專利名稱：用于結(jié)合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法
與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2004年11月24日提交的、發(fā)明名稱為“用于結(jié)合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法”的美國專利申請10/996,952的優(yōu)先權(quán)，該申請以引用的方式納入本文。
背景技術(shù)：
采用不依賴于標記的檢測(label independent detection，LID)平臺(例如表面等離子共振(SPR)或共振光柵傳感器(resonant grating sensors))的試驗通常以兩步法進行(i)將結(jié)合伴侶之一(通常是蛋白質(zhì))固定在傳感器表面上；和(ii)將配體(藥物、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等)結(jié)合在固定的蛋白質(zhì)上。傳統(tǒng)上，將生物分子偶聯(lián)于表面包括把表面上的羧酸基團活化成反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺((NHS))酯，然后將其偶聯(lián)于感興趣蛋白質(zhì)上的氨基基團。Biacore，AffinityBiosensors和Artificial Sensing Instruments在他們各自的LID平臺上成功應(yīng)用該方法并將其商業(yè)化。雖然該方法很有效，但是活化步驟很耗費時間并且包括處理和使用具有一定毒性的化學(xué)品。
該方法的一種替代方法包括使用“預(yù)活化”化學(xué)物質(zhì)。例如，已采用提供醛基的表面來結(jié)合生物分子。然而，偶聯(lián)之后需要還原步驟來穩(wěn)定產(chǎn)生的希夫堿。也采用了具有環(huán)氧化物和異氰酸酯官能團的表面；然而，環(huán)氧化物基團反應(yīng)相對較慢，因此需要在堿性很強的條件下孵育很長時間，而異氰酸酯基團反應(yīng)性極強，因此帶來了儲存穩(wěn)定性方面的問題。因為這些問題，將預(yù)活化化學(xué)物質(zhì)用于LID平臺的報道很少見到。實際上，提供最流行的LID平臺的三家公司-Biacore、AffinityBiosensors和ASI，提供的傳感器都沒有采用預(yù)活化化學(xué)物質(zhì)(chemistry)。
馬來酸酐易與親核物質(zhì)如氨基發(fā)生反應(yīng)。雖然已描述了用馬來酸酐共聚物層來修飾表面以固定小分子、DNA、糖和肽(1-9)，但由于馬來酸酐的水解穩(wěn)定性很差(10)，它們沒有得到廣泛應(yīng)用。馬來酸酐與疏水側(cè)鏈(例如苯乙烯)共聚可增加馬來酸酐的水解穩(wěn)定性；然而，這會導(dǎo)致生物分子與表面的非特異性結(jié)合的問題。雖然這對于某些應(yīng)用(如質(zhì)譜)而言是一個優(yōu)點，但對于LID來說則是一個問題。
大體而言，對于LID檢測有一個獨特的問題，即要求嚴格的生物特異性。不希望“阻斷劑”(例如牛血清白蛋白，BSA)摻入分析物溶液中，因為特異性(由分析物引起)和非特異性(由阻斷劑引起)結(jié)合均會導(dǎo)致界面折射率的變化，因此不能區(qū)分二者。當采用復(fù)雜的樣品或者分析物不純時，這個問題只會更加嚴重。對于用酸酐固定蛋白質(zhì)的一個憂慮是由于形成殘余負電荷以及聚合物中其它基團(例如苯乙烯、乙烯、甲基乙烯基醚等)的影響而導(dǎo)致的非特異性結(jié)合。因為這些原因，將酸酐聚合物用于LID的可行性也是一種潛在憂慮。這種憂慮以及酸酐基團的潛在穩(wěn)定性問題是現(xiàn)有技術(shù)中還不知道或未描述將酸酐共聚物用于LID的一個原因。本發(fā)明描述了如何成功地將馬來酸酐聚合物用于LID試驗中。通過適當選擇聚合物中的側(cè)鏈和固定條件，這些結(jié)合試驗可具有很高的特異性，同時保持足夠的水解穩(wěn)定性。而且，本發(fā)明公開了可在酸性(pH＜7)條件下將很多生物分子固定在馬來酸酐共聚物表面上，同時相對于更加常規(guī)的肽偶聯(lián)條件(pH7-9)，具有水解穩(wěn)定性增加和蛋白質(zhì)結(jié)合增加量等優(yōu)點。
采用3D基質(zhì)固定可以固定更大量的生物分子，因此提供了更多的結(jié)合位點。水凝膠如羧甲基葡聚糖是最常用的(32-34)。對于水凝膠的一個憂慮是在鄰近表面的水凝膠中大分析物分子與結(jié)合位點的分離。相對于采用熒光顯微鏡等技術(shù)的常規(guī)檢測，由于LID檢測的瞬逝電磁場的指數(shù)性質(zhì)，結(jié)合信號迅速從表面消失。本文描述的聚合物表面不如水凝膠厚，因此，固定發(fā)生在離界面更近的地方，這可防止在后續(xù)的結(jié)合研究中發(fā)生分離。
本文描述了用能夠結(jié)合一種或多種生物分子的一種或多種聚合物涂覆的基材，及其制備和使用方法。使用這種涂覆的基材的方法相對于現(xiàn)有技術(shù)提供了多種優(yōu)點。例如，這種基材不需要活化，從而節(jié)省了用戶的時間、成本并降低了操作的復(fù)雜性。此外，這種涂覆的基材的制備方法允許大規(guī)模制備這種基材。一般，這種涂覆的基材具有穩(wěn)定性，可儲存較長的時間(～6個月)而其結(jié)合能力很少或不喪失。而且，這種涂覆的基材在酸性條件下水解緩慢，這允許在現(xiàn)有聚合物(例如酸酐聚合物)技術(shù)沒有描述過的條件下結(jié)合各種生物分子。
發(fā)明概述本文描述了用于結(jié)合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法。本文所述材料、方法或產(chǎn)品的優(yōu)點將部分描述于下文，或可通過實施下文所述的方面來了解?？衫盟綑?quán)利要求中具體指出的組分(element)及其組合來實現(xiàn)和獲得下文所述優(yōu)點。應(yīng)理解，前文一般性描述和下文詳細描述都是示范性和闡釋性的，并非限制本發(fā)明。
附圖簡述結(jié)合在并組成本說明書一部分的


了以下幾個方面。應(yīng)理解，這些附圖僅描述了本文所述材料、產(chǎn)品和方法的典型實施方式，因此不應(yīng)認為限制了它們的范圍。
圖1示意性顯示了采用馬來酸酐共聚物衍生表面的兩步修飾方法。
圖2顯示了熒光信號(來自Cy3-鏈霉抗生物素蛋白、生物素-胺試驗)分別對兩種不同的馬來酸酐共聚物的水解時間所作的圖。
圖3顯示乙烯-馬來酸酐交替共聚物(EMA)涂覆的載玻片的儲存穩(wěn)定性試驗結(jié)果。數(shù)據(jù)表明EMA在干燥條件下儲存于室溫時至少穩(wěn)定4個月。
圖4A顯示在EMA涂覆的LID微孔板上進行的Corning LID(基于微孔板的、波導(dǎo)共振光柵檢測平臺)試驗(鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合于固定的生物素-胺基團)的結(jié)果。
圖4B顯示SPR試驗結(jié)果，比較在MAMVE或SMA涂覆的金片上的結(jié)合特異性。
圖5顯示在Biacore CM5或EMA涂覆的金片上進行的萬古霉素結(jié)合試驗的結(jié)果，用SPR檢測。
圖6顯示在EMA涂覆的金片上進行的競爭性抑制結(jié)合試驗，用SPR檢測。
圖7顯示在EMA涂覆的微孔板上進行的競爭性抑制結(jié)合試驗，用Corning LID檢測。
圖8顯示固定在EMA上的蛋白質(zhì)相對量分別與6種不同蛋白的固定pH的關(guān)系，在EMA涂覆的微孔板上用Corning LID檢測。
圖9顯示固定在EMA涂覆的微孔板上的蛋白質(zhì)相對量與蛋白濃度的關(guān)系。
圖10顯示在EMA涂覆的LID微孔板上進行的抗體-抗體結(jié)合試驗的結(jié)果。
圖11顯示把熒光素-生物素結(jié)合于EMA涂覆的，提供鏈霉抗生物素蛋白的LID微孔板上的Corning LID檢測。
圖12顯示把生物素結(jié)合于固定在EMA上的鏈霉抗生物素蛋白的Corning LID試驗。
圖13A顯示把藥物洋地黃毒甙(digitoxin)結(jié)合于固定在EMA上的人血清白蛋白的Corning LID試驗。
圖13B顯示洋地黃毒甙系列滴定試驗的結(jié)果。
圖14A顯示把藥物華法林(warfarin)結(jié)合于固定在EMA上的人血清白蛋白的Corning LID試驗。
圖14B顯示陰性對照試驗的結(jié)果，其中華法林被緩沖液空白代替。
圖15顯示對固定在EMA上的人血清白蛋白的藥物結(jié)合試驗的結(jié)果，用表面等離子共振檢測。
圖16顯示SPR試驗，檢測蛋白質(zhì)對馬來酸酐共聚物修飾的、用乙醇胺(EA)和各種葡聚糖阻斷的金表面的非特異性結(jié)合。只有用DEAE-葡聚糖阻斷的表面顯示對蛋白質(zhì)結(jié)合的抗性增強。
圖17顯示SPR試驗，比較抗-IgG對固定有IgG的、用乙醇胺或DEAE葡聚糖阻斷的表面的結(jié)合。該試驗表明DEAE葡聚糖不影響抗-IgG結(jié)合。
發(fā)明詳述在公開和描述本發(fā)明材料、產(chǎn)品和/或方法之前，應(yīng)理解下述各方面不限于具體化合物、合成方法或用途，因為這些當然都可以變化。應(yīng)理解，本文所用術(shù)語只是出于描述具體方面的目的，不意于限制。
在本說明書和所附權(quán)利要求書中，將參考一些術(shù)語，這些術(shù)語具有以下含義在整個說明書中，除非上下文另有說明，術(shù)語“包含”(或“包括”)或其變化形式應(yīng)理解為表示包括所述整數(shù)、或步驟、或整數(shù)或步驟的集合，但不排出任何其它整數(shù)、或步驟、或整數(shù)或步驟的集合。
必須注意，如本說明書和所附權(quán)利要求書所用，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“這個”、“這種”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說明。因此，例如，“一種藥物載體”包括兩種或多種這種載體的混合物，等。
“任選的”或“任選地”表示將要描述的事件或狀況可以發(fā)生或不發(fā)生，該描述包括事件或狀況發(fā)生的情況，以及事件或狀況不發(fā)生的情況。
范圍在本文中可表示為從“約”一個具體數(shù)值，和/或到“約”另一個具體數(shù)值。當表示這樣一個范圍時，另一方面包括從這一個具體數(shù)值和/或到其它具體數(shù)值。類似地，當用前置的“約”將數(shù)值表示為近似值時，應(yīng)理解具體數(shù)值形成另一個方面。還應(yīng)理解，各范圍的端點不僅相對于另一個端點非常重要，而且獨立于另一個端點也非常重要。
除非另有明確的相反說明，某組分的重量百分數(shù)以包含該組分的制劑或組合物的總重量計。
“接觸”指至少一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)通過近的物理接觸而暴露的情況。
