC2as2進(jìn)行的擴(kuò)增在FR1中引入了氨基酸改變P9到G。引物TFHC3s2將Q19改變?yōu)镽，T24改變?yōu)锳。用上游和下游PCR產(chǎn)物作為模板，用引物TFHC1s2和TFHC1as2進(jìn)行PCR，產(chǎn)生了HC06。
7.在構(gòu)建HC06期間，自發(fā)地引入了FR1的位點(diǎn)2上從I到M的點(diǎn)突變。用HC06作為模板，用TFHC1s3和TFHC1as2作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，更正了該錯(cuò)誤的取代，還在FR1中引入了氨基酸改變Q5到V。得到的構(gòu)建體是HC07。
8.用HC07作為模板，和用下述引物通過基于PCR的誘變來制造構(gòu)建體HC08。TFHC2s和TFHC2as3被用于上游產(chǎn)物。下游產(chǎn)物是用TFHC1s3和TFHC1as2在前面擴(kuò)增出來的(見步驟7)。用引物TFHC2as3在FR1中引入兩種氨基酸改變L11到V和V12到K。自發(fā)的點(diǎn)突變導(dǎo)致了CDR2的位點(diǎn)64上發(fā)生了苯丙氨酸向亮氨酸的改變(F→L)。進(jìn)一步的篩選和測(cè)序產(chǎn)生了構(gòu)建體HC08R1，其CDR2上的位點(diǎn)64處具有正確的序列。
9.通過定點(diǎn)誘變，從HC07來產(chǎn)生兩個(gè)構(gòu)建體HC11和HC12。用HC07作為模板，使用兩種互補(bǔ)引物TFHC8sP和TFHC8asP來產(chǎn)生HC11，其含有FR1上的三種氨基酸改變G9到P，L11到V和V12到K。然后，對(duì)HC11進(jìn)行甲基化和柱純化，用于下一輪定點(diǎn)誘變。用HC11作為模板，用互補(bǔ)引物TFHC9sL和TFHC0asL進(jìn)行PCR，產(chǎn)生HC12，其具有FR1中從V11到L的突變。
10.通過用HC12作為模板，用互補(bǔ)引物TFHC10sK和TFHC10asK進(jìn)行PCR，從HC12獲得構(gòu)建體HC09。HC09含有氨基酸改變FR1中，K12到V。
11.從HC09來制造構(gòu)建體HC10。用HC09作為模板，用互補(bǔ)引物L(fēng)V-1和LV-2進(jìn)行PCR，結(jié)果產(chǎn)生了HC10，其含有FR1中的從L11到V的突變。
每個(gè)突變步驟之后，對(duì)經(jīng)過部分人化或完全人化的克隆進(jìn)行測(cè)序，稍后將這些可變結(jié)構(gòu)域中的一些克隆進(jìn)表達(dá)載體。將pJRS355或pLAM356載體用于表達(dá)與人類IgG1或IgG4的Fc融合的HC突變體。
圖3A-D概括了步驟1-11，顯示了引入到FR1-4中的增加的(incremental)氨基酸改變。除HC08之外，所有其它重鏈突變體和cH36在CDR2中都含有位點(diǎn)64上的F。HC08具有位點(diǎn)64上的從F到L的突變。圖4B-D顯示了重鏈CDR序列。
用于重鏈人化的引物TFHC1s25’TTTCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC 3’TFHC1as25’AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG 3’TFHC7s5’GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG 3’TFHC7as
5’CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC 3’TFHC5s5’GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG 3’TFHC5as25’CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC 3’TFHC3as5’GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG 3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 3’TFHC6s5’CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG 3’TFHC6as5’CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG 3’TFHC2as25’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC 3’TFHC3s25’CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC3’TFHC1s35’TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC 3’TFHC2as35’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC 3’TFHC9sL5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG 3’TFHC9asL5’CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC 3’TFHC8sP5’GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC 3’TFHC8asP5’GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3’TFHC10sK
5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC 3’TFHC10asK5’GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC 3’LV-15’CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG 3’LV-25’CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG 3’D.產(chǎn)生人化抗TF抗體輕鏈1.用質(zhì)粒pJAIgG4TF.A8(用于嵌合H36的表達(dá)載體)作為模板，用引物TFLC1s2.1和TFLC1as2來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟向編碼區(qū)域的上游引入了克隆位點(diǎn)AgeI。其還在FR4中引入了L106I突變。該步驟產(chǎn)生了構(gòu)建體LC03。
2.用互補(bǔ)引物TFLC5s和TFLC5as，用LC03作為模板，來進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該步驟在FR2中引入了突變Q37L，為診斷目的加入了PstI位點(diǎn)。該新構(gòu)建體被命名為L(zhǎng)C04。
3.用LC04作為模板，用引物TFHC2s和TFLC2as1來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟產(chǎn)生了將被用于步驟6中的片段A。該步驟在FR1中引入了Q11L和L15V突變。
4.用LC04作為模板，用引物TFLC1s2.1和TFLC1asR來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這在LC可變結(jié)構(gòu)域的末端引入了KPnI位點(diǎn)。將該P(yáng)CR片段克隆進(jìn)pGEM產(chǎn)生了將被用于步驟6中的pGEM04K。
5.用LC04作為模板，用引物TFLC2s和TFLC4as來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟產(chǎn)生了將被用于步驟6中的片段C。三種突變FR1中的E17D、S18R和FR4中的A100Q在該步驟中被引入。
6.用片段A和片段C作為模板，用引物TFHC2s和TFLC4as，進(jìn)行基于PCR的誘變，產(chǎn)生片段D。將片段D克隆進(jìn)pGEM04K產(chǎn)生了構(gòu)建體LC05。
7.用pGEM04K作為模板，用引物TFLC1s2.1和TFLC4as來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟產(chǎn)生了片段H，然后將其克隆進(jìn)pGEM04K。這在FR4中引入了A100Q突變，該構(gòu)建體被命名為L(zhǎng)C06。
8.用LC06作為模板，用引物TFLC1s2.1和TFLC3as進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟產(chǎn)生了將被用于步驟10中的片段I。這在FR3中引入了K70D和K74T突變。
9.用LC06作為模板，用引物TFLC3s2和TFLC4as進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該步驟產(chǎn)生了將被用于步驟10中的片段F。這在FR3中引入了A80P突變。
10.用片段I和片段F作為模板，用引物TFLC1s2.1和TFLC4as進(jìn)行PCR，產(chǎn)生了片段J。將片段J克隆進(jìn)pGEM產(chǎn)生了構(gòu)建體LC07。
11.用互補(bǔ)引物TFLC08sds和TFLC08sdsa，用LC07作為模板來進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該步驟在FR3中引入了突變V84A和N85T。該構(gòu)建體被命名為L(zhǎng)C08。
