一種雙嵌段分子探針及其快速檢測核酸方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，涉及一種雙嵌段分子探針及其快速檢測核酸方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸快速檢測技術(shù)在醫(yī)療診斷，食品安全和環(huán)境監(jiān)控領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。當(dāng)前核酸檢測方法主要采用蛋白酶(例如核酸聚合酶、連接酶和外切酶)作為信號擴(kuò)增工具。這些方法雖然能夠達(dá)到較低檢測限，但是這些方法操作較為復(fù)雜，耗時，耗力，成本相對較高。催化發(fā)夾組裝是一個無酶的信號放大策略，常被用于增強(qiáng)核酸雜交信號。催化發(fā)夾組裝利用亞穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾探針來組裝Y型核酸結(jié)構(gòu)。它能夠?qū)⒑怂岬墓δ芎徒Y(jié)構(gòu)的信息進(jìn)行編碼，而且只有較低的背景信號，這些特點(diǎn)使得它在核酸檢測中具有更大的應(yīng)用前景。實(shí)際上，催化發(fā)夾組裝已經(jīng)常常與其他檢測手段相結(jié)合，例如化學(xué)發(fā)光電化學(xué)技術(shù)，電化學(xué)和熒光檢測技術(shù)。這些技術(shù)雖然具有較高的靈敏度，但是它們往往需要使用先進(jìn)復(fù)雜的儀器，這些不足在一定很大程度上已經(jīng)限制了它們的廣泛應(yīng)用。
[0003]金納米粒比色檢測技術(shù)靈敏度高，只需要簡單的儀器，甚至可以直接用肉眼觀察。金比色測定法通過結(jié)合催化發(fā)夾組裝信號放大策略，可實(shí)現(xiàn)超靈敏的核酸快速檢測。這是因?yàn)檫@種結(jié)合可以將核酸識別可以簡單的轉(zhuǎn)化為顏色變化。這些快算檢測方法通常需要制備巰基修飾的核酸探針。然而，這種探針制備方法通常比較耗時(20-40小時)。此外，探針修飾巰基還增加了檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明的目的在于將基于polyA與發(fā)夾探針結(jié)合的雙嵌段探針的催化發(fā)夾組裝的信號放大作用與納米金比色檢測技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建一種核酸的快速檢測方法。該方法具有特異性高，操作簡單，檢測迅速等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0006]一種用于快速檢測DNA的試劑盒，其包括至少3條雙嵌段分子探針:雙嵌段分子探針1、雙嵌段分子探針2和雙嵌段分子探針3 ;所述雙嵌段分子探針1從5’到3’依次包括:啟動區(qū)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和polyA區(qū)；其中，雙嵌段分子探針1的啟動區(qū)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)5’莖區(qū)的部分序列與目標(biāo)DNA的部分序列互補(bǔ)，雙嵌段分子探針2的啟動區(qū)與雙嵌段分子探針1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的部分序列互補(bǔ)，雙嵌段分子探針3的啟動區(qū)與雙嵌段分子探針2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的部分序列互補(bǔ)。
[0007]所述雙嵌段分子探針1的啟動區(qū)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)5’莖區(qū)序列與雙嵌段分子探針3的發(fā)夾結(jié)構(gòu)3’莖區(qū)及環(huán)區(qū)的部分序列互補(bǔ)；所述雙嵌段分子探針2的啟動區(qū)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)5’莖區(qū)序列與雙嵌段分子探針1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)3’莖區(qū)及環(huán)區(qū)的部分序列互補(bǔ)；所述雙嵌段分子探針3的啟動區(qū)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)5’莖區(qū)序列與雙嵌段分子探針2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)3’莖區(qū)及環(huán)區(qū)的部分序列互補(bǔ)。
[0008]所述三條雙嵌段分子探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)打開后，可將三條雙嵌段分子探針組裝成Y型核酸結(jié)構(gòu)。
[0009]作為優(yōu)選的，所述雙嵌段分子探針的啟動區(qū)至少含有4個堿基。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述雙嵌段分子探針的啟動區(qū)含有6?8個堿基。