公開的化合物、組合物和組分可用于、聯(lián)用于或用于制備本文所述方法的產(chǎn)品和組合物或者它們(本身)是本文所述方法的產(chǎn)品和組合物。本文描述了這些和其它材料，應(yīng)理解，當公開這些材料的組合、亞組、相互作用和類群等但未明確公開這些化合物的具體各個體和組合以及交換排列時，這些都被本文具體考慮并公開。例如，如果公開和描述了很多不同的聚合物和生物分子，除非另有明確說明，則具體考慮了這些聚合物和生物分子的每個和所有的組合和交換排列。因此，如果公開了一類分子A、B和C和一類分子D、E和F并公開了組合分子A-D的例子，那么即使沒有各個都單獨提到，但每個都單獨考慮，也考慮到它們的組合。因此，在該例子中，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F組合中的每一個都被具體考慮，而且應(yīng)認為從A、B和C；D、E和F；以及示例的組合A-D的公開中得到了公開。同樣，這些的任何亞組或作何也被具體考慮并公開。因此，例如亞組A-E、B-F和C-E被具體考慮，而且應(yīng)認為從A、B和C；D、E和F；以及示例的組合A-D的公開中得到了公開。這種概念適用于本發(fā)明的所用方面，包括但不限于，制備和使用本發(fā)明組合物的方法中的步驟。因此，如果可進行多個附加步驟，應(yīng)理解這些附加步驟中的每一個可與本文公開方法的任何具體實施方式
或?qū)嵤┓绞降慕M合一起進行，這些組合中的每一個都被具體考慮并且公開。
I.涂覆的基材本文描述了用于結(jié)合生物分子的、聚合物涂覆的基材。本文的一個方面描述了一種基材，其包括第一連接層(tie layer)和第一聚合物，其中第一聚合物包括可將生物分子結(jié)合到基材的一種或多種官能團，其中連接層連接于基材，所述連接層將所述第一聚合物連接于基材。
在一個方面，連接層連接于基材的外表面。基材的“外表面”是暴露的、可進行操作的基材區(qū)域。例如，可與溶劑或試劑接觸的基材的任何表面都可被認為是基材外表面。本發(fā)明所用基材包括但不限于微孔板或載玻片。在一個方面，當基材是微孔板時，(微孔板上)小孔(well)的數(shù)目和小孔體積將根據(jù)(試驗)分析的規(guī)模和范圍而變化。
在一個方面，基材包括塑料、聚合物或共聚物材料、陶瓷、玻璃、金屬、晶體材料、稀有或半稀有金屬、金屬氧化物或非金屬氧化物、過渡金屬、或它們的任意組合。此外，可構(gòu)造基材使其可置于任何檢測裝置中。在本發(fā)明一方面，傳感器可結(jié)合到基材底部/下面，并用于后續(xù)檢測。這些傳感器可包括但不限于，光柵、棱鏡、電極和石英晶體微量天平。檢測方法可包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、折射率、質(zhì)量、和電化學(xué)檢測。在本發(fā)明一方面，基材是Corning LID微孔板。
本文描述的基材具有連接于基材的連接層。本文所用術(shù)語“連接”指兩種組分或化合物之間的任何化學(xué)相互作用。當?shù)谝贿B接層化合物連接于基材時可進行的化學(xué)相互作用的類型根據(jù)基材的材料和用于制備第一連接層的化合物而變化。在本發(fā)明一個方面，第一連接層可共價和/或靜電連接于基材。在一方面，當?shù)谝贿B接層靜電連接于基材時，用于制備第一連接層的化合物帶正電荷的，處理基材的外表面使其存在凈負電荷，從而第一連接層化合物和基材外表面形成靜電結(jié)合。在一方面，第一連接層化合物可與基材外表面形成共價鍵。例如，可衍生基材的外表面，從而使其存在能夠與第一連接層化合物形成共價鍵的基團。
在一個方面，第一連接層衍生自包含一種或多種反應(yīng)性官能團的化合物。與第一連接層有關(guān)的短語“衍生自”本文中定義為當?shù)谝贿B接層化合物連接于基材時產(chǎn)生的殘基或片段。這些官能團允許第一聚合物連接于第一連接層。在一個方面，第一連接層化合物的官能團包括氨基、巰基、羥基、羧基、丙烯酸、有機或無機酸、酯、酸酐、醛、環(huán)氧化物，它們的衍生物或鹽，或它們的組合。在一個方面，第一連接層衍生自直鏈或支鏈氨基硅烷、氨基烷氧基硅烷、氨基烷基硅烷、氨基芳基硅烷、氨基芳氧基硅烷，或它們的衍生物或鹽。另一方面，第一連接層衍生自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N’-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基甲氧基硅烷、或氨基丙基倍半硅氧烷。另一方面，第一連接層衍生自多胺如聚-賴氨酸或聚乙烯亞胺。
另一方面，第一連接層包括自組裝單層(SAM)。在本發(fā)明一方面，當基材表面由金組成時，SAM包含末端為胺的烷基硫醇(amine-terminated alkanethiol)。在本發(fā)明這一方面，自組裝單層包含11-巰基十一烷胺。
包含一種或多種可將生物分子結(jié)合于基材的官能團的第一聚合物連接于第一連接層。第一聚合物上或本文所述的任何聚合物上的“官能團”允許第一聚合物連接于第一連接層或生物分子。類似地，第一或第二連接層上存在的官能團允許第一聚合物或第二聚合物分別連接于第一或第二連接層。第一聚合物或后續(xù)的聚合物可具有一種或多種不同官能團。也可預(yù)料的是一些第一聚合物除連接于第一連接層外還可連接于基材的外表面?；蛘撸谝痪酆衔锟膳c基材外表面接觸，并仍然連接于第一連接層。在本發(fā)明一方面，第一聚合物可共價和/或靜電連接于第一連接層。兩種或多種不同的第一聚合物連接于第一連接層也是預(yù)料之中的。
第一聚合物可以是水溶性的或非水溶性的，這取決于將第一聚合物連接于第一連接層所用的技術(shù)。第一聚合物可以是線性或非線性的。例如，當?shù)谝痪酆衔锸欠蔷€性時，第一聚合物是樹枝狀聚合物。第一聚合物可以是均聚物或共聚物。
在本發(fā)明一方面，第一聚合物包含至少一種易于被親核攻擊的親電子基團。不限于任何理論，當?shù)谝贿B接層具有可與聚合物的親電子基團形成共價鍵的親核基團時，在第一聚合物上產(chǎn)生負電荷。然后第一聚合物層的負電荷可幫助在第一聚合物和生物分子、第二連接層或第二聚合物之間形成靜電結(jié)合，這些下文都將討論?；蛘?，第一聚合物層上存在的一種或多種親電子基團可與生物分子、第二連接層化合物或第二聚合物形成共價鍵。當生物分子連接于第一聚合物時，聚合物中存在特定的側(cè)鏈(如乙二醇)可幫助防止生物分子非特異性結(jié)合于第一聚合物。
在本發(fā)明一方面，第一聚合物包含至少一種胺反應(yīng)性基團。術(shù)語“胺反應(yīng)性基團”指可與胺基團發(fā)生反應(yīng)形成新共價鍵的任何基團。胺可以是伯胺、仲胺和叔胺。在本發(fā)明一方面，胺反應(yīng)性基團包括酯基、環(huán)氧化物基團或醛基。另一方面，胺反應(yīng)性基團是酸酐基團。
在本發(fā)明一方面，第一聚合物包含衍生自馬來酸酐和第一單體的共聚物。在這一方面，第一聚合物中馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量(即摩爾量)的5％-50％、5％-45％、5％-40％、5％-35％、5％-30％、5％-25％、10％-50％、15％-50％、20％-50％、25％-50％或30％-50％。在本發(fā)明一方面，所選的第一單體提高了第一聚合物中馬來酸酐的穩(wěn)定性。另一方面，第一單體減少了生物分子與基材的非特異性結(jié)合。在另一方面，第一聚合物中馬來酸酐的量約是第一單體化學(xué)計算量的50％。另一方面，第一單體包括苯乙烯、十四烯、十八烯、甲基乙烯基醚、三甘醇甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、二乙烯基苯、乙烯、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、吡咯烷酮、可聚合的寡(乙二醇)或寡(環(huán)氧乙烷)，或它們的組合。
在本發(fā)明一方面，第一聚合物包括聚(乙酸乙烯酯-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)、異丁烯-馬來酸酐交替共聚物、馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物、馬來酸酐-1-十四烯交替共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物、聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)，或它們的組合。另一方面，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
連接于第一連接層的第一聚合物的量可根據(jù)所選的第一連接層、第一聚合物和基材的預(yù)期用途而變化。在本發(fā)明一方面，第一聚合物包括至少一個單層。另一方面，第一聚合物的厚度約為10-2,000。另一方面，第一聚合物厚度的下限是10、20、40、60、80、100、150、200、300、400或500，上限是750、1,000、1,250、1,500、1,750或2,000，其中任意下限可與任意上限組合以形成厚度范圍。
在本發(fā)明一方面，第一連接層是氨基丙基倍半硅氧烷，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
在本發(fā)明另一方面，基材還包括第二連接層和第二聚合物，其中第二連接層連接于第一聚合物，第二聚合物連接于第二連接層。上述的任何第一連接層化合物可用作第二連接層化合物。第二連接層與第一聚合物連接的性質(zhì)、第二聚合物與第二連接層連接的性質(zhì)將根據(jù)所選的材料而變化。第二連接層可共價或靜電連接于第一聚合物。或者，第二聚合物可共價或靜電連接于第二連接層。在本發(fā)明一方面，第二連接層共價連接于第一聚合物，第二聚合物共價連接于第二連接層。一旦第一聚合物連接于第一連接層，考慮可將多個連接層和聚合物層施加于第一聚合物。
可由相同或不同的化合物制備第一和第二連接層。類似地，第一和第二聚合物也可以相同或不同。取決于基材的預(yù)期用途，也考慮將多個連接層和聚合物層連接于第一聚合物。
在本發(fā)明一方面，第二連接層衍生自多胺或多元醇。例如，第二連接層可以是乙二胺、乙二醇、或寡聚乙二醇二胺(oligoethylene glycol diamine)。另一方面，第二連接層衍生自二胺、三胺或四胺。
上述的任何第一聚合物可用作第二聚合物。在本發(fā)明一方面，第二聚合物包含至少一種胺反應(yīng)性基團，例如酯基、環(huán)氧化物基團、醛基或酸酐基團。另一方面，第二聚合物包含聚馬來酸酐或衍生自馬來酸酐的共聚物。
在連接第一聚合物(或后續(xù)聚合物層)之前或之后，可任選地將連接劑(linker)連接到第一聚合物(或后續(xù)聚合物層)。術(shù)語“連接劑”是指可被連接到聚合物層并具有至少一種可與另一種分子例如生物分子配位或結(jié)合的基團的任何化合物。配位的機制可以是例如通過Lewis酸/堿相互作用、Bronsted酸/堿相互作用、離子鍵、共價鍵或靜電相互作用。在本發(fā)明一方面，連接劑可具有與生物分子中存在的親和標簽(affinity tag)(例如六組氨酸標簽)配位的配體。例如，連接劑可以是與金屬離子(例如Cu、Co、Ni)結(jié)合、耦合或配位以捕獲帶有組氨酸標簽的蛋白質(zhì)的配體。在本發(fā)明一方面，連接劑包括N-(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨基二乙酸。或者，連接劑可具有與生物分子形成氫鍵的基團。在本發(fā)明另一方面，連接劑可以是識別抗原的抗體。另一方面，連接劑可以是用于捕獲生物素化化合物的鏈霉抗生物素蛋白。在本發(fā)明另一方面，連接劑可含有巰基或二硫基，用于通過二硫鍵交換反應(yīng)(disulfide exchange reactions)來捕獲生物分子?；蛘撸B接劑可含有與巰基反應(yīng)的基團(例如，馬來酰亞胺基團)，用于通過巰基例如半胱氨酸來結(jié)合蛋白質(zhì)。在本發(fā)明另一方面，連接劑可具有促進細胞粘合/結(jié)合的基團，例如肽序列RGD。連接劑可通過任何化學(xué)相互作用例如共價鍵或靜電相互作用連接于聚合物層。
