專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域藥物制備方法，特別是一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法。
背景技術(shù)：
對(duì)乙型血友病和因肝臟疾患引起的凝血功能異常，目前主要采用高純度人凝血因子ix，或是主要含有維生素K依賴的凝血因子ii、vn、ix、X的凝血因子復(fù)合物(凝血酶原復(fù)合物)血漿蛋白制劑。輸注人凝血酶原復(fù)合物能提高血液中凝血因子ii、vn、ix、X的濃度，主要用于治療先天性和獲得性凝血因子ii、vn、ix、X缺乏癥。現(xiàn)有的人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，均采用去除冷沉淀的上清新鮮血漿或F III沉淀為原料，包括以下工序DEAE sephadex A_50凝膠吸附、洗滌、洗脫、超濾、S/D病毒滅活、凝膠吸附、洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活。如華蘭生物公開(kāi)的《凍干人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法》(公開(kāi)號(hào)CN 1475569A)，江西博雅公開(kāi)的《一種人凝血酶原復(fù)合物的制備工藝》(公開(kāi)號(hào)CN 101974070A)，山東泰邦公開(kāi)的《提高人凝血酶原復(fù)合物穩(wěn)定性F VII得率的工藝方法》。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，而提供一種工藝簡(jiǎn)單、安全性高、產(chǎn)品收率高、比活高的高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括化漿、調(diào)整蛋白濃度和PH值、凝膠吸附、洗滌、洗脫、稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度、S/D病毒滅活、再凝膠吸附、再洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活工藝步驟，調(diào)整蛋白濃度和PH值時(shí)，將去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C 0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2。本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案是稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度后，再加入0.5-1. 5%的甘氨酸保護(hù)劑。洗滌、洗脫時(shí)，洗滌液中氯化鈉濃度為0. 10-0. 15mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2。再洗滌、洗脫時(shí)，洗滌液中氯化鈉濃度為0. 02-0. 05mol/L,枸櫞酸鈉濃度為
0.01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L，枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2。
除菌分裝時(shí)，檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和
0.5-1. 5%鹽酸精氨酸，再加入肝素鈉。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有工藝簡(jiǎn)單、安全性高、產(chǎn)品收率高、比活高等特點(diǎn)，產(chǎn)品收率達(dá)到45. 28±2. 26萬(wàn)IU (以IX因子效價(jià)計(jì)算)/噸血漿，比活達(dá)到0. 87±0. 12IU/mg
本發(fā)明在DEAE sephadex A_50凝膠吸附前，用2_8°C 0. 9%的生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH值至6. 8-7. 2，利用血漿中各組分蛋白等電點(diǎn)的差異，使凝血酶原II、VII、IX、X因子充分被DEAE sephadex A_50凝膠吸附，而其他蛋白盡可能不吸附或少吸附。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明與現(xiàn)有工藝比較，以IX因子為例，產(chǎn)品得率提高 15-20%,比活由原來(lái)的 0. 62 ±0. 26IU/mg 提高至Ij 0. 87 ±0. 12IU/mg。本發(fā)明在洗滌、洗脫時(shí)，先用氯化鈉濃度為0.050-0.075mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2的洗滌液洗滌，再用氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L，pH值為6. 8-7. 2的洗脫液洗脫，通過(guò)控制洗滌液和洗脫液的氯化鈉、枸櫞酸鈉濃度以及PH值，達(dá)到既能有效去除雜蛋白，又能盡可能多的保留有效成分II、vn、ix、X因子的活性，明顯提高這類(lèi)相關(guān)因子的回收率。以IX因子為例，試驗(yàn)結(jié)果表 明，本發(fā)明此步操作回收率可以達(dá)到91. 87%±2. 56%，經(jīng)進(jìn)一步處理后，所得制品的總回收率達(dá)到72%以上，比現(xiàn)有工藝提高了 15-20%。本發(fā)明在S/D病毒滅活前，先將洗脫液用0. 45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15mS/cm，加入
0.5-1. 5%的甘氨酸保護(hù)劑，最后加入S/D溶液，由于降低了蛋白濃度，加入了蛋白保護(hù)劑，既保證了 s/d病毒滅活效果，在操作過(guò)程中又能使有效成分ii、vn、ix、X因子的活性損失更少。本發(fā)明在S/D病毒滅活后，先使用氯化鈉濃度為0. 02-0. 05mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0.01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2的洗滌液洗滌7_10次，再用氯化鈉濃度為
