亚洲狠狠干,亚洲国产福利精品一区二区,国产八区,激情文学亚洲色图

實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測基孔肯亞病毒核酸的方法

文檔序號(hào):585790閱讀:426來源:國知局
專利名稱:實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測基孔肯亞病毒核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。
背景技術(shù)
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)是單股正鏈RNA病毒,屬于披膜病毒科 (Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus),引起基孔肯雅熱(Chikungunyafever,CHIK)。該 病為一種急性傳染病,通過伊蚊傳播給人,在臨床上以發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、皮疹和輕度出血為 特征。1953年首次從坦桑尼亞的1例發(fā)熱患者的血液中分離出基孔肯雅病毒。20世紀(jì) 60-90年代,在非洲中部和南部的許多國家該病均有流行,并分離到CHIK病毒,如蘇丹、烏 干達(dá)、剛果民主共和國、中非共和國、馬拉維、津巴布韋、肯尼亞和南非;西非的塞內(nèi)加爾、貝 寧、幾內(nèi)亞共和國、科特迪瓦和尼日利亞等;在東南亞,1999年印度尼西亞首次暴發(fā)CHIK, 2001-2003年此地再次出現(xiàn)該病流行;在印度洋島嶼,近幾年,印度洋島嶼出現(xiàn)大規(guī)模的 CHIK暴發(fā)流行。2005年,科摩羅島發(fā)生大暴發(fā)流行并迅速傳播到整個(gè)印度洋的其他島嶼; 在歐洲,2007年7月,意大利拉文納省的2個(gè)村莊發(fā)生CHIK ;2004-2007年,亞洲和非洲等 地區(qū)的CHIK暴發(fā)流行不斷發(fā)生,其中2006年全球共發(fā)生CHIK患者大約200萬例。值得注 意的是我國的臺(tái)灣地區(qū)在1967年和2006年曾發(fā)生過CHIK流行,2008年我國大陸首次發(fā)現(xiàn) 的CHIK輸入性病例。但截至目前我國尚無CHIK本土流行的確切報(bào)道。縱觀歷史,CHIK已 經(jīng)成為全球區(qū)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前,針對(duì)外來傳染病的實(shí)驗(yàn)室快速檢測技術(shù)主要采用的是免疫學(xué)檢測及核酸檢 測技術(shù),尤其以PCR技術(shù)為代表的核酸檢測技術(shù),能夠非常靈敏的檢測出各種疫病病原體 的核酸。但是由于PCR擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)常帶來特異性問題,各國科學(xué)家和技術(shù)人員都在PCR技術(shù) 基礎(chǔ)上,結(jié)合其它新技術(shù),努力改善PCR技術(shù)的特異性和敏感度。近年來,基于PCR技術(shù)及 ABI Taqman探針雜交技術(shù)發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)極大地改善了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的特異 性和敏感性以及抗污染的能力,已經(jīng)越來越廣泛的應(yīng)用到各種疫病的檢驗(yàn)檢疫中。隨著探 針技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展完善,一種新型的Hydro Easy Probes的出現(xiàn),能夠有效的改進(jìn)Taqman 探針本底信號(hào)高的缺點(diǎn),并且進(jìn)一步提高檢測的靈敏度。本發(fā)明擬采用新型HydroEasy Probes設(shè)計(jì)技術(shù),開發(fā)基孔肯雅病毒的熒光PCR檢測診斷方法,為國境口岸的基孔肯雅病 毒的快速檢測提供有力保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法。該 方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù),設(shè)計(jì)了一對(duì)引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢 測。該方法檢測特異性好,靈敏度高。本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法,首先包括獲得檢測基孔 肯亞病毒核酸的引物和探針的步驟,該步驟具體為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行同源性比對(duì),在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物;(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增 區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性探針,并登錄GENEBANK中檢測探針的特異性;(3)對(duì)待檢 測物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。在本發(fā)明上述方法中,所篩選的基孔肯亞病毒可以是NCBI公布的所有基孔肯亞 病毒全基因組序列。另外,本發(fā)明的方法中,可以利用DNASTAR軟件進(jìn)行序列的同源性比 對(duì)。比對(duì)結(jié)果見

圖1。圖中陰影部分為全序列中某個(gè)高保守區(qū)。在本發(fā)明引物和探針設(shè)計(jì)中,首先在比對(duì)的序列保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物,根據(jù)引 物設(shè)計(jì)原理,在保守區(qū)之間設(shè)計(jì)上游和下游引物,其中在下游引物的第5位和第25位存在 簡并性,設(shè)計(jì)位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的特異的探針,其中在探針的第19位和第21位存在簡并性。 引物和探針在合成時(shí),探針5'端連接FAM熒光基團(tuán),3'端連接BHQ非熒光基團(tuán)。引物的特 異性增強(qiáng)。引物和探針序列見表1。表 權(quán)利要求
實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法,其特征在于,該方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù),通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針對(duì)病毒樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測,所設(shè)計(jì)引物和探針序列如下
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,該方法包括引物和探針的獲得,對(duì)基孔肯 亞病毒核酸的檢測;其中,引物和探針的獲得步驟為(1)收集篩選基孔肯亞病毒全基因組 序列,利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行同源性比對(duì),并在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,(2)根據(jù)PCR擴(kuò)增區(qū) 域內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性探針,并登錄 GENEBANK檢測探針的特異性;對(duì)基孔肯亞病毒 核酸的檢測步驟為首先提取病毒的核酸,然后利用所設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)待檢測物進(jìn)行 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述RT-PCR擴(kuò)增具體為配制一定組分濃度 的25 μ L PCR反應(yīng)體系。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述樣本包括蚊蟲、蝙蝠、人血清及組織、細(xì) 胞培養(yǎng)液、野生靈長類、家畜等。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)中,所述 探針上連接的熒光基團(tuán)包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述RT-PCR反應(yīng)適用于ABI實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、 BioRad實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)、Stratagene定量多聚酶鏈反應(yīng)儀來完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測基孔肯亞病毒核酸的方法,該方法包括引物和探針的獲得及基孔肯亞病毒核酸的檢測。本發(fā)明具有特異性好,靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101935715SQ20101027664
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者姚李四, 張曉龍, 燕清麗 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1