[0011]作為優(yōu)選的，所述雙嵌段分子探針的polyA區(qū)至少含有5個腺嘌呤。
[0012]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述雙嵌段分子探針的polyA區(qū)含有15?20個腺嘌呤。
[0013]所述試劑盒中還含有納米金膠溶液、核酸雜交緩沖液。
[0014]一種快速檢測DNA的方法，包括以下步驟:
[0015]1)將雙嵌段探針加到樣品液中，室溫反應(yīng)，使催化發(fā)夾探針組裝反應(yīng)充分；
[0016]2)步驟1)中反應(yīng)完成后，取反應(yīng)液與納米金溶液混合，靜置，待顯色反應(yīng)完全；
[0017]3)根據(jù)顏色反應(yīng)結(jié)果判斷樣品是否含有目標(biāo)核酸。
[0018]步驟3)的判斷方法為:(1)當(dāng)納米金溶液由紅色變成藍(lán)色，表明樣品液中含有目標(biāo)DNA ;或者用顯色反應(yīng)液在650納米和524nm處的0D值比值表示，若比值在0.26以上，說明此樣品中含有目標(biāo)核酸，檢測得到0D值比值與核酸濃度正相關(guān)。
[0019]下面以某一特定目標(biāo)DNA序列的檢測為例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明:
[0020]目標(biāo)DNA，從5’至3’依次含有y*、b*、x*、a*區(qū)段，根據(jù)該目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)三條雙嵌段分子探針DHP1，DHP2和DHP3，其中:
[0021]DHP1 從 5’ -3’ 依次包括 a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x* 區(qū)段和 polyA 結(jié)構(gòu)區(qū)，其中a區(qū)段為啟動區(qū)，x至x*區(qū)段為發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。目標(biāo)DNA的a*、x*、b*、y*區(qū)分別與DHP1的
a、x、b、y區(qū)段互補(bǔ)。
[0022]DHP2 從 5’ _3，依次包括 b、y、c、z、x*、a*、z*、c*、y* 區(qū)段和 polyA 結(jié)構(gòu)區(qū)，其中b區(qū)段為啟動區(qū)，y至y*區(qū)段為發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。b、y、c、z區(qū)分別與DHP1的b*、y*、c*、z*區(qū)段互補(bǔ)。
[0023]DHP3 從 5’ _3，依次包括 c、z、a、x、y*、b*、x*、a*、z* 區(qū)段和 polyA 結(jié)構(gòu)區(qū)，其中c區(qū)段為啟動區(qū)，z至z*區(qū)段為發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。c、z、a、X區(qū)分別與DHP1的c*、z*、a*、x*區(qū)段互補(bǔ)。
[0024]當(dāng)樣品中含有目標(biāo)DNA時，目標(biāo)DNA的a*區(qū)與DHP1的a區(qū)結(jié)合，觸發(fā)了啟動區(qū)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，依次打開雙嵌段分子探針2、雙嵌段分子探針3的頸環(huán)結(jié)構(gòu)并且與之結(jié)合，最終產(chǎn)生大量的帶有三個polyA尾巴的Y型核酸構(gòu)造物。在鹽的作用下，該核酸構(gòu)造物的polyA能夠與多個納米金結(jié)合使之聚集，并且最終使得納米金由紅色變成藍(lán)色。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026](1)本發(fā)明所述的雙嵌段探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)和polyA，無需修飾，制備成本低；
[0027](2)在目標(biāo)核酸序列存在時，目標(biāo)序列通過級聯(lián)的鏈置換反應(yīng)依次與三條雙嵌段探針(DHP1，DHP2和DHP3)結(jié)合，生成大量的Y型核酸結(jié)構(gòu)，該Y型核酸帶有3個單鏈polyA尾巴，多聚腺嘌呤(polyA)序列對金納米粒子具有高親和力，在鹽存在下，該Y型核酸結(jié)構(gòu)能夠與納米金結(jié)合，使得納米金溶液由紅色變成藍(lán)色，從而達(dá)到快速檢測的目的；
[0028](3)本發(fā)明所述的核酸檢測方法具有較高的靈敏度，對核酸的檢測限為0.0lfM，檢測過程方便、迅速，可用于實(shí)地現(xiàn)場檢測；
[0029](4)本發(fā)明所述的核酸檢測方法具有很好的特異性，能夠識別單堿基突變的核酸序列。
【附圖說明】
[0030]圖1為雙嵌段分子探針示意圖；
[0031]圖2為快速檢測核酸的示意圖；
[0032]圖3為探針濃度對檢測的影響；
[0033]圖4為反應(yīng)時間對檢測的影響；
[0034]圖5鹽濃度對檢測核酸的影響；
[0035]圖6為核酸檢測的回歸曲線；