考慮可將一種或多種生物分子連接于基材以制備多個生物傳感器。在本發(fā)明一方面，生物分子可共價或靜電連接于第一聚合物(或后續(xù)聚合物層)。生物分子可通過共價或非共價結(jié)合顯示對另一種分子的特異性親和性?？捎糜诒景l(fā)明的生物分子的例子包括但不限于，天然或合成的寡核苷酸、天然或修飾/阻抑的核苷酸/核苷、核苷酸(DNA)或(RNA)、包含天然或修飾/阻抑的氨基酸的肽、抗體、半抗原、生物配體、膜蛋白、脂膜、藥學(xué)小分子例如藥物或細胞。
在本發(fā)明一方面，生物分子可以是蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)可包括肽、蛋白質(zhì)或肽的片段、膜結(jié)合蛋白或核蛋白。蛋白質(zhì)可以是任何長度，可包括一種或多種氨基酸或其變體。蛋白質(zhì)可以是片段化的，例如在分析之前通過蛋白酶消化使其片段化。待分析的蛋白質(zhì)樣品也可進行分級或分離以降低樣品復(fù)雜性。也在同一試驗中采用片段化和分級。片段化和分級可簡化和擴大蛋白質(zhì)分析。
本發(fā)明一方面，在生物分子連接于聚合物層之后和進行配體結(jié)合試驗之前，可阻斷(block)聚合物表面上的殘留帶電基團以最大限度減少因靜電相互作用而產(chǎn)生的表面和配體之間的非特異性結(jié)合相互作用。本文所用術(shù)語“配體”指與固定的生物分子或化合物相互作用或結(jié)合的任何游離生物分子(例如蛋白質(zhì)、肽、DNA、RNA、病毒、細菌、細胞)或化合物(例如藥物、小分子等)。未充分阻斷可導(dǎo)致配體的高水平非特異性結(jié)合，使結(jié)果難以分析。在本發(fā)明一方面，通過使聚合物層的表面接觸本身具有良好的非特異性結(jié)合性質(zhì)的帶電聚合物或化合物，從而將阻斷劑結(jié)合于聚合物層。帶電荷的化合物使帶相反電荷的基材表面改變電荷性質(zhì)(negate)。換句話說，它抵消或屏蔽了基材的影響。在本發(fā)明一方面，帶有正電荷的化合物，例如葡聚糖(例如DEAE葡聚糖)，可降低蛋白質(zhì)與帶負電的、酸酐修飾的表面的非特異性結(jié)合。
II.制備涂覆的基材的方法描述了制備基材的方法，該方法包括(1)將第一連接層化合物連接于基材，和(2)將第一聚合物連接于第一連接層化合物。該方法考慮將第一連接層連接于基材、然后將第一聚合物連接于第一連接層的順序連接。或者，考慮將第一聚合物連接于第一連接層，然后將第一連接層/第一聚合物連接于基材。
可用本領(lǐng)域已知技術(shù)將第一連接層和第一聚合物連接于基材。例如，可將基材浸在第一連接層化合物或第一聚合物的溶液中。另一方面，可將第一連接層化合物或第一聚合物噴涂、氣相沉積、絲網(wǎng)印刷或機器人插腳印刷(robotically pin printed)、或模壓(stamped)在基材上。這可在完全組裝好的基材上或底部插入物(例如，將底部插入物連接到多孔板以形成微孔板之前)上進行。第一聚合物層(以及后續(xù)聚合物層)的厚度可根據(jù)基材的預(yù)期用途而變化。因此，可采用不同的技術(shù)來改變聚合物層厚度。
第一聚合物連接到第一連接層后，采用類似的技術(shù)，將第二連接層化合物連接到第一聚合物，然后將第二聚合物連接到第二連接層化合物。與上述類似，可用本領(lǐng)域已知技術(shù)順序或同時將第二連接層和第二聚合物連接于第一聚合物。在本發(fā)明另一方面，可用上述技術(shù)將連接劑或阻斷劑連接于第一聚合物(或后續(xù)聚合物層)。
一旦將第一聚合物或后續(xù)聚合物層連接到基材，可用上述技術(shù)將一種或多種生物分子連接到聚合物層。將生物分子連接到聚合物的反應(yīng)動力學(xué)通常很快。在本發(fā)明一方面，生物分子在約1小時、30分鐘或15分鐘內(nèi)以足夠的量結(jié)合于基材。
可結(jié)合于聚合物層的生物分子的量可根據(jù)例如生物分子的大小和等電點而變化。由于涂覆的基材的水解穩(wěn)定性，生物分子可在很多條件下連接于聚合物層，這對于其它基材是不可能實現(xiàn)的。例如，本文描述的涂覆的基材可在酸性條件下結(jié)合多種蛋白質(zhì)。在本發(fā)明一方面，生物分子在低于其等電點約0.5-1個pH單位的pH條件下連接于第一聚合物。
III.使用方法描述了進行生物活性試劑試驗的方法，該方法包括(1)將配體與包含第一連接層、第一聚合物和生物分子的基材接觸，其中第一連接層將第一聚合物連接于基材，生物分子連接于第一聚合物，其中配體在所述接觸步驟之后結(jié)合于生物分子，和(2)檢測結(jié)合的配體。
連接有一種或多種生物分子的上述任何基材均可用于結(jié)合配體并最終檢測結(jié)合的配體。配體與基材的結(jié)合包括生物分子和配體間的化學(xué)相互作用；然而，有可能在聚合物層和配體間發(fā)生一定程度的相互作用。生物分子和配體間相互作用的性質(zhì)根據(jù)所選的生物分子和配體而變化。在本發(fā)明一方面，生物分子和配體間的相互作用可導(dǎo)致形成靜電結(jié)合、氫鍵、疏水鍵和共價鍵。另一方面，靜電相互作用可在生物分子和配體間發(fā)生。
配體可以是任何天然存在或合成的化合物?？山Y(jié)合于基材上的生物分子的配體的例子包括但不限于藥物、寡核苷酸、核酸、蛋白質(zhì)、肽、抗體、抗原、半抗原或小分子(例如藥物)。對于本文所述方法，上述任何生物分子都可作為配體。在本發(fā)明一方面，制備一種或多種配體的溶液，將其加入具有連接到微孔板外表面的生物分子的一個或多個孔中。在該方面，考慮不同生物分子可連接到微孔板的不同孔中；因此，可檢測不同生物分子和配體之間很多不同的相互作用。在本發(fā)明一方面，可將某種蛋白固定到微孔板上，研究該蛋白和第二種蛋白或小分子之間的相互作用。或者，可用本文描述的技術(shù)將小分子固定到微孔板上，研究該小分子和第二種小分子或蛋白的相互作用。在本發(fā)明一方面，當基材是微孔板時，本發(fā)明試驗可以是高通量試驗。
一旦將配體結(jié)合到基材上的生物分子，即可檢測結(jié)合的配體。本文所述檢測的優(yōu)點之一是減少了配體的非特異性結(jié)合。
在本發(fā)明一方面，標記結(jié)合的配體，以便進行檢測。根據(jù)所用的檢測技術(shù)，在本發(fā)明一方面，可在檢測之前用可檢測的示蹤物標記配體。配體和可檢測示蹤物之間的相互作用可包括任何化學(xué)或物理相互作用，包括但不限于，共價鍵、離子相互作用或Lewis酸-Lewis堿相互作用。本文所述“可檢測的示蹤物”定義為具有以下性質(zhì)的任意化合物(1)具有可與上述配體相互作用的至少一個基團，和(2)具有可用本領(lǐng)域已知技術(shù)檢測的至少一個基團。在本發(fā)明一方面，可在固定前標記配體。另一方面，可在配體固定之后進行標記?？蓹z測示蹤物的例子包括但不限于熒光示蹤物和酶類示蹤物。
另一方面，可用其它技術(shù)完成結(jié)合的配體的檢測，這些技術(shù)包括但不限于，熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、拉曼光譜、光學(xué)散射分析、質(zhì)譜等，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員一般所知的其它技術(shù)。
在本發(fā)明一方面，用不依賴于標記的檢測或LID來檢測固定的配體。LID的例子包括但不限于表面等離子共振或共振波導(dǎo)光柵(例如Corning LID系統(tǒng))。在現(xiàn)有技術(shù)中，用于LID試驗的基材有限制性。采用無標記檢測平臺的試驗通常以兩步法進行(i)將結(jié)合伴侶之一(通常是蛋白質(zhì))固定在傳感器表面上；和(ii)將配體(藥物、蛋白質(zhì)、寡核苷酸等)結(jié)合在固定的蛋白質(zhì)上。傳統(tǒng)上，將生物分子偶聯(lián)于表面包括表面上的羧酸基團活化成反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺((NHS))酯，然后將其偶聯(lián)于感興趣蛋白質(zhì)上的氨基基團。Biacore，Affinity Biosensors和Artificial Sensing Instruments已在他們各自的LID平臺上成功應(yīng)用該方法并將其商業(yè)化。雖然該方法很有效，但是活化步驟很耗費時間并且包括處理和使用具有一定毒性的化學(xué)品。該方法的一種替代方法包括使用“預(yù)活化”化學(xué)物質(zhì)。例如，已采用提供醛基的表面來結(jié)合生物分子。然而，偶聯(lián)之后需要還原步驟來穩(wěn)定產(chǎn)生的希夫堿。也采用了具有環(huán)氧化物和異氰酸酯官能團的表面；然而，環(huán)氧化物基團反應(yīng)相對較慢，因此需要在堿性很強的條件下孵育很長時間，而異氰酸酯基團反應(yīng)性極強，因此帶來了儲存穩(wěn)定性方面的問題。本文所述涂覆的基材解決了現(xiàn)有LID平臺技術(shù)的限制性。
實施例公開以下的實施例以為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供關(guān)于如何制備和評價本文描述和要求保護的材料、產(chǎn)品和方法的完整公開和描述，這些實施例只是出于示范性目的，不意于限制本發(fā)明范圍。已努力確保數(shù)值(例如數(shù)量、溫度等)的準確性，但也可能出現(xiàn)一些失誤和偏差。除非另有說明，份數(shù)指重量份數(shù)，溫度是℃或室溫，壓力是大氣壓或接近大氣壓。反應(yīng)條件有很多變化和組合，所述反應(yīng)條件例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和可用于優(yōu)化從上述方法所得到的產(chǎn)品純度和產(chǎn)率的其它反應(yīng)范圍和條件。優(yōu)化這些反應(yīng)條件只需要合理和常規(guī)的試驗。
A.制備涂覆的基材采用圖1所示并在下文詳細描述的兩步修飾方法用馬來酸酐共聚物修飾表面(包括玻璃、無機氧化物和金)。
無機氧化物上的EMA材料裸露的玻璃載玻片或Corning GAPS載玻片氨基丙基倍半硅氧烷(“APS”)(Gelest商品目錄#WSA-9911)乙烯-馬來酸酐交替共聚物(“EMA”)(Aldrich 商品 目錄#18，805-0)
N-甲基吡咯烷酮(NMP)異丙醇(IPA)(低水含量)無水乙醇50mL科普林玻璃玻片染色缸方法(如果采用Corning GAPS載玻片，省略步驟1-2。)1.在O2等離子室中處理裸露的玻璃載玻片5分鐘(1T，250Watts)以進行清潔；或者，在UV臭氧室中處理載玻片3分鐘。
2.在50mL科普林玻片染色缸中，將載玻片與5％(體積/體積)氨基丙基倍半硅氧烷的水溶液反應(yīng)10分鐘；用水清洗載玻片，然后用乙醇清洗，用氮氣干燥。
3.在50mL科普林玻璃玻片染色缸中，將載玻片與用10％NMP∶90％IPA配制的1mg/mL EMA反應(yīng)10分鐘。將EMA以10mg/mL溶解在100％NMP中，然后用IPA稀釋10x；(進行稀釋時，重要的是將NMP加入IPA，否則會形成沉淀)。10分鐘后，用乙醇洗滌表面，用氮氣干燥。
4.室溫下將載玻片儲存在干燥器(dessicator)中直至使用。
金上的EMA材料Biacore裸露的Au傳感器芯片11-巰基十一烷胺(Dojindo)乙烯-馬來酸酐交替共聚物(“EMA”)(Aldrich 商品 目錄# 18，805-0)N-甲基吡咯烷酮(NMP)異丙醇(IPA)(低水含量)二甲基亞砜(DMSO)無水乙醇方法1.用乙醇和水清洗以清潔裸露的金片；氮氣流中干燥。
2.在11-巰基十一烷胺的1mM乙醇溶液中浸泡該金片1小時；用乙醇和水清洗金片；氮氣流中干燥。