1.5-2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2的洗脫液洗脫2-3次，通過(guò)分別控制再洗滌、洗脫時(shí)洗滌液和洗脫液的氯化鈉濃度、枸櫞酸鈉濃度、PH值，以及洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)，達(dá)到既能有效去除S/D殘留，同時(shí)又能盡可能多的保留有效成分II、vn、IX、X因子。以IX因子為例，試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明此步操作比現(xiàn)有工藝的回收率高3%左右。本發(fā)明在除菌分裝前加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，以IX因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑。由于凍干和干熱滅活對(duì)制品效價(jià)有較大影響，本發(fā)明采用雙氨基酸作為成品保護(hù)劑，既能保證產(chǎn)品能有效的進(jìn)行病毒滅活，又有效的保留了有效成分n、vn、ix、x因子的活性。與單一氨基酸保護(hù)劑比較，比活由原來(lái)的0. 62±0. 26IU/mg 提高至Ij 0. 87±0. 12IU/mg。以下結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容作進(jìn)一步描述。
具體實(shí)施例方式基本要求
1、原料血漿的采集和質(zhì)量應(yīng)符合《中國(guó)藥典》血液制品生產(chǎn)用人血漿的要求；
2、生產(chǎn)設(shè)備管線器具應(yīng)清潔消毒；
3、生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)符合血液制品生產(chǎn)規(guī)范要求。實(shí)施例一
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括如下工藝步驟
(I)化漿以符合藥典要求的低溫冰凍血漿為原料，用酒精消毒血漿袋表面后，用注射用水化漿，混漿溫度0-4°C，再離心去除冷沉淀，澄清過(guò)濾；
(2)調(diào)整蛋白濃度和pH值將上述去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2 ；
(3)凝膠吸附按1.0-1. 5kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadexA-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠，上清液并入血漿罐中，平衡液中氯化鈉濃度為0. 050-0. 075mol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(4)洗滌、洗脫先用洗滌液洗滌凝膠2-3次，再用洗脫液洗脫凝膠2-3次，收集洗脫
液；
(5)稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度將上述洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15ms/cm ；
(6)S/D病毒滅活在洗脫液中加入S/D溶液，使TNBP (磷酸三丁酯)和TWeen80 (吐溫-80)終濃度分別為0. 3%和1%，24-26°C保溫6小時(shí);
(7)再凝膠吸附將S/D病毒滅活后的蛋白溶液，按0.8-1. 2kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadex A_50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠；
(8)再洗滌、洗脫用洗滌液洗滌凝膠7-10次，再用洗脫液洗脫凝膠2-3次，收集洗脫
液；
(9)超濾將洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾，收集濾液，用十萬(wàn)分子量膜的超濾器超濾預(yù)濃縮至洗脫液一半，然后用透析液對(duì)半超濾3-5次，透析液中枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(10)除菌分裝以K因子總效價(jià)的0.2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，再進(jìn)行配制、除圃分裝；
(11)凍干、干熱滅活凍干、出柜、軋蓋后用99.5-100. 5°C水浴干熱病毒滅活30分鐘。實(shí)施例二
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括如下工藝步驟
(1)化漿以符合藥典要求的低溫冰凍血漿為原料，用酒精消毒血漿袋表面后，用注射用水化漿，混漿溫度0-4°C，再離心去除冷沉淀，澄清過(guò)濾；
(2)調(diào)整蛋白濃度和pH值將上述去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3. 5%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2 ；
(3)凝膠吸附按1.0-1. 5kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadexA-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠，上清液并入血漿罐中，平衡液中氯化鈉濃度為0. 050-0. 075mol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(4)洗滌、洗脫先用洗滌液洗滌凝膠2-3次，再用洗脫液洗脫凝膠2-3次，收集洗脫
液；
(5)稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度將上述洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15ms/cm,再加入0. 5%的甘氨酸保護(hù)劑。(6) S/D病毒滅活在洗脫液中加入S/D溶液，使TNBP (磷酸三丁酯)和TWeen80(吐溫-80)終濃度分別為0. 3%和1%，24-26°C保溫6小時(shí);(7)再凝膠吸附將S/D病毒滅活后的蛋白溶液，按0.8-1. 2kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadex A-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠；