12.將來自LC05的含有突變Q11L、L15V、E17D、S18R和Q37L的AgeI至EcoO109I片段克隆進(jìn)LC08。這產(chǎn)生了構(gòu)建體LC09。
13.用LC09作為模板，用互補(bǔ)引物L(fēng)C105和LC103來進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該步驟在FR3中引入了T85N突變，產(chǎn)生了構(gòu)建體LC10。
14.用LC10作為模板，用互補(bǔ)引物L(fēng)C115和LC113進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該步驟在FR3中引入了D70K突變。這產(chǎn)生了構(gòu)建體LC11。
15.用LC11作為模板，用互補(bǔ)引物L(fēng)C125a和LC123a進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該步驟在FR2中引入了K42Q突變。這產(chǎn)生了構(gòu)建體LC12。
每個(gè)突變步驟之后，對(duì)部分人化或完全人化的LC克隆進(jìn)行測(cè)序，稍后將這些可變結(jié)構(gòu)域中的一些克隆進(jìn)表達(dá)載體tKMC180用于輕鏈人化的寡核苷酸引物TFLC1as25’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG 3’TFLC1s2.15’ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC 3’TFLC5s5’GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG 3’TFLC5as5’CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC 3’TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG 3’TFLC2as15’CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG 3’
TFLC1asR5’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG 3’TFLC2s5’CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC 3’TFLC4as5’GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG 3’TFLC3as5’GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC 3’TFLC3s25’CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC 3’TFLC08sds5’GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG 3’TFLC08sdsa5’CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC 3’LC1055’CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC 3’LC1035’GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG 3’LC1155’CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC 3’LC1135’GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG 3’LC125a5’CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG 3’LC123a5’CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG 3’圖5A顯示了人類kappa輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列(SEQ IDNO.＿＿)。圖5B顯示了人類IgG1重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.＿＿)。圖6A顯示了hFAT(IgG4)恒定結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID NO.＿＿)。圖6B提供了人類IgG4重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO.＿＿)。關(guān)于前述免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列的其它公開資料，還見公布的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)?0030190705和其中引用的參考文獻(xiàn)。
實(shí)施例2 人化抗TF抗體的表達(dá)和純化將部分人化或完全人化的LC和HC克隆克隆進(jìn)表達(dá)載體。質(zhì)粒tKMC18被用于表達(dá)與人類kappa鏈融合的LC突變體，pJRS 35S或pLAM 356載體被用于表達(dá)與人類IgG1或IgG4的Fc融合的HC突變體。然后將HC和LC克隆的一些組合共轉(zhuǎn)染至COS細(xì)胞中。通過ELISA，針對(duì)整個(gè)IgG的生產(chǎn)和與TF的結(jié)合，對(duì)COS細(xì)胞中短暫表達(dá)的IgG進(jìn)行檢測(cè)。關(guān)于與這些特殊載體相關(guān)的公開資料，見公布的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)?0030190705和其中引用的參考文獻(xiàn)。
將抗TF重和輕可變結(jié)構(gòu)域的最后完全人化形式(HC08和LC09的組合)克隆進(jìn)被稱為Mega表達(dá)載體(pSUN34，見圖2)的材料，并轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO和NSO細(xì)胞，用于IgG表達(dá)?？寺〕瞿墚a(chǎn)生IgG4或IgG1κ人化抗TF抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。然后將選出的穩(wěn)定的細(xì)胞系用于生產(chǎn)足以進(jìn)行分析的量的人化抗TF。得到的人化版本是接近于100％人類來源的(不考慮CDR序列的情況下)。人化的IgG4kappa版本(由pSUN35生產(chǎn)的)被命名為hFAT(人化IgG四抗組織因子抗體)，IgG1 kappa版本(由pSUN34生產(chǎn)的)被命名為hOAT(人化IgG一抗組織因子抗體)。cH36的這些完全人化的版本將被用于治療慢性指征，例如癌癥以及炎性疾病。
能表達(dá)(HC08和LC09的組合)的一種NSO細(xì)胞系(OAT-NSO-P10A7)被解凍，并被擴(kuò)展到10mL IMDM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％FBS，處于15mL的管中，然后對(duì)其進(jìn)行離心。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于10mL新鮮的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至T25瓶中，在37℃于5％CO2中培養(yǎng)。為制備足夠數(shù)量的細(xì)胞以接種中空纖維生物反應(yīng)器(hollow fiber bioreactor)，將細(xì)胞擴(kuò)增(expand)，以獲得總共6×108個(gè)細(xì)胞。按照廠商說明書來設(shè)置生物反應(yīng)器。收獲的細(xì)胞被沉淀出來，將其重新懸浮于含有35％FBS的60mL IMDM中，然后注射進(jìn)生物反應(yīng)器的毛細(xì)管外空間。每天都監(jiān)測(cè)葡萄糖和乳酸鹽的濃度，對(duì)收獲的物質(zhì)進(jìn)行離心，并收集起來。用ELISA試驗(yàn)對(duì)收獲的物質(zhì)進(jìn)行針對(duì)抗TF抗體濃度的檢測(cè)。然后對(duì)收集的含有抗TF抗體(hFAT)的樣品進(jìn)行純化，按照下文所述進(jìn)行分析。
A.r蛋白質(zhì)A瓊脂糖(sepharose)高流速色譜重組的人化抗TF單克隆抗體由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。重鏈?zhǔn)切∈罂勺兘Y(jié)構(gòu)域(未改變的，或如上所述人化的)和人類IgG1或IgG4Fc結(jié)構(gòu)域的融合，而輕鏈則含有小鼠可變結(jié)構(gòu)域(未改變的，或如上所述人化的)和人類к結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)良好地得出了如下結(jié)果人類IgGFc區(qū)域具有對(duì)于蛋白質(zhì)A或重組蛋白質(zhì)A(r蛋白質(zhì)A)的高度親和性。