3.將金片與用10％NMP∶90％IPA或100％DMSO配制的1mg/mL EMA溶液反應(yīng)10分鐘。10分鐘后，用乙醇清洗金片并用氮氣干燥。
聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)(“PEG-MA”)的合成通過馬來酸酐和三甘醇甲基乙烯基醚的自由基聚合反應(yīng)合成聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)(“PEG-MA”)。在50mL圓底燒瓶中加入1.018mL三甘醇甲基乙烯基醚、520mg馬來酸酐、3mg AIBN和7mL甲苯。該混合物在63℃反應(yīng)過夜。在醚中沉淀以分離聚合物。FTIR分析證實反應(yīng)是成功的。將提供胺的表面(例如用11-巰基十一烷胺衍生的金片或用氨基丙基倍半硅氧烷修飾的玻璃/硅)浸在以含有0.1％(體積/體積)三乙基胺的甲基乙基酮配制的10mg/mL PEG-MA聚合物溶液中30-60分鐘，以用PEG-MA修飾提供胺的表面。
芯片用甲基乙基酮和乙醇清洗，氮氣流中干燥。
B.馬來酸酐共聚物表面的表征金上的橢圓對稱法(Ellipsometry).采用橢圓對稱法來表征馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物(MAMVE)與金上提供胺的自組裝單層(SAM)的連接以及含有胺的分子與反應(yīng)性表面的后續(xù)連接。與MAMVE反應(yīng)后提供不同官能團的SAM的厚度增加列于下表(表1)。在所測試的表面中，僅提供胺基團的SAM顯示出厚度增加。如果固定聚合物時聚合物的主鏈與表面平行，預(yù)期厚度增加為～6-7，這與觀察到的厚度增加一致。假設(shè)聚合物單層與SAM共軛以形成蜂巢狀結(jié)構(gòu)。
表1.不同SAM與MAMVE反應(yīng)后及后續(xù)與十一胺(UA)反應(yīng)后厚度的橢圓對稱增加(Δd)。

a-8個樣品的平均值b-3個樣品的平均值為了研究酸酐修飾的表面上發(fā)生偶聯(lián)的數(shù)量，將基材浸在十一胺(“UA”，10mM)的DMSO溶液中1.5小時。UA衍生后，表面的厚度增加了～5(表1)。十一胺的整個(packed)單層將產(chǎn)生～17的橢圓對稱厚度；因此，觀察到的厚度增加對應(yīng)于～30％的表面覆蓋。
為了確定MAMVE與胺-SAM的連接是共價連接還是靜電連接，進行試驗以檢測觀察到的厚度增加是否可逆。不可逆的厚度增加表明是共價連接；反之，可逆的厚度增加表明是非共價連接?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用酸性緩沖液(pH3)洗滌之后基材厚度沒有減小。在另一個試驗中，在銨溶液中攪拌過夜使MAMVE水解。該水解的聚合物吸附到提供胺的SAM上使厚度增加～8.6。這種吸附可能是由于帶負電荷的聚合物和帶正電荷的表面間的靜電相互作用。然而，與十一胺反應(yīng)后厚度沒有增加。而且，將該表面浸在酸性緩沖液(pH3)中導(dǎo)致厚度大幅減小。在該pH條件下，水解的聚合物的羧酸根基團被質(zhì)子化，形成了羧酸基團，這將大大減小聚合物對表面的親和力從而導(dǎo)致解吸附。
無機氧化物上的橢圓對稱法.采用橢圓對稱法來表征乙烯-馬來酸酐交替共聚物(EMA)與用不同無機氧化物涂覆的硅晶片的連接。在連接EMA前，如上文A節(jié)所述用氨基丙基倍半硅氧烷(APS)連接層修飾基材。表2總結(jié)了這些試驗的結(jié)果，顯示沉積到SiO2上的EMA大大多于沉積到其它基材上的EMA。數(shù)據(jù)分析表明，EMA層的厚度隨APS連接層的厚度(數(shù)量)而變化，SiO2具有最厚的APS層。在無APS的SiO2表面上進行的對照試驗顯示沒有橢圓對稱厚度的增加，表明在無粘結(jié)層時EMA不粘附到表面上。注意，在這些試驗中僅用了一組條件(針對SiO2優(yōu)化)來涂覆所有基材；沒有嘗試在其它基材上增加APS厚度。用于沉積EMA的溶劑的性質(zhì)對EMA層的厚度有影響。具體地說，采用NMP/IPA混合溶劑產(chǎn)生的EMA層厚度是從DMSO沉積的EMA層厚度的兩倍(見表3)。對用這兩種溶劑系統(tǒng)制備的樣品進行有力的(在DMSO中浸沒16小時)洗滌。如表4所示，觀察到從DMSO制備的樣品橢圓對稱厚度基本沒有改變，提示EMA共價連接于表面。用NMP/IPA制備的樣品觀察到厚度損失～30％。采用NMP/IPA溶劑時，沒有APS層時一些EMA也結(jié)合到基材上(見表3)。然而，長時間浸在DMSO中去除了這些物質(zhì)。
表2.不同基材與APS反應(yīng)、然后和EMA反應(yīng)后厚度的橢圓對稱增加(Δd)。

表3.SiO2基材與不同溶劑中的EMA反應(yīng)后膜厚度的橢圓對稱增加(Δd)。

表4.從不同溶劑中沉積到SiO2上的EMA膜在DMSO中浸沒16小時后的橢圓對稱厚度(Δd)。

水解穩(wěn)定性.進行了一系列試驗來評價不同馬來酸酐共聚物薄膜的水解穩(wěn)定性。用以下聚合物之一衍生Corning GAPS載玻片EMA、馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物(“OMA”)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)(“SMA”)、MAMVE或聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)(“PEG-MA”)。12孔的墊圈固定到載玻片上，各孔孵育(incubate)緩沖溶液(pH7.4)不同的時間。然后進行一個簡單的熒光結(jié)合試驗，其中先將生物素-peo-胺(biotin-peo-amine)固定到表面上，然后與Cy3-鏈霉抗生素蛋白溶液一起孵育。反應(yīng)性馬來酸酐基團的大量水解都將反映為熒光信號(作為孵育時間的函數(shù))的系統(tǒng)性減少。假設(shè)為一級水解反應(yīng)，則ln(熒光信號)vs.孵育時間的圖將產(chǎn)生直線，斜率等于速率常數(shù)的負倒數(shù)。圖2顯示了EMA和SMA薄膜的代表性圖，表5總結(jié)了觀察到的所測試各馬來酸酐共聚物的半衰期。數(shù)據(jù)表明側(cè)鏈的性質(zhì)影響馬來酸酐的水解穩(wěn)定性。例如，相對于EMA，具有疏水性苯乙烯側(cè)鏈的SMA的半衰期要長得多。具有疏水性十八烯側(cè)鏈的OMA與SMA的水解穩(wěn)定性不同這一事實提示，空間位阻和/或聚合物重復(fù)單元的性質(zhì)(交替vs阻斷)可能也在共聚物的水解穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。
表5.觀察到的不同馬來酸酐共聚物薄膜的半衰期，用熒光結(jié)合試驗測定

a-pH7.4在第二系列的試驗中，對EMA膜進行了掠射角FTIR檢測，以直接和更定量地監(jiān)測作為pH值函數(shù)的EMA水解穩(wěn)定性。具體地說，采用作為時間函數(shù)的馬來酸酐羰基譜帶的減少來測定水解半衰期。用配有Harrick Seagull掠射角配件的Nicolet Nexus 470 FTIR分光光度計在低-e玻璃顯微鏡載玻片(KevleyTechnologies)上進行檢測。表6顯示了這些試驗的結(jié)果。注意，EMA在pH5時的半衰期顯著長于pH7.4和9.2時的半衰期。比較表5和6中pH7.4時EMA獲得的結(jié)果表明熒光數(shù)據(jù)和FTIR數(shù)據(jù)的一致性較好。
表6.不同pH值時EMA薄膜的半衰期，用掠射角FTIR測定

a-緩沖液是15mM乙酸鹽(pH5)、磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)、100mM硼酸鹽(pH9.2)。
還采用掠射角FTIR來監(jiān)測作為相對濕度函數(shù)的EMA薄膜水解穩(wěn)定性。這些試驗表明，EMA薄膜在100％相對濕度(23℃)時的半衰期約為6小時；預(yù)期在更通常的環(huán)境條件(～65％相對濕度)下，半衰期將會更長。
儲存穩(wěn)定性.在4個月時間里評價GAPS載玻片上EMA薄膜的儲存穩(wěn)定性。制備了一套EMA載玻片，干燥儲存于室溫。評價了作為儲存時間函數(shù)的熒光試驗的結(jié)果。該試驗由以下步驟組成將生物素-peo-胺固定在系列稀釋液(200nM-5mM)中，然后與固定(100nM)濃度的Cy3-鏈霉抗生素蛋白一起孵育。反應(yīng)性馬來酸酐基團的大量水解都將反映為熒光信號(作為儲存時間的函數(shù))的系統(tǒng)性減少。這些試驗結(jié)果(見圖3)的分析表明，在4個月測試時間內(nèi)，熒光信號沒有顯著減少，表明所用的相對簡單的儲存條件是有效的。
C.結(jié)合試驗進行了一系列試驗來證明用馬來酸酐共聚物修飾的表面可用于無標記結(jié)合試驗。這些試驗利用Biacore表面等離子共振(SPR)或Corning LID檢測。
小分子/蛋白質(zhì)用生物素/鏈霉抗生物素蛋白模型系統(tǒng)和Corning LID檢測(系統(tǒng))測試EMA在小分子/蛋白質(zhì)結(jié)合試驗中的表現(xiàn)。通過將各孔與硼酸鹽緩沖液(150mM，pH9)配制的75uL 10uM生物素-peo-胺溶液一起孵育30分鐘，將生物素固定在Corning LID微孔板的A-G行；第H行與乙醇胺(200mM，以硼酸鹽緩沖液配制，pH9)反應(yīng)，作為陰性對照。將微孔板放入LID設(shè)備中，監(jiān)測作為時間函數(shù)的鏈霉抗生物素蛋白(100nM，以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配制)的結(jié)合，如圖4A所示。6個孔觀察到465pm的平均響應(yīng)，標準偏差約為3％。數(shù)據(jù)分析表明，鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合是特異性的，因為在乙醇胺衍生的孔(第H行)中未觀察到結(jié)合。
也檢測了固定在兩種不同馬來酸酐共聚物MAMVE和苯乙烯-馬來酸酐(SMA)上的配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合。這些試驗中采用Biacore SPR檢測系統(tǒng)，其中將5-(生物素氨基)戊基胺溶液注射在各表面上以將生物素固定于表面。然后將鏈霉抗生物素蛋白溶液(1mM)或BSA(作為對照測試特異性)注射到表面上。圖4B顯示了鏈霉抗生物素蛋白和BSA與固定在MAMVE和SMA上的生物素基團結(jié)合的數(shù)量。數(shù)據(jù)顯示，鏈霉抗生物素蛋白與固定在MAMVE上的生物素基團的結(jié)合是特異性的。這些數(shù)據(jù)還表明，提供苯乙烯側(cè)鏈的表面上非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)顯著大于提供甲基醚的表面。也很好地記錄了蛋白質(zhì)與例如遞呈疏水芳族基團的表面的非特異性結(jié)合；還觀察到提供-OCH3基團的表面對非特異性吸附的惰性(13)。
小分子/小分子為了證明馬來酸酐共聚物可用于監(jiān)測小分子/小分子相互作用，在馬來酸酐修飾的、提供肽序列Lys-D-Ala-D-Ala的表面上評價了藥物萬古霉素(1486Da)的特異性結(jié)合和競爭性抑制。(萬古霉素是一種抗生素，其結(jié)合革蘭氏陽性細菌細胞壁前體C-末端的D-Ala-D-Ala基團并抑制細胞壁合成。)用EMA或聚(三甘醇-共-馬來酸酐)(“PEG-MA”)修飾的金傳感器芯片在Biacore 2000 SPR設(shè)備上進行試驗；為進行比較，也在Biacore’s CM5表面進行試驗。圖5顯示了萬古霉素分別結(jié)合于固定在CM5和EMA上的Lys-D-Ala-D-Ala的傳感圖(sensorgram)。該圖中可看出，結(jié)合量是劑量依賴性的；數(shù)據(jù)的Scatchard分析表明觀察到的Kd值分別為0.28mM和0.34mM(見表7)。這些結(jié)果與文獻(12)中報道的在溶液中測定的這些化合物約～1mM的Kd值類似。
