專利名稱：一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
人凝血酶原復(fù)合物(PCC)，是一種包含維生素K依賴性凝血因子II、VII、IX、X的制劑，主要是用來(lái)治療乙型血友病和由于肝功能異常導(dǎo)致的凝血機(jī)能障礙。傳統(tǒng)工藝多采用血液制品生產(chǎn)中的中間體-組分III中提取，由于組分III生產(chǎn)的前期操作對(duì)凝血因子的破壞作用，導(dǎo)致產(chǎn)品批間差異大，凝血因子活性不穩(wěn)定，產(chǎn)品收率低并且部分凝血因子易被激活，在使用上容易引起血栓等不良反應(yīng)。本發(fā)明采用從血漿中直接分離提取，分離條件溫和，產(chǎn)品的批間差異小，凝血因子活性穩(wěn)定，收獲率高，凝血因子基本沒有激活現(xiàn)象發(fā)生。 由于人凝血酶原復(fù)合物(PCC)屬于血液制品，理論上存在傳播乙肝、丙肝、艾滋等病毒的風(fēng)險(xiǎn)，所以在工藝中采用有效的病毒滅活工藝是必要的，本發(fā)明采用S/D法和熱處理(80°C， 72小時(shí))相結(jié)合的雙重滅活方法，充分保證了產(chǎn)品的安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人凝血酶原復(fù)合物(PCC)的生產(chǎn)方法，采用從血漿中直接分離， 并采用S/D法和熱處理(80°C，72小時(shí))相結(jié)合的雙重滅活方法，一方面使產(chǎn)品批間差異小，凝血因子活性穩(wěn)定，收獲率高，減少活化因子引起血栓的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)充分保障病毒方面的安全性。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的A、分離提取將原料血漿融化，保持血漿溫度在0 4°C，在0 4°C下離心去除冷沉淀，去除冷沉淀的上清升溫至12 14°C，加入溶脹的凝膠攪拌，吸附45分鐘，收集凝膠，用洗滌液快速?zèng)_洗凝膠3次或以上，再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共洗3次，將制品洗脫下來(lái)，收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再用透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0. 85% (g/ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在10IU/ml左右，計(jì)量濃縮液的重量；B、病毒滅活將濃縮液邊攪拌邊按10 1比例緩慢加入11% (g/ml)的S/D溶液，使聚山梨酯-80最終濃度為1 % (g/ml)，磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，加入S/D滅活液后， 給蛋白液加溫，使制品溫度維持在M ^TC,保溫6小時(shí)，進(jìn)行病毒滅活，每半小時(shí)記錄蛋白液溫度一次；C、精制將病毒滅活結(jié)束的蛋白液加入平衡處理好的凝膠，吸附45 60分鐘。用洗滌液快速洗滌凝膠3次或以上，以去除殘余的S/D。再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共洗3次，將制品洗脫下來(lái)，收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再3 5倍體積透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0. 85% (g/ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在30IU/ml左右，將超濾濃縮后蛋白液，調(diào)整PH值為6. 8 7. 0，補(bǔ)加透析液，使制品的IX因子最終效價(jià)為25IU/ml左右，加入保護(hù)劑后除菌、分裝、凍干；D、二次病毒滅活凍干后的制品經(jīng)80°C，72小時(shí)干熱處理，進(jìn)行第二次病毒滅活；步驟A和C中的洗滌液配方為0. 13M 0. 15M氯化鈉和0. OlM 0. 03M檸檬酸三鈉，用鹽酸調(diào)溶液的PH值為6. 8。步驟A和C中的洗脫液配方為1. 6M 2. OM氯化鈉和0. OlM 0. 03M檸檬酸三鈉。步驟A和C中的透析液配方為0. OlM檸檬酸三鈉，用鹽酸調(diào)溶液的pH值為6. 8。步驟B中的S/D液的配方是11% (g/ml)聚山梨酯-80和3. 3% (g/ml)磷酸三丁酯。步驟C中的保護(hù)劑為 5%甘氨酸和2 10單位的肝素/ml。步驟A和C中所用得凝膠是二乙氨乙基交聯(lián)瓊脂糖凝膠或者二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠，使用量為血漿總量的1%。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用從血漿中直接分離提取，并防止了凝血因子在提取過(guò)程中被激活，提高了制品的穩(wěn)定性，增加了凝血因子的收獲率。同時(shí)，在工藝中采用有效的病毒滅活工藝，采用S/D法和干熱處理相結(jié)合的雙重滅活方法，對(duì)脂包膜病毒和非脂包膜病毒均進(jìn)行了有效的滅活，充分保證了產(chǎn)品的病毒安全性。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 A、分離提取將原料血漿融化，保持血漿溫度在0°C，并在0°C下離心去除冷沉淀，去除冷沉淀的上清升溫至12°C，加入1 %溶脹的二乙氨乙基交聯(lián)瓊脂糖凝膠攪拌，吸附45分鐘，收集凝膠，用洗滌液快速?zèng)_洗凝膠3次，再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共洗3次，將制品洗脫下來(lái)， 收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再用透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0.85% (g/ ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在10IU/ml左右，計(jì)量濃縮液的重量；B、病毒滅活將濃縮液邊攪拌邊按10 1比例緩慢加入11% S/D溶液，使聚山梨酯-80的最終濃度為(g/ml)，磷酸三丁酯的最終濃度為0.3% (g/ml)，加S/D滅活劑后，將蛋白液的溫度維持在M ^TC,保溫6小時(shí)，進(jìn)行病毒滅活。