通過向每ml樣品中加入0.08ml pH8.0的1M Tris-HCl，將含有人化抗TF抗體(hFAT)的收集物調(diào)節(jié)為pH 8.0±0.1。然后將樣品過濾通過低蛋白質(zhì)結(jié)合的0.22微米過濾器(例如，Nalgene滅菌一次性組織培養(yǎng)物過濾器單元，其具有來自Nalge Nunc International，Cat.No.167-0020的聚醚砜膜)。應(yīng)用樣品之后，用5床體積(bed volume)的20mM Tris-HCl(pH8.0)來洗r蛋白質(zhì)A柱(來自Pharmacia)，以去除未結(jié)合的物質(zhì)，例如培養(yǎng)基蛋白質(zhì)。鑒于收獲的培養(yǎng)基含有高含量的牛血清，使用分步pH梯度洗滌來從柱中移走牛IgG。通過增加緩沖液A(100mM乙酸鈉)中緩沖液B(100mM乙酸)的相對(duì)百分比，來獲得分步pH梯度。典型的pH分步洗滌中，使用20％、40％和60％的緩沖液B。用100％的緩沖液B對(duì)該柱進(jìn)行洗脫，基于A280收集洗出部分。通過加入1M Tris堿將收集的部分調(diào)節(jié)為pH8.5。
B.Q瓊脂糖高流速色譜陰離子交換色譜對(duì)于根據(jù)其電荷分離蛋白質(zhì)是非常有效的。用兩倍體積的水來稀釋洗脫出并經(jīng)過pH調(diào)節(jié)的來自r蛋白質(zhì)A柱的樣品，檢查pH，并將其調(diào)節(jié)為8.5。然后將樣品載入5mL(1.6×2.5cm)的Q瓊脂糖高流速柱(用20mM Tris-HCl，pH8.5平衡過的)，用(1)5床體積的20mM Tris-HCl，pH8.5；和(2)4床體積的含有100mMNaCl的20mM Tris-HCl，pH8.5來洗柱。然后用若干床體積的含有500mM NaCl的20mM Tris-HCl，pH8.5來洗脫IgG蛋白質(zhì)。收集蛋白質(zhì)峰，用超濾設(shè)備將緩沖液交換成PBS。
實(shí)施例3 恒河猴中的膿毒性休克模型在該模型中，通過在恒河猴中注入活的E.coli(革蘭氏陰性細(xì)菌)(見Taylor et al.，J.Clin.Invest.79918-825(1987))來誘導(dǎo)膿毒性休克。通過E.coli誘導(dǎo)的休克能導(dǎo)致對(duì)凝血和炎癥的激活，最終導(dǎo)致死亡。用前文中Taylor et al.所述的恒河猴膿毒性休克模型，對(duì)本發(fā)明的抗TF抗體延長(zhǎng)經(jīng)過活E.coli處理過的恒河猴的存活時(shí)間的能力進(jìn)行檢測(cè)。在研究前，重3-5千克的恒河猴禁食過夜，實(shí)驗(yàn)的早上用鹽酸氯胺酮(ketamine)(14mg/kg，肌肉注射)將其固定。然后通過經(jīng)由皮膚的導(dǎo)管向頭靜脈施予戊巴比妥鈉，以保持手術(shù)麻醉處于輕微的水平(最初，2mg/kg，大約每20至45分鐘加入額外的量，持續(xù)6小時(shí))。股靜脈無菌條件下暴露，將導(dǎo)管插入到一條后肢中，用于取血樣和施予慶大霉素。通過30分鐘靜脈內(nèi)輸注，施予慶大霉素。在E.coli注入結(jié)束時(shí)(t＝2小時(shí))，施予了9mg/kg的注入量。E.coli注入后6小時(shí)，施予了4.5mg/kg的注入量。第1天之后，每天再施予一次額外的慶大霉素(4.5mg/kg，肌內(nèi))，持續(xù)另外的3天。每只猴子都被置于側(cè)臥位置，接觸溫控加熱襯墊，并且對(duì)直腸溫度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。對(duì)動(dòng)物從口部插入管子，允許它們自發(fā)呼吸。
在注射前少于12小時(shí)，新鮮制備出E.coli菌株086K61H(ATCC33985)。每只猴子獲得2小時(shí)的E.coli靜脈輸注，劑量為4×1010CFU/kg。對(duì)照組猴子在注入E.coli前30分鐘獲得PBS。治療組猴子在注入E.coli前30分鐘(見用于注射安排的時(shí)間表)獲得快速推注(2-3分鐘)劑量的抗組織因子抗體(cH36，如果需要的話，稀釋于PBS中)。經(jīng)由皮膚的導(dǎo)管被用于注入E.coli、PBS和抗TF抗體。
用于施予抗TF抗體和E.coli的時(shí)間表對(duì)所有的猴子進(jìn)行8小時(shí)的連續(xù)監(jiān)測(cè)，在最多7天的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行針對(duì)下述方面的每日觀察存活時(shí)間每小時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄；最初8小時(shí)內(nèi)每小時(shí)檢測(cè)并記錄溫度，然后在最多7天中，每天一次。
在下述時(shí)間點(diǎn)收集血樣如表3所示，T＝-0.5*、0**、1、2、4、6、24小時(shí)，用于對(duì)血液參比和炎性細(xì)胞因子進(jìn)行分析(*T＝-0.5，恰在注射cH36或鹽水對(duì)照之前；**T＝0，恰在注入E.coli之前，但在注入cH36或鹽水對(duì)照之后30分鐘)。
表3.用于收集血樣的安排

本研究的結(jié)果顯示于表4和圖7A-D中。當(dāng)施予10mg/kg靜脈快速推注時(shí)(表4)，抗TF抗體cH76非常好地保護(hù)了恒河猴免受E.coli誘導(dǎo)的膿毒性休克，同時(shí)削弱了炎性細(xì)胞因子IL-8和IL-1β，在較小的程度上削弱了IL-6和TNF-α(圖7A-D)。
Pn 6B型多糖-TT軛合物的免疫原性在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/劑量，分別將如上制備的Pn 6B型多糖-TT軛合物和天然Pn 6B型多糖(對(duì)照)用來免疫每組10只的小鼠。假定參考血清的水平為3200單位/mL，第三次注射后兩周，天然Pn 6B型多糖對(duì)照組所誘導(dǎo)的抗體水平(單位/mL)的幾何平均值為13單位/mL，而所述Pn 6B型多糖-TT軛合物組則為3,700單位/mL(表6)。與所述天然Pn 6B型多糖對(duì)照相比，在小鼠中所述軛合物誘導(dǎo)了285倍的抗-Pn 6B型多糖特異性抗體。
表6

a.用1μg/劑量天然Pn 6B型多糖或所述Pn 6B型多糖-TT軛合物的第三次免疫后兩周小鼠分組(每組10只)的抗-Pn 6B型多糖抗體水平的幾何平均值(與抗-Pn6B型多糖抗體水平為3200單位/mL的參考血清相比)與1SD置信區(qū)間。
方法B-7F型肺炎球菌軛合物對(duì)TT進(jìn)行活化使其含有酰肼基在pH6.5，20-24℃，存在有20mM EDC，0.1M MES的條件下，用0.42M肼活化破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)。反應(yīng)4小時(shí)之后，用1NNaOH中止反應(yīng)，所述反應(yīng)混合物的pH會(huì)升高至7.5-10，。然后使用12-14kDa的分子量透析膜，在4℃，用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進(jìn)行緩沖液更換。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，采用Lowry分析(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁(yè))方法測(cè)定了所得TT-酰肼樣品中的蛋白濃度。以己二酸二酰肼作為標(biāo)準(zhǔn)，采用Vidal，J.Immunol.Wolf，K.et al.Am.J.Respir.Crit.Care Med.1641998(2001)。在該模型中，通過起動(dòng)注入(priming infusion)被殺死的E.coli，來預(yù)先激活高動(dòng)力型(hyperdynamic)心血管和全身炎性應(yīng)答。12小時(shí)后，將第二次活的E.coli劑量給予動(dòng)物，以誘導(dǎo)與具有膿毒病和ARDS的人類似的肺部和腎臟衰竭。用該模型，通過FVIIai和TFP1來阻止TF功能，其顯示出能削弱全身炎性應(yīng)答，降低組織中纖維蛋白的沉著，預(yù)防了肺和腎臟損傷。
在該模型中，對(duì)過夜禁食的成年狒狒(Papio cyanocephalus)給予肌肉內(nèi)注射的氯胺酮(20-25mg/kg)鎮(zhèn)靜劑，并且進(jìn)行插管。用氯胺酮(3-10mg/kg/h)和安定(diazepam)(每?jī)尚r(shí)0.4-0.8mg/kg)來保持深度的鎮(zhèn)靜。在呼吸測(cè)量前，用體積循環(huán)通風(fēng)機(jī)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行機(jī)械通風(fēng)(21％O2)，用巴夫龍(pancuronium)(靜脈內(nèi)給藥4mg)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行間歇麻痹。通過用于血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)的股切開，來放置留置的動(dòng)脈管線和肺部動(dòng)脈導(dǎo)管。所有的動(dòng)物都獲得大約109CFU/kg的經(jīng)過熱殺死的E.coli 086K61H(ATCC 33985)，其作為60分鐘的注入在t＝0h時(shí)，活的E.coli之前12小時(shí)給予。通過60分鐘注入體積為50mL的1010CFU/kg的活的E.coli來誘導(dǎo)膿毒病。在完成活的E.coli的注入后60分鐘，施予慶大霉素(3mg/kg i.v.)和頭孢他定(1gm i.v.)。如果需要的話，用流體來保持肺部毛細(xì)管楔壓(PCWP)為8-12mmHg，并對(duì)血壓進(jìn)行支持。多巴胺被用于血壓過低，此時(shí)平均動(dòng)脈壓(MAP)降至低于65mmHg，盡管使用了流體。48小時(shí)后(活的細(xì)菌注入后36小時(shí))，通過KCl注射對(duì)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉和殺死。每小時(shí)記錄生理參數(shù)，包括心率(HR)、溫度、動(dòng)脈血壓、肺部動(dòng)脈血壓、通風(fēng)機(jī)參數(shù)和流體吸收率。如所報(bào)道的，通過熱稀釋法、中心靜脈壓(CVP)、PCWP、動(dòng)脈和混合靜脈血?dú)怏w、氧飽和、氧含量和血球蛋白，每六小時(shí)獲得對(duì)心臟輸出量(CO)的測(cè)量。每六小時(shí)測(cè)量一次尿?qū)Ч茌敵隽?，?jì)算總的流體平衡為總i.v.流體吸收減去尿輸出量。