[0036]圖7為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0037]圖8為細(xì)菌DNA檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]一、雙嵌段探針的制備
[0039](1)雙嵌段探針的設(shè)計(jì)、合成與純化:
[0040]設(shè)計(jì)3條雙嵌段分子探針:雙嵌段分子探針1、雙嵌段分子探針2和雙嵌段分子探針3 ;所述雙嵌段分子探針1從5’到3’依次包括:啟動區(qū)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)和polyA區(qū)；其中，雙嵌段分子探針1的啟動區(qū)與目標(biāo)DNA的部分序列互補(bǔ)，雙嵌段分子探針2的啟動區(qū)與雙嵌段分子探針1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的部分序列互補(bǔ)，雙嵌段分子探針3的啟動區(qū)與雙嵌段分子探針2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)的部分序列互補(bǔ)，三條雙嵌段分子探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)打開后，可將三條雙嵌段分子探針組裝成Y型核酸結(jié)構(gòu)。所述雙嵌段探針的結(jié)構(gòu)如圖1所示，采用固相法合成，高效液相法進(jìn)行純化；
[0041](2)雙嵌段探針溶液配制:所述雙嵌段探針采用超純水溶解制成濃縮貯備液，然后用磷酸鹽緩沖液(50mM Na2HP04, 1M NaCl, pH 6.8)稀釋到合適濃度；
[0042](3)探針退火:所述探針溶液于95°C溫育5min，然后緩慢冷卻室溫，置于4°C保存；
[0043]二、快速檢測核酸的方法
[0044]1)將上述制備的三條雙嵌段分子探針加到核酸樣品液中，室溫(18?27°C )反應(yīng)120min，使催化發(fā)夾組裝反應(yīng)充分；
[0045]2)取15-25 μ L的上述反應(yīng)液與250-350 μ L的納米金溶液混合，靜置3min，待顯色反應(yīng)完全；
[0046]3)將2)中得到顯色反應(yīng)液加入石英比色皿，掃描200-800納米處紫外可見光吸收；
[0047]4)計(jì)算650納米與524納米處吸收值的比值，若比值在0.26以上，說明此樣品中含有目標(biāo)核酸。
[0048]快速檢測核酸的方法的示意圖如圖2所示。
[0049]下面舉例介紹一下本發(fā)明方法的技術(shù)原理:
[0050]在有目標(biāo)核酸序列存在下，目標(biāo)序列與雙嵌段分子探針1的5’端單鏈啟動區(qū)結(jié)合，觸發(fā)了啟動區(qū)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，依次打開雙嵌段分子探針2、雙嵌段分子探針3的頸環(huán)結(jié)構(gòu)并且與之結(jié)合，最終產(chǎn)生大量的帶有三個polyA尾巴的Y型核酸構(gòu)造物。在鹽的作用下，該核酸構(gòu)造物的polyA能夠與多個納米金結(jié)合使之聚集，并且最終使得納米金由紅色變成藍(lán)色。該顏色的變化程度可以直接肉眼觀察，也可以用650納米和524nm處0D值比值表示。檢測得到0D值比值與核酸濃度在一定范圍正相關(guān)。
[0051]下面以特異性目標(biāo)DNA的檢測為例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0052]實(shí)施例1
[0053]一、雙嵌段探針的制備
[0054](1)雙嵌段探針的設(shè)計(jì)與合成
[0055]根據(jù)目標(biāo)DNA序列設(shè)計(jì)雙嵌段探針，目標(biāo)DNA的核酸序列如下所示:
[0056]y* b* x* a*
[0057]5’ -GCACTA-CTCCCT-AACATC-TCAAGC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0058]設(shè)計(jì)好的雙嵌段探針，用NUPACK軟件分析其二維結(jié)構(gòu)的自由能，若自由能為負(fù)值則說明探針可行。將設(shè)計(jì)好的雙嵌段探針交由核酸合成公司進(jìn)行合成，合成好的探針用高效液相法純化，并且用質(zhì)譜檢測合成的探針是否與設(shè)計(jì)的一致。合成成功的探針凍干后保存于-20°C。具體序列如下:
[0059]DHP1:
[0060]a X b y z* c* y* b* x*
[0061 ] 5’-GCTTGA-GATGTT-AGGGAG-TAGTGC-TCCAAT-CACAAC-GCACTA-CTCCCT-AACATC-AAAAAAAAAAAAAAA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0062]DHP1 從 5’ _3，依次包括 a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x* 區(qū)段和 polyA 結(jié)構(gòu)區(qū)，其中a區(qū)段為啟動區(qū)，x至x*區(qū)段為發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。目標(biāo)DNA的a*、x*、b*、y*區(qū)