(8)再洗滌、洗脫用洗滌液洗滌凝膠7-10次，再用洗脫液洗脫凝膠2-3次，收集洗脫
液；
(9)超濾將洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾，收集濾液，用十萬(wàn)分子量膜的超濾器超濾預(yù)濃縮至洗脫液一半，然后用透析液對(duì)半超濾3-5次，透析液中枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ； (10)除菌分裝以K因子總效價(jià)的0.2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，再進(jìn)行配制、除圃分裝；
(11)凍干、干熱滅活凍干、出柜、軋蓋后用99.5-100. 5°C水浴干熱病毒滅活30分鐘。實(shí)施例三
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括如下工藝步驟
(1)化漿以符合藥典要求的低溫冰凍血漿為原料，用酒精消毒血漿袋表面后，用注射用水化漿，混漿溫度0-4°C，再離心去除冷沉淀，澄清過(guò)濾；
(2)調(diào)整蛋白濃度和pH值將上述去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至4. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2 ；
(3)凝膠吸附按I.0-1. 5kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadexA-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠，上清液并入血漿罐中，平衡液中氯化鈉濃度為0. 050-0. 075mol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(4)洗漆、洗脫先用洗漆液洗漆凝膠2-3次，洗漆液中氯化鈉濃度為0.10mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;再用洗脫液洗脫凝膠2_3次，收集洗脫液，洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ；
(5)稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度將上述洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15ms/cm,再加入0. 8%的甘氨酸保護(hù)劑。(6) S/D病毒滅活在洗脫液中加入S/D溶液，使TNBP (磷酸三丁酯)和TWeen80(吐溫-80)終濃度分別為0. 3%和1%，24-26°C保溫6小時(shí);
(7)再凝膠吸附將S/D病毒滅活后的蛋白溶液，按0.8-1. 2kg干膠/1000kg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadex A-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠；
(8)再洗滌、洗脫用洗滌液洗滌凝膠7-10次，再用洗脫液洗脫凝膠2-3次，收集洗脫
液；
(9)超濾將洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾，收集濾液，用十萬(wàn)分子量膜的超濾器超濾預(yù)濃縮至洗脫液一半，然后用透析液對(duì)半超濾3-5次，透析液中枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(10)除菌分裝以K因子總效價(jià)的0.2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，再進(jìn)行配制、除圃分裝；
(11)凍干、干熱滅活凍干、出柜、軋蓋后用99.5-100. 5°C水浴干熱病毒滅活30分鐘。實(shí)施例四
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括如下工藝步驟(1)化漿以符合藥典要求的低溫冰凍血漿為原料，用酒精消毒血漿袋表面后，用注射用水化漿，混漿溫度0-4°C，再離心去除冷沉淀，澄清過(guò)濾；
(2)調(diào)整蛋白濃度和pH值將上述去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至4. 5%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2 ；
(3)凝膠吸附按I.0-1. 5kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadexA-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠，上清液并入血漿罐中，平衡液中氯化鈉濃度為0. 05-0. 075mol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(4)洗漆、洗脫先用洗漆液洗漆凝膠2-3次，洗漆液中氯化鈉濃度為0.12mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 015 mol/L，pH值為6. 8-7. 2 ;再用洗脫液洗脫凝膠2_3次，收集洗脫液，洗脫液中氯化鈉濃度為I. 8mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 015 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ；
(5)稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度將上述洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15ms/cm，再加入I. 2%的甘氨酸保護(hù)劑。(6) S/D病毒滅活在洗脫液中加入S/D溶液，使TNBP (磷酸三丁酯)和TWeen80(吐溫-80)終濃度分別為0. 3%和1%，24-26°C保溫6小時(shí);