用下面列出的關(guān)于肺損傷的生理、組織和生化終點(diǎn)(endpoint)，通過對(duì)藥物處理的動(dòng)物和載體處理的動(dòng)物的應(yīng)答進(jìn)行比較，來評(píng)價(jià)關(guān)于每種干預(yù)的治療效果。
·生理終點(diǎn)是作為肺泡到動(dòng)脈O2區(qū)別(AaDO2)、肺系統(tǒng)順應(yīng)性(CL)、肺動(dòng)脈壓、肺血管阻力(PVR)和組織W/D比率被評(píng)估。二級(jí)終點(diǎn)是流體體積要求、血清HCO3、恒定PaCO2下的VE、尿輸出量、肌酸酐和系統(tǒng)DO2、VO2和VCO2。
·被分析的病理終點(diǎn)是總體組織外觀(gross tissue appearance)和定性光顯微分析，包括纖維蛋白沉著，于肺、腎、腎上腺和其它組織中。
·生化終點(diǎn)是組織髓過氧化物酶(MPO)水平、總的組織蛋白質(zhì)和灌洗(lavage)蛋白質(zhì)以及灌洗LDH。通過濕/干重來測(cè)量肺和小腸水腫。
在0、12、13、18、24、36和48小時(shí)處取血樣。血漿(來自檸檬酸化的血)和血清分離，貯藏于-80℃。用ELISA試劑盒(R and DSystem，In.，Minneapolis，MN)，針對(duì)白細(xì)胞介素(IL)6和IL 8來分析血漿樣品。
實(shí)驗(yàn)方案如表5所概括。
表5.實(shí)驗(yàn)方案

用針對(duì)cH36 Fab的3.5mg/kg的總抗體劑量和針對(duì)cH36的5.25mg/kg的總抗體劑量來進(jìn)行TF阻斷。注入活的微生物后兩小時(shí)，開始測(cè)試項(xiàng)目的靜脈內(nèi)載入劑量(對(duì)于cH36 Fab，1.8mg/kg，對(duì)于cH36，2.7mg/kg)，此時(shí)施予抗生素，接著是34小時(shí)的勻速注入每小時(shí)50的NEOSEPTA CMB)，將槽分成兩個(gè)區(qū)陰極區(qū)和陽(yáng)極區(qū)。
在陰極區(qū)中，加入100g難溶性鉛污染土壤(鉛濃度為5000mg/kg干土；取樣地點(diǎn)D汽車工廠)、800mL的自來水、50mL的1∶1的鹽酸，使用特氟龍(注冊(cè)商標(biāo))制成的攪拌葉片以500rpm的速度進(jìn)行攪拌，得到被驗(yàn)系統(tǒng)。
將銅制金屬網(wǎng)的陰極電極插入被驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)，通過恒電位裝置(恒壓電源裝置)與陽(yáng)極連接。在陰極的附近，通過尼龍制成的篩子(孔大小為1.0mm)構(gòu)成的保護(hù)材料形成間隔壁，使得陰極表面不會(huì)受到淤漿中大粒徑的固體的剪切力的作用。
在陽(yáng)極區(qū)內(nèi)，添加800mL的自來水、5mL的1∶1的鹽酸，插入石墨制陽(yáng)極電極。
將參比電極插入陰極區(qū)內(nèi)，調(diào)節(jié)恒電位裝置使得陰極電極電位相對(duì)于氫標(biāo)準(zhǔn)電極達(dá)到-0.25V。在陰極電極電位達(dá)到-0.25V之后運(yùn)行20分鐘，然后使用GF/B濾紙吸濾槽內(nèi)的淤漿，進(jìn)行固液分離。在反應(yīng)期間，陰極區(qū)的淤漿的pH保持在1.0V或以下。吸濾后，使用原子吸光法分別測(cè)定濾液中的鉛濃度和過濾后的土壤中的鉛的含有濃度。針對(duì)除了不使用陰極包含部件之外使用與被驗(yàn)系統(tǒng)相同實(shí)驗(yàn)裝置的對(duì)照系統(tǒng)，同樣地進(jìn)行吸濾、固液分離，測(cè)定濾液中的鉛濃度和過濾后的土壤中的鉛濃度。結(jié)果如表6所示。
表6鉛污染土壤的電解析出試驗(yàn)結(jié)果

(*分配到電極上的鉛重量分配比是通過與添加的土壤中殘留的鉛重量的差計(jì)算得到的。)從表6可知，通過抑制淤漿施加給陰極的剪切力，分配到電極上的鉛濃度增加了。因此，通過本發(fā)明，可以確認(rèn)，能夠防止在陰極表面上<p>表1

縮寫B(tài)B刷狀緣，BC鮑曼氏囊，MICs免疫復(fù)合體M，SPHN緩慢進(jìn)行性海曼氏腎炎TBM腎小球基底膜，Tx治療的；w/用；*這些結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)有染色的鼠腎的數(shù)量；+腎小球損傷等級(jí)在2級(jí)以下的鼠腎的數(shù)量(在括號(hào)中)。
根據(jù)合適的指導(dǎo)來對(duì)動(dòng)物進(jìn)行操作。動(dòng)物被隨機(jī)分為治療和膿毒病對(duì)照組。過夜禁食后，對(duì)每只動(dòng)物都通過肌肉內(nèi)給予氯胺酮(20-25mg/kg)進(jìn)行鎮(zhèn)靜，并插管。用氯胺酮(3-10mg/kg/h)和安定(每2小時(shí)0.4-0.8mg/kg)來保持高度鎮(zhèn)靜。在呼吸測(cè)量之前，用體積循環(huán)通風(fēng)機(jī)來對(duì)動(dòng)物進(jìn)行通風(fēng)，用巴夫龍(4mg靜脈給藥)進(jìn)行間歇麻痹。FiO2是0.21，潮氣量(tidal volume)為12ml/kg，呼氣末正壓為2.5cmH2O，速率被調(diào)節(jié)為能保持40mmHg的動(dòng)脈PCO2。通過用于血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)的股切開，來放置留置的動(dòng)脈管線和肺動(dòng)脈導(dǎo)管?；畹腅.coli注入開始后兩小時(shí)(14小時(shí))，動(dòng)物獲得硫酸慶大霉素(3mg/kg iv)和頭孢他定(1gm iv)。以足以將肺部毛細(xì)管楔壓(PCWP)保持在8至12mmHg的速率，用靜脈內(nèi)體積注入(intravenous volumeinfusion)(Ringer’s乳酸鹽)來支持動(dòng)物。如果需要的話，用多巴胺將平均動(dòng)脈壓保持為60mmmHg。48小時(shí)后(活細(xì)菌注入后36小時(shí))，用KCl注射對(duì)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉，并將其殺死。預(yù)先確定的提前終止標(biāo)準(zhǔn)包括難控制的低血壓(盡管使用了多巴胺和足夠的PCWP，MAP仍小于60mmHg)、血氧不足(需要FIO2高于40％)或難控制的代謝酸中毒(pH＜7.10，PaCo2正常)。實(shí)驗(yàn)方案與上文中表5所示的相同。
每小時(shí)記錄生理參數(shù)，包括心率(HR)、溫度、動(dòng)脈血壓、肺動(dòng)脈壓、通風(fēng)機(jī)參數(shù)和流體吸收。通過熱稀釋法、中心靜脈壓(CVP)、PCWP、動(dòng)脈和混合靜脈血?dú)怏w、氧飽和、氧含量和血球蛋白(Hgb)，每六小時(shí)獲得對(duì)心臟輸出量(CO)的測(cè)量。每六小時(shí)測(cè)量一次尿?qū)Ч茌敵隽?，?jì)算總的流體平衡為總i.v.流體吸收減去尿輸出量。
在0、12、13、18、24、36和48小時(shí)處取血樣。在全血上來進(jìn)行全血球計(jì)數(shù)(Sysmex-1000 Hemocytometer；Sysmex，In.，LongGrove，IL)。血漿(來自檸檬酸化的血液)和血清被分離，并被貯藏于-80℃。用ST4機(jī)械凝血分析儀(Diagnostica Stago，Parsippany，NJ)來測(cè)量纖維蛋白原。對(duì)前凝血酶時(shí)間(PT)和激活的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)重復(fù)測(cè)量?jī)纱?，用顯色試驗(yàn)，在MDA凝血分析儀(Organon Teknika，Durham，NC)上來測(cè)量抗凝血酶III(ATIII)活性，其被表示為試劑盒標(biāo)準(zhǔn)的％。ELISA被用于測(cè)量血漿和BAL中的血漿凝血酶-抗凝血酶(TAT)復(fù)合體(Dade Behring，Deerfield，IL)。通過Sunol Molecular(Miramar，F(xiàn)L)來測(cè)量血液和BAL中的cH36和cH36-Fab水平。用ELISA試劑盒(R and Dsystems，Inc.，Minneapolis，MN)，針對(duì)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和TNF受體-1(TNFR-1)來對(duì)血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來測(cè)量血中的肌酸酐。
在驗(yàn)尸過程中按照下文所述來收集組織實(shí)驗(yàn)后，打開胸腔，左邊的主支氣管被結(jié)扎，左肺被移開。用240mL 0.9％鹽水在左上肺葉進(jìn)行BAL。來自左下肺葉的肺組織樣品被人工充氣，并浸入4％多聚甲醛中，用于光顯微。從左肺殘留部分中隨機(jī)取四份樣品，用于濕/干重測(cè)定，要小心處理以避開大血管和支氣管結(jié)構(gòu)。來自肺、腎、肝、小腸、心臟和腎上腺的其它樣品被急速冷凍于液氮中，貯藏于-80℃。在30cm的固定壓力下，用0.85M二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.4)中的2％戊二醛對(duì)整個(gè)的右肺進(jìn)行15分鐘的充氣固定(inflation-fix)。通過浸入4％的多聚甲醛，對(duì)來自腎、肝、小腸、心臟和腎上腺的其它組織進(jìn)行固定。隨機(jī)選擇四份小腸樣品，用于濕/干重測(cè)定。