表7.在三種不同表面上進行的萬古霉素結(jié)合試驗小結(jié)，用SPR檢測

a檢測5μM萬古霉素檢測b萬古霉素濃度為10μM、5μM、2.5μM、1.25μM，用Scatchard分析得出的結(jié)果c檢測5uM萬古霉素+500μM DADAd在Biacore外固定Lys-D-Ala-D-Ala為了測試相互作用的特異性，進行競爭性結(jié)合試驗，其中在濃度不同的肽Lys-D-Ala-D-Ala存在下用固定(5μM)濃度的萬古霉素孵育表面。如圖6所示，通過加入肽，抑制了萬古霉素劑量依賴性的結(jié)合，這提示萬古霉素的結(jié)合是特異性的。測試的兩種馬來酸酐共聚物表面均顯示結(jié)合特異性＞90％。該試驗中，PEG-MA上的非特異性結(jié)合的量相對于EMA約低2倍；該觀察結(jié)果與已證明的寡(乙二醇)基團可有效抑制蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合這一事實(13)是一致的。在EMA涂覆的Corning LID微孔板上進行了類似的競爭性抑制試驗(見圖7)。這些研究表明，在過量(250uM)Lys-D-Ala-D-Ala存在下，萬古霉素結(jié)合信號降低83％。
蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)在Corning LID平臺上進行試驗以證明不同大小和等電點(pI)的蛋白質(zhì)可固定在EMA上。共測試了7種不同蛋白質(zhì)(溶菌酶、胰凝乳蛋白酶原、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、肌紅蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和人IgG)(見表8)。圖8顯示了作為緩沖液pH值函數(shù)作圖的結(jié)合蛋白的相對量(表示為共振信號的pm改變(shift))。雖然在幾個不同pH值下獲得了良好的固定水平，但用pH低于蛋白pI～0.5-1個pH單位的固定緩沖液獲得了較高的固定水平。該觀察與蛋白(低于pI，帶正電)強烈結(jié)合表面(由于馬來酸酐水解產(chǎn)生的羧酸基團的存在而帶負電)從而增強偶聯(lián)效率時有效的靜電濃度一致。
表8.固定在EMA上的蛋白質(zhì)性質(zhì)

也進行了采用EMA涂覆的微孔板的Corning LID試驗，以研究蛋白質(zhì)濃度對固定蛋白質(zhì)量的影響。選擇用于該研究的蛋白質(zhì)是HSA和IgG。在pH優(yōu)化為最大結(jié)合的緩沖液中測試了0-128mg/mL的濃度。允許結(jié)合15分鐘，然后用緩沖液洗滌，與硼酸鹽緩沖液(150mM，pH9)配制的200mM乙醇胺孵育5分鐘。該乙醇胺洗滌步驟是用于i)使任何殘余的反應(yīng)性馬來酸酐基團失活；ii)從表面上除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。圖9顯示了作為濃度函數(shù)的HSA和IgG固定的代表性數(shù)據(jù)。在濃度≥～30ug/mL時達到飽和覆蓋。與HSA或IgG孵育前用乙醇胺阻斷的對照孔顯示低水平結(jié)合，提示蛋白質(zhì)與EMA的結(jié)合是共價結(jié)合，證明蛋白質(zhì)與EMA的非特異性結(jié)合低。
選擇抗體-抗體試驗作為蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的代表性例子。具體地說，將多克隆兔IgG固定在Corning LID微孔板的多個孔中；作為陰性對照，其它孔用BSA或乙醇胺(EA)衍生。多克隆抗-兔(“a-兔”)抗體的溶液與各孔一起孵育，用Corning LID平臺定量檢測結(jié)合的量。圖10總結(jié)了試驗結(jié)果?？?兔抗體與固定的兔IgG的結(jié)合觀察到高信號；結(jié)合數(shù)量是可重現(xiàn)的，CV約為4％。用抗-小鼠抗體孵育提供兔IgG的孔，產(chǎn)生低水平結(jié)合；當用抗-兔抗體溶液孵育提供一般蛋白(BSA)的孔或以乙醇胺阻斷的孔時，如果觀察到結(jié)合的話也只是很少的結(jié)合。這些數(shù)據(jù)證明，a-兔/兔結(jié)合相互作用是高度特異性的，EMA表面顯示出極少量的非特異性結(jié)合。
蛋白質(zhì)/小分子藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中對能夠檢測小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合非常感興趣。進行試驗以證明i)固定在用馬來酸酐共聚物修飾的表面上的蛋白質(zhì)保留了其功能性并可用于小分子結(jié)合試驗；ii)小分子與EMA的非特異性結(jié)合低。選擇兩種模型系統(tǒng)進行這些研究熒光素-生物素或生物素與鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合，和藥物與人血清白蛋白的結(jié)合。
通過用乙酸鹽緩沖液(20mM，pH5.5)配制的25ug/mL鏈霉抗生物素蛋白溶液孵育微孔板的孔15分鐘，將蛋白固定在EMA涂覆的LID微孔板上。作為陰性對照，其它孔用乙醇胺阻斷。在LID設(shè)備中檢測作為時間函數(shù)的小分子熒光素-生物素(“Fl-生物素”，831Da)的結(jié)合。Fl-生物素在PBS中的100nM溶液加入到各孔中，允許結(jié)合幾分鐘。圖11顯示了結(jié)果的圖。通過減去陰性對照孔的響應(yīng)值來校正了折射效應(yīng)容積指數(shù)(bulk index of refraction effects)數(shù)據(jù)。對于熒光素-生物素的結(jié)合觀察到48pm+/-2pm的響應(yīng)值，信噪比＞200。圖12顯示了用小分子生物素進行的類似試驗的結(jié)果。相對于不含鏈霉抗生物素蛋白的陰性對照孔(孔H)，陽性對照孔(B-F)對生物素結(jié)合顯示出～5pm的響應(yīng)值，信噪比約50。在微孔板的各行中重復(fù)該試驗，得到類似的結(jié)果。這些結(jié)果證明，可在固定在EMA上的蛋白質(zhì)上進行小分子結(jié)合試驗。
在另外一個系列的試驗中，用LID檢測平臺檢測了藥物洋地黃毒甙(765Da)和華法林(308Da)與固定在EMA涂覆的96孔微孔板上的人血清白蛋白(HSA，一種參與將藥物輸送到血液中的蛋白)的結(jié)合。將微孔板的孔與乙酸鹽緩沖液(20mM，pH5.5)配制的60ug/mL HSA蛋白溶液一起孵育15分鐘，從而將HSA固定在傳感器表面上。作為陰性對照，其它孔用乙醇胺阻斷。用PBS緩沖液和水徹底洗滌之后，將孔用乙醇胺(200mM，pH9.2)孵育10分鐘以阻斷殘余的反應(yīng)性基團。微孔板置于LID設(shè)備中，以100uL/孔的緩沖液(97％PBS/3％DMSO)平衡。將以水性緩沖液(97％PBS/3％DMSO)配制的100uL洋地黃毒甙(200uM)加入各孔，混合，允許結(jié)合幾分鐘。如圖13A所示，相對于不含固定的HSA的陰性對照孔(G和H)，陽性對照孔(A-F)顯示可重現(xiàn)的約10pm的響應(yīng)值改變(shift)。在獨立的一組試驗中，顯示洋地黃毒甙的結(jié)合是劑量依賴性和可飽和的(見圖13B)；可成功檢測到低至6μM的濃度(基于報道的洋地黃毒甙與HSA結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)，該濃度表明占據(jù)了～30％的結(jié)合位點)。數(shù)據(jù)的Scatchard分析表明Kd為16uM，與報道的Kd為16.5uM良好吻合。
用藥物華法林進行了一組類似的試驗。如圖14A所示，相對于三個陰性對照孔(B-D)，四個陽性對照孔(E-H)中觀察到響應(yīng)約為3pm。在對照試驗中，緩沖液空白而非華法林溶液加入到各孔中。如圖14B所示，陽性和陰性對照孔間未觀察到響應(yīng)值的顯著改變。
最后，用SPR檢測平臺檢測了藥物華法林(308Da)和甲氧萘丙酸(naproxen)(230Da)與人血清白蛋白的結(jié)合特征。在EMA涂覆的金片上進行這些試驗，試驗方式與文獻(14)所述類似。圖15顯示了作為藥物濃度的函數(shù)的藥物結(jié)合信號，表明兩種藥物的結(jié)合均是劑量依賴性的。結(jié)合于不含人血清白蛋白的陰性對照EMA表面的藥物的量可忽略不計，因此證明了相互作用的特異性良好。注意，相對于甲氧萘丙酸，華法林的結(jié)合產(chǎn)生更高水平的信號，這與華法林相對于甲氧萘丙酸分子量更高并且親和力稍高的事實是一致的。數(shù)據(jù)的Scatchard分析表明，甲氧萘丙酸和華法林的解離常數(shù)分別約為8uM和3uM；在Biacore CM5表面上進行的類似試驗顯示解離常數(shù)分別為7.5uM和4.5uM。這些數(shù)據(jù)與文獻中報道的結(jié)果一致，證明在EMA涂覆的表面上可獲得準確的結(jié)合數(shù)據(jù)。
D.使用阻斷劑蛋白質(zhì)/配體共價結(jié)合到表面后，阻斷表面上殘余的反應(yīng)性基團是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和/或配體受體相互作用研究中非常重要的一步。不充分的阻斷可導(dǎo)致與表面的高水平非特異性結(jié)合，使結(jié)果難以分析(如果不是不可能分析的話)。例如，基于活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)的表面通常用乙醇胺阻斷以形成酰胺鍵，從而產(chǎn)生電中性的疏水表面。相反，酸酐基團與胺的反應(yīng)通過開環(huán)機制進行，其中既形成酰胺鍵又形成羧酸，產(chǎn)生電負性表面(pH＞～4時)。因此，用乙醇胺或類似試劑阻斷對于某些試驗和試驗條件來說可能不夠充分。研究了針對酸酐修飾表面的靜電阻斷劑的新型應(yīng)用。具體地說，二乙胺乙基(DEAE)葡聚糖對于降低蛋白質(zhì)與馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物修飾的表面非特異性結(jié)合特別有效。