(7)再凝膠吸附將S/D病毒滅活后的蛋白溶液，按0.8-1. 2kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadex A_50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠；
(8)再洗滌、洗脫用洗滌液洗滌凝膠7-10次，洗滌液中氯化鈉濃度為0.05mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;再用洗脫液洗脫凝膠2_3次，收集洗脫液，洗脫液中氯化鈉濃度為2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ；
(9)超濾將洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾，收集濾液，用十萬(wàn)分子量膜的超濾器超濾預(yù)濃縮至洗脫液一半，然后用透析液對(duì)半超濾3-5次，透析液中枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(10)除菌分裝以K因子總效價(jià)的0.2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，再進(jìn)行配制、除圃分裝；
(11)凍干、干熱滅活凍干、出柜、軋蓋后用99.5-100. 5°C水浴干熱病毒滅活30分鐘。實(shí)施例五
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括如下工藝步驟
(1)化漿以符合藥典要求的低溫冰凍血漿為原料，用酒精消毒血漿袋表面后，用注射用水化漿，混漿溫度0-4°C，再離心去除冷沉淀，澄清過(guò)濾；
(2)調(diào)整蛋白濃度和pH值將上述去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至5. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6. 8-7. 2 ；
(3)凝膠吸附按I.0-1. 5kg干膠/1000kg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadexA-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠，上清液并入血漿罐中，平衡液中氯化鈉濃度為0. 05-0. 075mol/L,枸櫞酸鈉濃度為 0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(4)洗漆、洗脫先用洗漆液洗漆凝膠2-3次，洗漆液中氯化鈉濃度為0.15mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;再用洗脫液洗脫凝膠2_3次，收集洗脫液，洗脫液中氯化鈉濃度為2. 0mol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ；
(5)稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度將上述洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾除去細(xì)小顆粒，然后用0-8°C注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0. 5-2. 5%，離子強(qiáng)度為5-15ms/cm，再加入I. 5%的甘氨酸保護(hù)劑。(6) S/D病毒滅活在洗脫液中加入S/D溶液，使TNBP (磷酸三丁酯)和TWeen80(吐溫-80)終濃度分別為0. 3%和1%，24-26°C保溫6小時(shí);
(7)再凝膠吸附將S/ D病毒滅活后的蛋白溶液，按0.8-1. 2kg干膠/IOOOkg血漿量加入用平衡液處理后DEAE sephadex A-50凝膠，攪拌吸附45-60分鐘，收集凝膠；
(8)再洗滌、洗脫用洗滌液洗滌凝膠7-10次，洗滌液中氯化鈉濃度為0.05mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;再用洗脫液洗脫凝膠2_3次，收集洗脫液，洗脫液中氯化鈉濃度為2. Omol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ；
(9)超濾將洗脫液用0.45-1. Oum的濾芯過(guò)濾，收集濾液，用十萬(wàn)分子量膜的超濾器超濾預(yù)濃縮至洗脫液一半，然后用透析液對(duì)半超濾3-5次，透析液中枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2 ；
(10)除菌分裝檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入I.5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，以K因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，再進(jìn)行配制、除菌分裝;
(11)凍干、干熱滅活凍干、出柜、軋蓋后用99.5-100. 5°C水浴干熱病毒滅活30分鐘。將本發(fā)明上述方法得到的凝血酶原復(fù)合物制品與現(xiàn)有工藝處理得到的凝血酶原復(fù)合物比較，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表一。表I 本發(fā)明方法與現(xiàn)有工藝制備凝血酶原復(fù)合物各工序IX因子效價(jià)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果
I^ltlOOOkg血漿I本發(fā)明方法(n=3) I傳統(tǒng)方法(n=3)
亟附前總效價(jià)(以IX因子計(jì)算)_ 81.45±3. 33萬(wàn)IU 80. 65±3. 69萬(wàn)IU
互D病毒滅活前總效價(jià)(以IX因子計(jì)算) 74. 83±2. 18萬(wàn)IU 61. 38±2. 36萬(wàn)IU 互D病毒滅活后總效價(jià)(以IX因子計(jì)算) 65. 72±2. 35萬(wàn)IU 51. 14± I. 93萬(wàn)IU Ii、液總效價(jià)(以IX因子計(jì)算)58. 50±2. 09萬(wàn)IU 44. 68± I. 86萬(wàn)IU
歲品總效價(jià)(以IX因子計(jì)算)45. 28±2. 26萬(wàn)IU 32. 62±2. 24萬(wàn)IU