按照(Am J Resp Crit Care Med 1998；157938)所述，來測(cè)量肺組織勻漿(homogenate)中髓過氧化物酶(MPO)活性和蛋白質(zhì)濃度，以及BAL中的乳酸鹽脫氫酶(LDH)濃度。MPO活性被表示為吸光率/分鐘/g濕重組織的變化。LDH值被表示為每升中的活性單位(U/L)。
下述實(shí)施例的重要目的是測(cè)定cH36和cH36-Fab對(duì)肺中前凝血-纖維蛋白溶解平衡以及炎癥的影響。還有一個(gè)目的是將這些參數(shù)與狒狒中實(shí)驗(yàn)性膿毒病模型中的ALI的結(jié)構(gòu)和氣體交換異常關(guān)聯(lián)起來。
D.結(jié)果用cH36進(jìn)行治療能預(yù)防具有E.coli膿毒病的狒狒中纖維蛋白原的耗竭簡(jiǎn)言之，cH36治療削弱了纖維蛋白原的耗竭，以及TAT復(fù)合體的形成，這與依賴TF的凝血激活的抑制一致。在膿毒病對(duì)照中，纖維蛋白原降低至最初值的大約50％，但是在用cH36治療過的動(dòng)物中，平均纖維蛋白原水平并未降低到基線值以下(圖10A，對(duì)比膿毒病對(duì)照，p＜0.01)。在膿毒病期間，膿毒病對(duì)照中PT增加，這是由于發(fā)展的凝血病導(dǎo)致的，在治療過的動(dòng)物中PT也增加，這是由于藥物注入的藥理影響。三種經(jīng)過cH36-Fab治療的動(dòng)物中的PT和纖維蛋白原的值也被顯示出來，用于比較。cH36-Fab中的值較之整個(gè)抗體治療的動(dòng)物有所降低，這表明，F(xiàn)ab片段具有較低的對(duì)于TF的親和性(圖10A、B)。兩組中PTT都增加，并且沒有顯著差異。兩組中注入活細(xì)菌后，TAT復(fù)合體都增加，在14小時(shí)處形成峰，然后降低。在用cH36治療過的動(dòng)物中，TAT峰值更低，水平降低得更快(圖10D，p＜0.01)。TAT復(fù)合體形成的差異不是由于ATIII水平的差異導(dǎo)致的，因?yàn)閮山M中ATIII的降低相似，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均為初始值的35-40％。
E.用Sunol-cH36治療削弱了膿毒病誘導(dǎo)的急性肺損傷cH36減少了具有建立起的E.coli膿毒病的狒狒中的ALI，削弱了膿毒病誘導(dǎo)的氣體交換異常、肺部高血壓以及肺部系統(tǒng)順應(yīng)性的損失。這些生理數(shù)據(jù)顯示于圖8A-C中。注入殺死的細(xì)菌后，兩組中肺泡動(dòng)脈氧梯度(AaDO2，mmHg)都增加，t＝12小時(shí)時(shí)，活的細(xì)菌膿毒病發(fā)作之后，膿毒病對(duì)照組中進(jìn)一步惡化。較之膿毒病對(duì)照動(dòng)物，用cH36的治療能預(yù)防膿毒病期間氣體交換方面的逐步惡化(p＝0.001，圖8A)。膿毒病對(duì)照組的一只動(dòng)物在活細(xì)菌膿毒病發(fā)作之后需要補(bǔ)充的氧以用于逐漸發(fā)展的血氧不足。cH36治療組的一只動(dòng)物也需要氧，但僅為18-22小時(shí)，在此期間充氧作用逐漸改善，補(bǔ)充的氧氣被斷掉，回到室內(nèi)空氣。在實(shí)驗(yàn)的末尾，該動(dòng)物中AaDO2回復(fù)到在注入熱殺死或活的細(xì)菌之前測(cè)量的初始值。膿毒病誘導(dǎo)的平均肺動(dòng)脈壓(PAM，mmHg)增加被cH36減輕(對(duì)比未受治療的膿毒病對(duì)照，p＜0.0001，圖8B)，但是肺部血管阻力沒有差別，這表明，這是由于治療過的動(dòng)物中對(duì)心臟輸出量的影響造成的。cH36還能預(yù)防膿毒病對(duì)照動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的肺部系統(tǒng)順應(yīng)性(Cst，以mL/cm H2O表示)降低(p＜0.01，圖8C)。PaCO2被控制于正常范圍內(nèi)，兩組中都是35-45mmHg之間，但是，在膿毒病對(duì)照中稍微高一點(diǎn)(p＝0.03)，盡管分鐘通氣率高20％(VE，l/分鐘，p＝0.015)，這表明，cH36削弱了膿毒病誘導(dǎo)的無效腔(dead space)的增加(表7)。
在尸體解剖之后，來自膿毒病對(duì)照動(dòng)物的肺是稠密且出血的。來自用cH36治療過的動(dòng)物的肺的整體外觀有所改善，在一些動(dòng)物中，與正常的未受損傷的狒狒的肺看起來相同。兩組中肺的濕/干重沒有顯著區(qū)別，膿毒病對(duì)照中為6.32±0.66，在用cH36治療過的動(dòng)物中為5.57±0.34(p＝NS，正常參考范圍為4.6-5.0)。兩組間BAL蛋白質(zhì)和LDH也沒有顯著區(qū)別。在膿毒病對(duì)照組中BAL蛋白質(zhì)為1.0±0.3，cH36治療過的動(dòng)物中為1.0±0.4，膿毒病對(duì)照中LDH為23.9±10.6，而cH36治療過的動(dòng)物中為10.6±3。如髓過氧化物酶(MPO)活性(OD/分鐘/gm濕重)測(cè)量出的嗜中性粒細(xì)胞的積累，在cH36治療過的動(dòng)物中降低了超過40％(p＝0.07)。
肺部組織學(xué)研究顯示了用cH36治療過的膿毒病動(dòng)物中的保護(hù)作用。膿毒病對(duì)照動(dòng)物的肺具有加厚的肺泡隔膜、斑駁狀的肺泡水腫和出血以及巨噬細(xì)胞和PMN對(duì)肺泡內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(infiltration)。經(jīng)過治療的動(dòng)物的肺具有改進(jìn)的肺泡隔膜體系結(jié)構(gòu)，降低的肺泡PMN浸潤(rùn)，較少的肺泡水腫，并且沒有肺泡出血。
實(shí)施例5 膿毒病中用cH36的治療能改善腎臟功能以及減少器官損傷用于進(jìn)行本實(shí)施例的材料和方法在前文中已有描述。見，例如，實(shí)施例4。
用cH36進(jìn)行治療能改善膿毒病中腎臟的功能。較之未受治療的對(duì)照，用cH36治療的動(dòng)物中，注入活E.coli后，尿輸出量明顯更高(p＜0.001)。這并非由于復(fù)蘇(resuscitation)的差異導(dǎo)致的，因?yàn)閮山M間流體平衡和全身性血液動(dòng)力學(xué)相似。未受治療的動(dòng)物中，血液pH和血清[HCO3-]都更低(兩種情況下，p＜0.0001)，值與膿毒病對(duì)照中混合代謝和呼吸酸中毒相符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組中血清肌酸酐沒有不同，在治療組中由于有一只未受保護(hù)的動(dòng)物而有所變化。
見圖13A-C(顯示了對(duì)照和cH36抗體情況下，平均的尿輸出量(13A)，平均的血液pH(13B)以及血清碳酸氫鹽水平(13C))。
尸體解剖后發(fā)現(xiàn)，來自未受治療的動(dòng)物的腎臟腫脹且出血，而cH36治療過的動(dòng)物中則看起來更為正常。未受治療的動(dòng)物的腎臟的H&amp;E染色部分局有斑駁狀到廣泛區(qū)域的急性腎小管壞死(ATN)和腎小球損傷。受到治療的動(dòng)物的腎臟，除了一些小塊的ATN之外，顯示出正常的腎臟體系結(jié)構(gòu)。受到治療的動(dòng)物腎臟中MPO值顯著減小(p＝0.01)。
經(jīng)過cH36治療的動(dòng)物中，其它器官損傷也有所改善。來自未受治療的動(dòng)物的腎上腺腫脹并出血，小腸非常水腫。相反，用cH36治療過的動(dòng)物中，腎上腺和小腸看起來都接近正常。在用cH36治療過的膿毒病動(dòng)物中，小腸濕/干重有所降低(Sunol-cH36治療的，6.46±0.62，對(duì)比未受治療的膿毒病對(duì)照動(dòng)物，9.70±1.05，p＝0.01)。組織學(xué)研究驗(yàn)證了小腸水腫的改善。腎上腺也被針對(duì)膿毒病而受到了保護(hù)，充血和出血被減少，細(xì)胞損傷的面積顯著變小。除肺和腎臟中降低的嗜中性粒細(xì)胞含量之外，cH36治療還能顯著地降低肝臟中的PMN含量(p＝0.05)，組織學(xué)研究顯示了肝細(xì)胞的損傷降低。
實(shí)施例6 cH36治療削弱了膿毒病誘導(dǎo)的貧血用于進(jìn)行本實(shí)施例的材料和方法已在上文中被描述。見，例如，實(shí)施例4。
在注入活的E.coli后，兩組動(dòng)物都發(fā)展出了嗜中性粒細(xì)胞減少、血小板減少以及貧血(見下表8)。兩個(gè)組中血紅蛋白(Hgb)都有所降低，但是在用cH36治療過的膿毒病動(dòng)物中顯著更高(48小時(shí)處，8.1±0.7對(duì)比10.8±0.8g/dL，p＜0.0001)。雖然在未受治療的動(dòng)物中血小板下降得更為迅速(p＜0.0001)，但是該區(qū)別的臨床顯著性并不明顯。注入活的E.coli后，所有動(dòng)物都發(fā)展出了進(jìn)行性血小板減少，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩個(gè)組中的平均血小板計(jì)數(shù)都為大約30,000或更少。注入后兩小時(shí)(t＝14小時(shí))時(shí)，兩個(gè)組中WBC都達(dá)到最低點(diǎn)，大約為1,000-1,500(×103/μL)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，其逐漸增加至基線水平(經(jīng)過治療的為12,680±2,012，與未經(jīng)治療的動(dòng)物對(duì)比，其為10,500±1,336，p＝0.07)。兩只膿毒病對(duì)照動(dòng)物發(fā)展出了自限性(self-limited)血尿。兩個(gè)組中的大多數(shù)動(dòng)物在研究中的某些時(shí)間點(diǎn)具有伴隨吸出的帶血分泌物，但在cH36治療的動(dòng)物中沒有顯著出血的臨床證據(jù)(即，血尿、咯血或從靜脈或動(dòng)脈導(dǎo)管位置流血)，兩個(gè)組中都沒有發(fā)生嚴(yán)重的或危及生命的出血并發(fā)癥。