為了證明DEAE葡聚糖可用作靜電阻斷劑，制備了化學(xué)修飾的金表面，其含有連接于11-巰基十一烷胺(MUAM)自組裝單層的馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物薄(～1.5nm)層。放入Biacore 2000表面等離子共振(SPR)設(shè)備并用緩沖液平衡后，用乙醇胺與這些表面反應(yīng)，然后用以下物質(zhì)之一阻斷2分鐘i)乙醇胺；ii)DEAE葡聚糖(一種帶正電的葡聚糖)；iii)羧基甲基葡聚糖(一種帶負電的葡聚糖)；或天然葡聚糖(不帶電)。將蛋白質(zhì)溶液(以磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4配制的纖維蛋白原、溶菌酶、刀豆球蛋白A和牛血清白蛋白溶液各0.5mg/mL)注射到表面7分鐘，以測定結(jié)合到各表面的蛋白質(zhì)數(shù)量。(對于Biacore設(shè)備，1000RU相當于～1ng/mm^2吸附的蛋白質(zhì))。注射后，將系統(tǒng)返回到緩沖液中，洗滌2-20分鐘。圖16顯示了該試驗的結(jié)果。注意，僅用乙醇胺阻斷的表面結(jié)合了大量的蛋白質(zhì)。相反，用DEAE-葡聚糖阻斷的表面結(jié)合的蛋白質(zhì)的量顯著減少。具體地說，用緩沖液洗滌2分鐘后，用乙醇胺阻斷的表面結(jié)合～3.1ng/mm^2(3,100RU)的蛋白質(zhì)，而DEAE-葡聚糖阻斷的表面僅結(jié)合～0.74(740RU)的蛋白質(zhì)。用羧基甲基葡聚糖或天然葡聚糖阻斷的表面結(jié)合相似量的蛋白質(zhì)，提示這些葡聚糖不結(jié)合于表面，聚合物表面和DEAE葡聚糖間的相互作用是靜電性的。將表面暴露于乙醇胺(200mM，以150mM硼酸鹽緩沖液配制，pH9)溶液5分鐘可除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。雖然該洗滌步驟很有效，但采用該步驟可能與低結(jié)合親和力的相互作用不相容；因此，優(yōu)選在第一時間內(nèi)(與發(fā)生非特異性結(jié)合后再除去非特異性結(jié)合物相反)防止非特異性結(jié)合。
使用聚合物阻斷劑如DEAE-葡聚糖時的一個考慮是它可能干擾分析物與固定的靶標結(jié)合的能力。為解決這個問題，進行了SPR試驗，其中將人IgG固定在三甘醇甲基乙烯基醚-馬來酸酐交替共聚物修飾的金表面上。固定后，用EA阻斷流動通道1(FC1)，EA+DEAE葡聚糖阻斷流動通道2(FC2)。然后兩個通道均注射抗-IgG溶液。從圖17中可看出，兩個通道結(jié)合相似數(shù)量的抗-IgG，表明DEAE葡聚糖不干擾IgG/抗-IgG結(jié)合。
整個說明書中參考了各種出版物。這些出版物所公開的內(nèi)容全部以參考形式納入本申請中以更充分地描述本文描述的化合物、組合物和方法。
可對本文描述的材料、方法和產(chǎn)品進行各種改動和變化。根據(jù)本說明書和本文描述的材料、方法和產(chǎn)品的實施，本文描述的材料、方法和產(chǎn)品的其它方面是顯而易見的。本說明書和實施例應(yīng)理解為示范性的。
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(20)國際公開號WO8706702(21)日本公開號JP10234847(22)美國專利號4,407,975(23)美國專利號4,610,962(24)美國專利號4,610,962(25)美國專利號4,815,843(26)美國專利號6,541,071(27)美國專利號6,632,615(28)美國專利公開號US20030017464 A1(29)美國專利公開號US20040091602 A1(30)美國專利公開號US20040043497 A1(31)美國專利公開號US20040043508 A1(32)美國專利號5,436,161(33)“蛋白質(zhì)固定到羧基甲基葡聚糖修飾的金表面上，用于在表面等離子共振傳感器中進行生物特異性相互作用分析”(“Immobilization of Proteins toa Carboxymethyldextran-Modified Gold Surface for Biospecific InteractionAnalysis in Surface Plasmon Resonance Sensors，”Johnsson等，Anal.Biochem.，1991，198，268-277.
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權(quán)利要求
1.一種基材，其包括第一連接層和第一聚合物，其中第一聚合物包括可將生物分子結(jié)合到基材的一種或多種官能團，其中連接層連接于基材，所述連接層將所述第一聚合物連接于基材。
2.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材包括塑料、聚合物或共聚物材料、陶瓷、玻璃、金屬、晶體材料、稀有或半稀有金屬、金屬氧化物或非金屬氧化物、過渡金屬、或它們的任意組合。
3.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層共價連接于基材表面。
4.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層靜電連接于基材表面。
5.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層衍生自包含一種或多種反應(yīng)性官能團的化合物。
6.如權(quán)利要求5所述的基材，其特征在于，所述官能團包括氨基、巰基、羥基、羧基、丙烯酸、有機或無機酸、酯、酸酐、醛、環(huán)氧化物，它們的衍生物或鹽，或它們的組合。
7.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層衍生自直鏈或支鏈氨基硅烷、氨基烷氧基硅烷、氨基烷基硅烷、氨基芳基硅烷、氨基芳氧基硅烷，或它們的衍生物或鹽。
8.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層衍生自3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N’-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基甲氧基硅烷、或氨基丙基倍半硅氧烷。
9.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層衍生自多胺。
10.如權(quán)利要求9所述的基材，其特征在于，所述第一連接層衍生自聚-賴氨酸或聚乙烯亞胺。
11.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層包括自組裝單層。
12.如權(quán)利要求11所述的基材，其特征在于，所述自組裝單層包含末端為胺的烷基硫醇。
13.如權(quán)利要求11所述的基材，其特征在于，所述自組裝單層包含11-巰基十一烷胺。
14.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物共價連接于第一連接層。
15.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物靜電連接于第一連接層。
16.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物包括共聚物。
17.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種易于受親核攻擊的親電子基團。
18.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種胺-反應(yīng)性基團。
19.如權(quán)利要求18所述的基材，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團包括酯基、環(huán)氧化物基團或醛基。
20如權(quán)利要求18所述的基材，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團是醛基。
21.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物包括衍生自馬來酸酐和第一單體的共聚物。
22.如權(quán)利要求21所述的基材，其特征在于，所述第一單體提高馬來酸酐基團的水解穩(wěn)定性。
23.如權(quán)利要求21所述的基材，其特征在于，所述第一單體降低生物分子與基材的非特異性結(jié)合。
24.如權(quán)利要求21所述的基材，其特征在于，第一聚合物中馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的5％-50％。
25.如權(quán)利要求21所述的基材，其特征在于，第一聚合物中馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的約50％。
26.如權(quán)利要求21所述的基材，其特征在于，所述第一單體包括苯乙烯、十四烯、十八烯、甲基乙烯基醚、三甘醇甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、二乙烯基苯、乙烯、丙烯酰胺、吡咯烷酮、二甲基丙烯酰胺、可聚合的寡(乙二醇)或寡(環(huán)氧乙烷)，或它們的組合。
27.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一聚合物包括聚(乙酸乙烯酯-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)、異丁烯-馬來酸酐交替共聚物、馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物、馬來酸酐-1-十四烯交替共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物、聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)，或它們的組合。
28.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
29.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，第一聚合物包括至少一個單層。
30.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，第一聚合物的厚度約為10-2,000。
31.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材還包括第二連接層和第二聚合物，其中第二連接層連接于第一聚合物，第二聚合物連接于第二連接層。
32.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，第二連接層共價連接于第一聚合物，第二聚合物共價連接于第二連接層。
33.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，第二連接層衍生自多胺或多元醇。
34.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，第二連接層包含乙二胺、乙二醇、或寡聚乙二醇二胺。
35.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，第二連接層衍生自二胺、三胺或四胺。
36.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，所述第二聚合物包含至少一種胺-反應(yīng)性基團。
37.如權(quán)利要求36所述的基材，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團包括酯基、環(huán)氧化物基團或醛基。
38.如權(quán)利要求36所述的基材，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團是醛基。
39.如權(quán)利要求31所述的基材，其特征在于，所述第二聚合物包括聚馬來酸酐或衍生自馬來酸酐的共聚物。
40.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，連接劑連接于第一聚合物。
41.如權(quán)利要求40所述的基材，其特征在于，連接劑共價連接于第一聚合物。