每半小時(shí)記錄蛋白液溫度一次；C、精制將病毒滅活結(jié)束的蛋白液加入平衡處理好的凝膠，吸附45分鐘。用洗滌液快速洗滌凝膠3次，以去除殘余的S/D。再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共洗3次，將制品洗脫下來(lái)， 收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再3倍體積透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0. 85% (g/ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在30IU/ml左右將超濾濃縮后蛋白液，調(diào)整蛋白液的pH值為6. 9，補(bǔ)加透析液，使制品的IX因子最終效價(jià)為25IU/ml左右，加入保護(hù)劑后除菌、分裝、凍干；D、二次病毒滅活凍干后的制品經(jīng)80°C，72小時(shí)干熱處理，進(jìn)行第二次病毒滅活；即得人凝血酶原復(fù)合物成品。結(jié)果見表1.表1 結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，包括A.分離提取將原料血漿融化，保持血漿溫度在0 4°C，在此溫度下離心去除冷沉淀，把上清升溫至12 14°C，加入溶脹的凝膠攪拌，吸附45分鐘，收集凝膠，用洗滌液快速?zèng)_洗凝膠3次或以上，再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共3次，將制品洗脫下來(lái)，收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再用透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0. 85% (g/ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在10IU/ml左右，計(jì)量濃縮液的重量；B.S/D病毒滅活C.精制將S/D病毒滅活結(jié)束的蛋白液加入平衡處理好的凝膠，吸附45 60分鐘。用洗滌液快速洗滌凝膠3次或以上，以去除殘余的S/D。再用洗脫液浸泡10分鐘/次，共洗3次，將制品洗脫下來(lái)，收集洗脫蛋白液進(jìn)行超濾，預(yù)濃縮，再用3 5倍體積透析液超濾，使殘余氯化鈉濃度小于0. 85% (g/ml)，將制品濃縮至IX因子效價(jià)在30IU/ml左右將超濾濃縮后蛋白液，調(diào)整PH值6. 8 7. 0，補(bǔ)加透析液，使制品的IX因子最終效價(jià)為25IU/ml左右，加入保護(hù)劑后除菌、分裝、凍干；D.二次病毒滅活凍干后的制品經(jīng)80°C，72小時(shí)干熱處理，進(jìn)行第二次病毒滅活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟A和C 中的洗滌液配方為0. 13M 0. 15M氯化鈉和0.01M 0. 03M檸檬酸三鈉，用鹽酸調(diào)溶液的 PH值為6.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟A和C 中的洗脫液配方為1. 6M 2. OM氯化鈉和0. OlM 0. 03M檸檬酸三鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟A和C 中的透析液配方為0. OlM檸檬酸三鈉，用鹽酸調(diào)溶液的pH值為6. 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟B的步驟是按以下進(jìn)行的，將濃縮液邊攪拌邊按10 1比例緩慢加入11% (g/ml) S/D溶液，使聚山梨酯-80的最終濃度為(g/ml)，磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，加入S/D 后，將蛋白液的溫度維持在M°C ^TC,保溫6小時(shí)，進(jìn)行病毒滅活，每半小時(shí)記錄蛋白液溫度一次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于S/D液的配方是11% (g/ml)聚山梨酯-80和3. 3% (g/ml)磷酸三丁酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟C中的保護(hù)劑為 5%甘氨酸和2 10單位的肝素/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟A和C 中所用的凝膠是二乙氨乙基交聯(lián)瓊脂糖凝膠，使用量為血漿總量的1%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟A和C 中所用的凝膠是二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠，使用量為血漿總量的1%。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法。其特點(diǎn)是采用從血漿中直接分離提取，病毒滅活，精制，二次病毒滅活，即得人凝血酶原復(fù)合物成品。本發(fā)明采用從血漿中直接分離提取，分離條件溫和，產(chǎn)品的批間差異小，凝血因子活性穩(wěn)定，收獲率高，且基本沒有激活現(xiàn)象發(fā)生。病毒滅活工藝采用S/D法和干熱滅活法相結(jié)合的方法，充分保證了產(chǎn)品的病毒安全性。
文檔編號(hào)A61K38/48GK102151289SQ20111003079
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者于洋, 孫曉東, 李常祿, 楊金平, 郭晶, 陳鳳珠, 魏舒 申請(qǐng)人:哈爾濱派斯菲科生物制藥股份有限公司