表8

進(jìn)行臨床和組織學(xué)評(píng)估，對(duì)抗組織因子注射能抑制這些小鼠中的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進(jìn)行了驗(yàn)證。
參考前述實(shí)施例和討論，我們發(fā)現(xiàn)，用cH36治療的動(dòng)物具有較少的對(duì)膿毒病的高動(dòng)力型全身應(yīng)答。大多數(shù)的全身性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量，包括平均動(dòng)脈壓(MAP)、PCWP、全身性血管阻力*kg(SVR*kg)、VO2和DO2，都沒有被cH36的治療所改變(表8)。兩個(gè)組中，低血壓應(yīng)答于IV流體和多巴胺注入。直到預(yù)定的方案終止點(diǎn)，12只動(dòng)物中的9只還存活?？傮w上，活細(xì)菌膿毒病發(fā)作之后，用cH36治療過的膿毒病動(dòng)物具有更少的高動(dòng)力型，沒有進(jìn)一步的心臟輸出量(CO/kg)增加，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，具有更少的心動(dòng)過速和更高的全身血管阻力*kg(SVR*kg)(例如，表7)。在一些情況下，經(jīng)過治療的動(dòng)物和未受治療的對(duì)照一樣需要多巴胺和流體支持，兩組之間并沒有可探測(cè)到的關(guān)于MAP和SVR的區(qū)別。存活并沒有被打算用作為終點(diǎn)，因?yàn)樵?8小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)所有動(dòng)物都犧牲了。用cH36-Fab來治療三只膿毒病動(dòng)物，以對(duì)整個(gè)抗體和Fab片段之間的區(qū)別作出評(píng)價(jià)。如所預(yù)期的一樣，整個(gè)抗體通常比Fab片段更為有效。
實(shí)施例7 cH36對(duì)前炎性細(xì)胞因子水平的影響按照上文(例如實(shí)施例5)已描述過的順序，對(duì)血清和BAL流體中的細(xì)胞因子水平進(jìn)行測(cè)量。在循環(huán)中，cH36治療削弱了IL-8(p＜0.01，圖12)，但對(duì)IL-1β或TNFR-1沒有可探測(cè)到的影響。在BAL流體中，cH36削弱了IL-6、IL-8和TNFR-1的升高。BAL細(xì)胞因子水平展示于下表9中。我們還對(duì)可溶的凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(sTM)進(jìn)行了測(cè)量，在經(jīng)過治療的和沒有經(jīng)過治療的動(dòng)物中，血清或BAL中都沒有發(fā)現(xiàn)不同。數(shù)據(jù)顯示，用Sunol-cH36去阻斷TF-FVIIa復(fù)合體上的FX結(jié)合位點(diǎn)來抑制凝血，能夠至少部分地通過對(duì)肺泡間隔中前炎性細(xì)胞因子水平的影響來削弱急性肺損傷。這可能是對(duì)于局部細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或蛋白質(zhì)穿過肺泡上皮從循環(huán)中漏出的影響。
表9.BAL細(xì)胞因子水平

從實(shí)施例4-7中獲得的某些結(jié)果可按照下文來概括大多數(shù)的全身性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量，包括平均動(dòng)脈壓(MAP)、氧消耗(VO2/kg)和氧遞送(DO2/kg)，都沒有被cH36的治療所改變(表8)。平均肺部毛細(xì)管楔壓(PCWP)在膿毒病對(duì)照動(dòng)物中稍高(p＜0.01)，但兩個(gè)組都在研究的預(yù)設(shè)參數(shù)范圍內(nèi)。全身性血管阻力*kg(SVR*kg)在經(jīng)過治療的動(dòng)物中稍高(p＜0.05，表3)。兩個(gè)組中低血壓應(yīng)答于IV流體和多巴胺注入。在方案的預(yù)定終止點(diǎn)，12只動(dòng)物中的九只存活。在預(yù)定終止之前兩只膿毒病對(duì)照動(dòng)物因?yàn)榫哂须y控制的血氧不足和呼吸酸中毒因ALI而死亡，一只在30小時(shí)處死亡，一只在38小時(shí)處。H36組中的一只動(dòng)物未受到保護(hù)，由于難控制的低血壓和代謝酸中毒，死于36小時(shí)處。在該動(dòng)物中，缺乏保護(hù)與較低的藥物水平相關(guān)?？傮w上，在活的細(xì)菌膿毒病發(fā)作之后，用cH36治療過的膿毒病動(dòng)物具有更少的高動(dòng)力性，心臟輸出量(CO/kg)沒有進(jìn)一步的增加，并且，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，其具有更少的心動(dòng)過速和更高的每kg全身性血管阻力(SVR*kg)(表7)。
實(shí)施例8用cH36-Fab(Fab片段)對(duì)狒狒進(jìn)行的治療用cH36-Fab對(duì)三只膿毒病動(dòng)物進(jìn)行治療，以尋找使用整個(gè)抗體和Fab片段之間的任何區(qū)別。治療方案通常遵循上文已討論過的程序。雖然該組太小，無法進(jìn)行詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)研究，但是數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ab片段對(duì)于削弱膿毒病誘導(dǎo)的凝血激活是有用的，增加的TAT值和纖維蛋白原的損耗類似于膿毒病對(duì)照。但是，這種作用較之用整個(gè)抗體所獲得的結(jié)果是較為不顯著的。相應(yīng)地，較之用整個(gè)cH36抗體治療過的動(dòng)物，其中氣體交換(AaDO2)、肺部高血壓(PAM)和肺部順應(yīng)性(Cst)的改善一致性更低。生化方面，肺部MPO值與膿毒病對(duì)照相似。不欲被理論束縛的情況下，cH36及其Fab片段之間的作用差別可能是由于在動(dòng)物模型中Fab片段對(duì)于TF的更低的親和性造成的。
實(shí)施例9 在表達(dá)人類組織因子的轉(zhuǎn)基因小鼠中，對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抗組織因子抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是已建立起來的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，這是用II型膠原進(jìn)行免疫之后在小鼠的易感株系中誘導(dǎo)出來的。除風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理方面的免疫介導(dǎo)的機(jī)制之外，組織因子起始的對(duì)凝血級(jí)聯(lián)的激活也已被暗示與該疾病的病程相關(guān)。在由于凝血激活而受到影響的關(guān)節(jié)中的纖維蛋白沉著，被相信能促進(jìn)滑膜加厚和關(guān)節(jié)炎癥。為確定用抗組織因子抗體的治療是否能預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的防站，將用cH36對(duì)小鼠進(jìn)行注射。
為誘導(dǎo)CIA，用在完全福氏佐劑中乳化的100μg的II型膠原對(duì)7-12周齡的小鼠尾巴基部進(jìn)行皮內(nèi)注射，在第21天時(shí)，再用在不完全福氏佐劑中乳化的100μg的II型膠原給予強(qiáng)化注射。恰在強(qiáng)化注射之前，通過IV注射給予小鼠0.3mg抗組織因子抗體(對(duì)照組被注射PBS)。隨后，在研究期間每周給予抗組織因子抗體注射(0.3mg)(對(duì)照組被注射PBS)。
針對(duì)四肢的紅色和腫脹對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估，每周給三次臨床分?jǐn)?shù)。按照如下所述對(duì)臨床嚴(yán)重性評(píng)分每個(gè)腫脹的足趾(除了拇指)1分(最多4分)，跗骨或腕骨關(guān)節(jié)1分，以及跖骨或掌骨關(guān)節(jié)1分，后爪最多6分，前爪最多5分。每個(gè)爪單獨(dú)評(píng)分，每只小鼠的累積臨床關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)可以達(dá)到最多22分。
本臨時(shí)申請(qǐng)具有與公布的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)?0030190705相關(guān)的信息，后者與2001年11月21日提交的U.S.Application No.09/990,586相關(guān)，所述申請(qǐng)要求于2001年10月29日提交的U.S.ProvisionalApplication USSN 60/343,306為優(yōu)先權(quán)。U.S Application No.09/990,586與U.S.Application No.09/293,854(現(xiàn)在的U.S.Pat.No.6,555,319)相關(guān)，后者是U.S.Application No.08/814,806(現(xiàn)在的U.S.Pat.No.5,986,065)的分案，U.S.Application No.10/230,880要求U.S.Application No.09/990,586為優(yōu)先權(quán)。U.S.Application Nos.10/230,880、09/990,586、60/343,306和U.S.Pat.Nos.5,986,065和6,555,319的公開文本通過引用每一個(gè)都被包括進(jìn)本文。還通過引用包括的是公布的U.S.專利申請(qǐng)?zhí)?0030190705。