42.如權(quán)利要求40所述的基材，其特征在于，連接劑靜電連接于第一聚合物。
43.如權(quán)利要求40所述的基材，其特征在于，所述連接劑包括N-(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨二醋酸。
44.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，生物分子連接于第一聚合物。
45.如權(quán)利要求44所述的基材，其特征在于，生物分子共價連接于第一聚合物。
46.如權(quán)利要求44所述的基材，其特征在于，生物分子靜電連接于第一聚合物。
47.如權(quán)利要求44所述的基材，其特征在于，所述生物分子包括天然或合成的寡核苷酸、天然或修飾/阻抑的核苷酸/核苷、核苷酸(DNA)或(RNA)、包含天然或修飾/阻抑的氨基酸的肽、抗體、半抗原、生物配體、膜蛋白、脂膜、小分子或細胞。
48.如權(quán)利要求44所述的基材，其特征在于，生物分子包括蛋白質(zhì)。
49.如權(quán)利要求44所述的基材，其特征在于，所述蛋白質(zhì)包括肽、蛋白質(zhì)或肽的片段、膜結(jié)合蛋白質(zhì)或核蛋白質(zhì)。
50.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材還包括阻斷劑，其中該阻斷劑連接于第一聚合物。
51.如權(quán)利要求50所述的基材，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的聚合物或化合物。
52.如權(quán)利要求50所述的基材，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的葡聚糖。
53.如權(quán)利要求50所述的基材，其特征在于，所述阻斷劑是二乙胺乙基葡聚糖。
54.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述第一連接層是氨基丙基倍半硅氧烷，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
55.如權(quán)利要求1所述的基材，其特征在于，所述基材是微孔板或載玻片。
56.一種制備基材的方法，所述方法包括(1)將第一連接層化合物連接于基材，和(2)將第一聚合物連接于第一連接層化合物。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述基材包括塑料、聚合物或共聚物材料、陶瓷、玻璃、金屬、晶體材料、稀有或半稀有金屬、金屬氧化物或非金屬氧化物、過渡金屬、或它們的任意組合。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，第一連接層共價連接于基材的外表面。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，第一連接層靜電連接于基材的外表面。
60.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包含一種或多種反應(yīng)性官能團。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于，所述官能團包括氨基、巰基、羥基、羧基、丙烯酸、有機或無機酸、酯、酸酐、醛、環(huán)氧化物，它們的衍生物或鹽，或它們的組合。
62.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包括直鏈或支鏈氨基硅烷、氨基烷氧基硅烷、氨基烷基硅烷、氨基芳基硅烷、氨基芳氧基硅烷，或它們的衍生物或鹽。
63.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N’-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基甲氧基硅烷、或氨基丙基倍半硅氧烷。
64.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層衍生自多胺。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于，所述第一連接層衍生自聚-賴氨酸或聚乙烯亞胺。
66.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層包括自組裝單層。
67.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物共價連接于所述連接層。
68.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物靜電連接于所述連接層。
69.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括共聚物。
70.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種易于受親核攻擊的親電子基團。
71.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種胺-反應(yīng)性基團。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團包括酯基、環(huán)氧化物基團或醛基。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團是醛基。
74.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括衍生自馬來酸酐和第一單體的共聚物。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的5％-50％。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的約50％。
77.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一單體包括苯乙烯、十四烯、十八烯、甲基乙烯基醚、三甘醇甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、二乙烯基苯、乙烯、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、吡咯烷酮、可聚合的寡(乙二醇)或寡(環(huán)氧乙烷)，或它們的組合。
78.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括聚(乙酸乙烯酯-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)、乙烯-馬來酸酐交替共聚物、異丁烯-馬來酸酐交替共聚物、馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物、馬來酸酐-1-十四烯交替共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物、聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)，或它們的組合。
79.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
80.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，第一聚合物包括至少一個單層。
81.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，第一聚合物的厚度約為10-2,000。
82.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，在步驟(2)之后，(3)將第二連接層化合物連接于第一聚合物，和(4)將第二聚合物連接于第二連接層化合物。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，第二連接層共價和/或靜電連接于第一聚合物，第二聚合物共價和/或靜電連接于第二連接層化合物。
84.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，第二連接層化合物包含多胺或多元醇。
85.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，第二連接層包含乙二胺、乙二醇、或寡聚乙二醇二胺。
86.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，第二連接層包含二胺、三胺或四胺。
87.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述第二聚合物包含至少一種酸酐基團。
88.如權(quán)利要求82所述的方法，其特征在于，所述第二聚合物包括聚馬來酸酐或衍生自馬來酸酐的共聚物。
89.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，在步驟(2)后，(3)將連接劑連接于第一聚合物。
90.如權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述連接劑包括N-(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨二醋酸。
91.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，在步驟(2)后，(3)將生物分子連接于第一聚合物。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子通過化學(xué)相互作用、靜電相互作用或它們的組合連接于第一聚合物。
93.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子共價連接于第一聚合物。
94.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子包括天然或合成的寡核苷酸、天然或修飾/阻抑的核苷酸/核苷、核苷酸(DNA)或(RNA)、包含天然或修飾/阻抑的氨基酸的肽、抗體、半抗原、生物配體、膜蛋白、脂膜、小分子或細胞。
95.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子包括蛋白質(zhì)。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)包括肽、蛋白質(zhì)或肽的片段、膜結(jié)合蛋白質(zhì)或核蛋白質(zhì)。
97.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子在約1小時內(nèi)以足夠的量連接于基材。
98.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子在約0.5小時內(nèi)以足夠的量連接于基材。
99.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物分子在低于其等電點約0.5-1pH單位的pH條件下連接于第一聚合物。
100.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，在步驟(2)后，(3)將阻斷劑連接于第一聚合物。
101.如權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的化合物。