讀品比活(以 IX 因子計(jì)算)|o. 87±0. 12IU/mg |p. 62±0. 26IU/mg
從上表可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述工藝明顯優(yōu)于現(xiàn)有工藝，能顯著提高凝血酶原復(fù)合
物的收率，制品的安全性、產(chǎn)品收率以及比活均優(yōu)于現(xiàn)有制備工藝。
權(quán)利要求
1.一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括化漿、調(diào)整蛋白濃度和PH值、凝膠吸附、洗滌、洗脫、稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度、S/D病毒滅活、再凝膠吸附、再洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活工藝步驟，其特征是調(diào)整蛋白濃度和PH值時(shí)，將去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8°C 0. 9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3. 0-5. 0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)PH值至6. 8-7.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度后，再加入0. 5-1. 5%的甘氨酸保護(hù)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是洗滌、洗脫時(shí)，洗滌液中氯化鈉濃度為0. 10-0. 1511101/1，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02 mol/L,pH值為6. 8-7. 2 ;洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L,pH 值為 6. 8-7. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是再洗滌、洗脫時(shí)，洗滌液中氯化鈉濃度為0. 02-0. 05mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L,pH值為6. 8-7. 2 ;洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L,枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH 值為 6. 8-7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是再洗滌、洗脫時(shí)，洗滌液中氯化鈉濃度為0. 02-0. 05mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L, pH值為6. 8-7. 2 ;洗脫液中氯化鈉濃度為I. 5-2. Omol/L，枸櫞酸鈉濃度為0. 01-0. 02 mol/L,pH 值為 6. 8-7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是除菌分裝時(shí)，檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，再以IX因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，然后進(jìn)行配制、除菌分裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是除菌分裝時(shí)，檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，再以IX因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，然后進(jìn)行配制、除菌分裝。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是除菌分裝時(shí)，檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，再以IX因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，然后進(jìn)行配制、除菌分裝。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，其特征是除菌分裝時(shí)，檢測(cè)濃縮液效價(jià)，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果先加入0. 5-1. 5%的甘氨酸和0. 5-1. 5%鹽酸精氨酸，再以IX因子總效價(jià)的0. 2-0. 3倍加入肝素鈉作為成品保護(hù)劑，然后進(jìn)行配制、除菌分裝。
全文摘要
一種高收率人凝血酶原復(fù)合物的制備方法，包括化漿、調(diào)整蛋白濃度和pH值、凝膠吸附、洗滌、洗脫、稀釋調(diào)整蛋白濃度和離子強(qiáng)度、S/D病毒滅活、再凝膠吸附、再洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活工藝步驟，調(diào)整蛋白濃度和pH值時(shí)，將去除冷沉淀、澄清過(guò)濾的血漿用2-8℃0.9%生理鹽水調(diào)整蛋白濃度至3.0-5.0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)pH值至6.8-7.2。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有工藝簡(jiǎn)單、安全性高、產(chǎn)品收率高、比活高等特點(diǎn)，產(chǎn)品收率達(dá)到45.28±2.26萬(wàn)IU(以IX因子效價(jià)計(jì)算)/噸血漿，比活達(dá)到0.87±0.12IU/mg。
文檔編號(hào)C07K14/745GK102614219SQ20121009884
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者單永紅, 岳躍飛, 資道鳳, 黃忠文 申請(qǐng)人:湖南紫光古漢南岳制藥有限公司