本臨時(shí)申請(qǐng)還涉及于2003年6月19日提交的U.S.臨時(shí)申請(qǐng)序列No.60/480,254，其公開文本通過引用的方式被包括進(jìn)本文。
已參照優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述。但是，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在考慮到本文公開內(nèi)容的情況下，可以在本發(fā)明的范疇和原則之內(nèi)進(jìn)行改良和改進(jìn)。本文中公開的所有參考文獻(xiàn)都以引用的方式被包括進(jìn)來。
本頁(yè)其余部分有意留作空白。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人(ii)發(fā)明名稱(iii)序列數(shù)量26(iv)聯(lián)系地址(A)收件人(B)街道(C)城市(D)州(E)國(guó)家(F)郵編(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型磁盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容型(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Fast SEQ版版本1.5(vi)目前的申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(viii)律師/代理人信息(A)姓名(B)注冊(cè)號(hào)(C)參考/案卷號(hào)(ix)電子通訊信息(A)電話(B)電傳(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度321個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型cDNA(iii)假定的無(iv)反義無
(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO1GACATTCAGA TGACCCAGTC TCCTGCCTCC CAGTCTGCAT CTCTGGGAGA AAGTGTCACC60ATCACATGCC TGGCAAGTCA GACCATTGAT ACATGGTTAG CATGGTATCA GCAGAAACCA120GGGAAATCTC CTCAGCTCCT GATTTATGCT GCCACCAACT TGGCAGATGG GGTCCCATCA180AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGCACAAAA TTTTCTTTCA AGATCAGCAG CCTACAGGCT240GAAGATTTTG TAAATTATTA CTGTCAACAA GTTTACAGTT CTCCATTCAC GTTCGGTGCT300GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A321(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO2Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度351個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA
(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGATCCAGC TGCAGCAGTC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC AGTGCAGGTA60TCCTGCAAGA CTTCTGGTTA CTCATTCACT GACTACAACG TGTACTGGGT GAGGCAGAGC120CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGATAT ATTGATCCTT ACAATGGTAT TACTATCTAC180GACCAGAACT TCAAGGGCAA GGCCACATTG ACTGTTGACA AGTCTTCCAC CACAGCCTTC240ATGCATCTCA ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTTT ATTTCTGTGC AAGAGATGTG300ACTACGGCCC TTGACTTCTG GGGCCAAGGC ACCACTCTCA CAGTCTCCTC A351(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度117個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Thr Xaa Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr20 25 30Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Leu Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO5Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp1 5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO7Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度6個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO8Thr Asp Tyr Asn Val Tyr1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO9Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型肽(iii)假定的無(1v)反義無(v)片段類型N-末端(v1)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe1 5(2)SEQ ID NO11的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO11CTGGCAAGTC AGACCATTGA T21(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTGCCACCA ACTTGGCAGA T21(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO13CAACAAGTTT ACAGTTCTCC ATTCACGT28
(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO14ACTGACTACA ACGTGTAC18(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO15TATATTGATC CTTACAATGG TATTACTATC TACGACCAGA ACTTCAAGGG C51(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型cDNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO16GATGTGACTA CGGCCCTTGA CTTC24(2)SEQ ID NO17的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO17GCACCTCCAG ATGTTAACTG CTC23(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO18GAARTAVCCC TTGACCAGGC20(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO19GGAGGCGGCG GTTCTGACAT TGTGMTGWCM CARTC35(2)SEQ ID NO20的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO20ATTTCAGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGARGT YCARCTKCAR CARYC45(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO21CCCGGGCCAC CATGKCCCCW RCTCAGYTYC TKG33(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO22CCCGGGCCAC CATGGRATGS AGCTGKGTMA TSCTC35