102.如權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的葡聚糖。
103.如權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑是二乙胺乙基葡聚糖。
104.如權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，在步驟(3)后，(4)將阻斷劑連接于第一聚合物。
105.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述第一連接層是氨基丙基倍半硅氧烷，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
106.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述基材是微孔板或載玻片。
107.一種用權(quán)利要求56所述方法制備的基材。
108.一種進行配體試驗的方法，該方法包括(1)將配體與基材接觸，所述基材包括第一連接層、第一聚合物和生物分子，其中所述連接層將第一聚合物連接于基材，生物分子連接于第一聚合物，配體在接觸步驟之后結(jié)合于基材上的生物分子，和(2)檢測結(jié)合的配體。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述試驗是高通量試驗。
110.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述配體包括藥物、寡核苷酸、核酸、蛋白質(zhì)、抗體、抗原、半抗原或小分子。
111.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，用熒光檢測所述結(jié)合的配體。
112.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，用表面等離子共振、波導(dǎo)共振光柵系統(tǒng)或質(zhì)譜檢測所述結(jié)合的配體。
113.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述基材包括塑料、聚合物或共聚物材料、陶瓷、玻璃、金屬、晶體材料、稀有或半稀有金屬、金屬氧化物或非金屬氧化物、過渡金屬、或它們的任意組合。
114.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第一連接層共價連接于基材的外表面。
115.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第一連接層靜電連接于基材的外表面。
116.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包含一種或多種反應(yīng)性官能團。
117.如權(quán)利要求116所述的方法，其特征在于，所述官能團包括氨基、巰基、羥基、羧基、丙烯酸、有機或無機酸、酯、酸酐、醛、環(huán)氧化物，它們的衍生物或鹽，或它們的組合。
118.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包括直鏈或支鏈氨基硅烷、氨基烷氧基硅烷、氨基烷基硅烷、氨基芳基硅烷、氨基芳氧基硅烷，或它們的衍生物或鹽。
119.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層化合物包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N’-(β-氨基乙基)-3-氨基丙基甲氧基硅烷、或氨基丙基倍半硅氧烷。
120.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層衍生自多胺。
121.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述第一連接層衍生自聚-賴氨酸或聚乙烯亞胺。
122.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層包括自組裝單層。
123.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物共價連接于所述連接層。
124.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物靜電連接于所述連接層。
125.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括共聚物。
126.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種易于受親核攻擊的親電子基團。
127.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包含至少一種胺-反應(yīng)性基團。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團包括酯基、環(huán)氧化物基團或醛基。
129.如權(quán)利要求128所述的方法，其特征在于，所述胺-反應(yīng)性基團是醛基。
130.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括衍生自馬來酸酐和第一單體的共聚物。
131.如權(quán)利要求130所述的方法，其特征在于，馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的5％-50％。
132.如權(quán)利要求130所述的方法，其特征在于，馬來酸酐的量為第一單體化學(xué)計算量的約50％。
133.如權(quán)利要求130所述的方法，其特征在于，所述第一單體包括苯乙烯、十四烯、十八烯、甲基乙烯基醚、三甘醇甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、二乙烯基苯、乙烯、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、吡咯烷酮、可聚合的寡(乙二醇)或寡(環(huán)氧乙烷)，或它們的組合。
134.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一聚合物包括聚(乙酸乙烯酯-馬來酸酐)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)、乙烯-馬來酸酐交替共聚物、異丁烯-馬來酸酐交替共聚物、馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物、馬來酸酐-1-十四烯交替共聚物、馬來酸酐-甲基乙烯基醚交替共聚物、聚(三甘醇甲基乙烯基醚-共-馬來酸酐)，或它們的組合。
135.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
136.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第一聚合物包括至少一個單層。
137.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第一聚合物的厚度約為10-2,000。
138.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，第二連接層化合物連接于第一聚合物，第二聚合物連接于第二連接層化合物。
139.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，第二連接層化合物共價和/或靜電連接于第一聚合物，第二聚合物共價和/或靜電連接于第二連接層化合物。
140.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，第二連接層化合物包含多胺或多元醇。
141.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，第二連接層包含乙二胺、乙二醇、或寡聚乙二醇二胺。
142.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，第二連接層包含二胺、三胺或四胺。
143.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第二聚合物包含至少一種酸酐基團。
144.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于，所述第二聚合物包括聚馬來酸酐或衍生自馬來酸酐的共聚物。
145.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述基材還包括連接于第一聚合物的連接劑。
146.如權(quán)利要求145所述的方法，其特征在于，所述連接劑包括N-(5-氨基-1-羧基戊基)亞氨二醋酸。
147.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，生物分子通過化學(xué)相互作用、靜電相互作用或它們的組合連接于第一聚合物。
148.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述生物分子通過連接劑連接于第一聚合物。
149.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述生物分子共價連接于第一聚合物。
150.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述生物分子包括天然或合成的寡核苷酸、天然或修飾/阻抑的核苷酸/核苷、核苷酸(DNA)或(RNA)、包含天然或修飾/阻抑的氨基酸的肽、抗體、半抗原、生物配體、膜蛋白、脂膜、小分子或細胞。
151.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述生物分子包括蛋白質(zhì)。
152.如權(quán)利要求151所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)包括肽、蛋白質(zhì)或肽的片段、膜結(jié)合蛋白質(zhì)或核蛋白質(zhì)。
153.如權(quán)利要求108所述的方法，所述基材還包括連接于第一聚合物的阻斷劑。
154.如權(quán)利要求153所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的化合物。
155.如權(quán)利要求153所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑包括帶正電荷的葡聚糖。
156.如權(quán)利要求153所述的方法，其特征在于，所述阻斷劑是二乙胺乙基葡聚糖。
157.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述第一連接層是氨基丙基倍半硅氧烷，第一聚合物是乙烯-馬來酸酐交替共聚物。
158.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述基材是微孔板或載玻片。
全文摘要
本文描述了用于結(jié)合生物分子的、聚合物涂覆的基材及其制備和使用方法。
文檔編號G01N33/543GK101065665SQ200580040222
公開日2007年10月31日 申請日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日
發(fā)明者A·G·弗魯托斯, J·拉希瑞 申請人:康寧股份有限公司