(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度52個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO23ATATACTCGC GACAGCTACA GGTGTCCACT CCGAGATCCA GCTGCAGCAG TC52(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO24GACCTGAATT CTAAGGAGAC TGTGAGAGTG G31(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO25TTAATTGATA TCCAGATGAC CCAGTCTCC29
(2)SEQ ID NO26的信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)湫途€型(ii)分子類型DNA(iii)假定的無(iv)反義無(v)片段類型(vi)原始來源(xi)序列描述SEQ ID NO26TAATCGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTCA GCTCCAGCTT GGTCC4權(quán)利要求
1.用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療膿毒病或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合受到抑制，所述施予足以在所述哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療所述膿毒病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述人化抗體、嵌合抗體或所述片段展示出以下中的至少一種1)關(guān)于TF的離解常數(shù)小于大約0.5nM；或2)關(guān)于TF的親合常數(shù)(Ka)小于大約10×1010M-1。
3.如權(quán)利要求1-2所述的方法，其中，所述人化抗體、嵌合抗體或其片段具有如下進(jìn)一步的特征具有與從細(xì)胞系H36.D2.B7獲得的抗體大約相等或更高的對(duì)于TF的結(jié)合特異性，所述從細(xì)胞系H36.D2.B7獲得的抗體以ATCC編號(hào)HB-12255被保藏。
4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中，所述人化抗體、嵌合抗體或其片段具有如下進(jìn)一步的特征TF-因子VIIa復(fù)合體對(duì)因子X或因子IX的激活被阻斷。
5.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其中，向哺乳動(dòng)物施予所述人化抗體、嵌合抗體或片段將存活時(shí)間增加至少大約2倍，這是通過標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)膿毒性休克試驗(yàn)來確定的。
6.如權(quán)利要求1-5所述的方法，其中，向哺乳動(dòng)物施予所述人化抗體、嵌合抗體或片段，在至少大約5小時(shí)后，使所述哺乳動(dòng)物中炎性細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-1beta(IL-1β)、腫瘤壞死因子-alpha(TNFα)或腫瘤壞死因子受體(TNFR))中至少一種的水平被削弱。
7.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，施予所述人化抗體、嵌合抗體或片段后大約5分鐘，所述哺乳動(dòng)物展示出大約30至大約350秒之間的血液凝固時(shí)間，這是用標(biāo)準(zhǔn)的前凝血酶時(shí)間試驗(yàn)確定的。
8.如權(quán)利要求1-7所述的方法，其中，所述被施予的人化抗體、嵌合抗體或片段的量足以將血小板沉著抑制至少大約50％，這是用標(biāo)準(zhǔn)的血小板沉著試驗(yàn)確定的。
9.如權(quán)利要求1-8所述的方法，其中，所述人化抗體具有IgG1或IgG4同種型。
10.如權(quán)利要求1-9所述的方法，其中，所述人TF結(jié)合片段是Fab、Fab’或F(ab)2。
11.如權(quán)利要求1-10所述的方法，其中，所述人化抗體是單克隆抗體。
12.如權(quán)利要求1-10所述的方法，其中，所述人化抗體或其片段是單鏈的。
13.如權(quán)利要求1-28所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述靈長(zhǎng)類是人類患者。
15.如權(quán)利要求1-14所述的方法，其中，所述膿毒病與彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、纖維蛋白沉著、血栓形成和肺損傷中的至少一種相關(guān)。
16.如權(quán)利要求1-14所述的方法，其中，所述炎性疾病與關(guān)節(jié)炎，優(yōu)選地，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腎小球性腎炎，多發(fā)性硬化癥，牛皮癬，Sjogren’s綜合征和炎性腸病中的至少一種相關(guān)。
17.如權(quán)利要求1-28所述的方法，其中，向所述哺乳動(dòng)物施予的所述人化抗體、嵌合抗體或片段的量在大約0.01至大約25(mg/kg)之間。
18.一種用于進(jìn)行如權(quán)利要求1-16所述的方法的試劑盒，其中，所述試劑盒包括至少一種與人TF特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合被抑制。
19.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中，所述人化抗體、嵌合抗體或其片段被提供于藥學(xué)上可接受的載體中。
20.如權(quán)利要求17-18所述的試劑盒，其中，所述人化抗體、嵌合抗體或其片段是凍干的，所述試劑盒還包括藥學(xué)上可接受的載體，用于溶解所述人化抗體、嵌合抗體或片段。
21.一種用于在哺乳動(dòng)物中減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與TF特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合被抑制，所述施予足以減少所述哺乳動(dòng)物中所述炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述炎性細(xì)胞因子是炎性細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-1beta(IL-1β)、腫瘤壞死因子-alpha(TNFα)或腫瘤壞死因子受體(TNFR))中的至少一種。
23.如權(quán)利要求21-22所述的方法，其中，所述施予的抗體、嵌合抗體或其片段是權(quán)利要求2-12中任意一項(xiàng)所包含的。
22.用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療膿毒病相關(guān)征狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合受到抑制，所述施予足以在所述哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療所述征狀。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述與膿毒病相關(guān)的征狀是彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、纖維蛋白沉著、血栓形成、肺損傷或與膿毒病相關(guān)的腎臟紊亂中的一種或多種。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述的肺損傷是急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述與膿毒病相關(guān)的腎臟紊亂是急性腎小管壞死(ACN)。
26.如權(quán)利要求22-25所述的方法，其中，被施予的抗體、嵌合抗體或其片段是權(quán)利要求2-12中任意一項(xiàng)所包含的。
27.一種用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療膿毒病誘導(dǎo)的貧血的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合被抑制，所述施予足以預(yù)防或治療所述哺乳動(dòng)物的該征狀。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，被施予的抗體、嵌合抗體或其片段是權(quán)利要求2-12中任意一項(xiàng)所包含的。
全文摘要
本發(fā)明公開了在哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療膿毒病、膿毒病相關(guān)狀態(tài)或炎性疾病的方法。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施予治療有效量的至少一種能與組織因子(TF)特異性結(jié)合以形成復(fù)合體的人化抗體、嵌合抗體或其片段，其中，因子X或因子IX與所述復(fù)合體的結(jié)合受到抑制，所述施予足以在所述哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療所述膿毒病。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用，其包括治療膿毒病、與膿毒病相關(guān)的紊亂以及炎性疾病，例如，關(guān)節(jié)炎。
文檔編號(hào)C07K16/36GK1863556SQ200480023802
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者J·焦, H·C·王, J·O·伊根 申請(qǐng)人:泰諾士公司