改進的dna聚合酶寡核苷酸抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明包括一種核酸聚合酶的可逆寡核苷酸抑制劑。還公開了設計所述抑制劑的方法以及在核酸的擴增和檢測中使用所述抑制劑的方法，特別是通過RT?PCR檢測RNA。
【專利說明】改進的DNA聚合酶真核昔酸抑制劑 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明設及核酸擴增領域，并且具體地，設及通過使用聚合酶的可逆寡核巧酸抑 制劑降低由熱穩(wěn)定性DNA聚合酶引起的非特異性擴增。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 聚合酶鏈式反應(PCR)和實時PCR已經(jīng)在研究和臨床領域中被廣泛接受為檢測祀 標核酸的快速且特異性的方法。然而，非特異性擴增的問題，即，非祀標序列的擴增，常常是 實現(xiàn)臨床應用所需的高靈敏度和特異性的限制因素。參見Mackay，I.M. (2004) ,Real-time PCR in the microbiology laboratory，Clin.Microbiol. Infect.10:190。
[0004] 認為非特異性擴增是與基因組中的次要的、部分互補位點退火或與交叉退火或自 退火的引物退火的引物的延伸引起的。非特異性延伸產(chǎn)物的存在已經(jīng)歸因于環(huán)境溫度下的 聚合酶活性，在運種情況下，此類部分互補的引物-模板雙鏈體是穩(wěn)定的（Chou等，（1992)， Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplification,Nucleic Acid Res.20:1717)。因此，已經(jīng)設計了抑制環(huán)境溫度下 聚合酶的引物延伸活性的方法。運些被稱為"熱啟動"的方法確保只有在溫度足夠高使得非 特異性引物-模板復合物去穩(wěn)定時，聚合酶才變得完全有活性，由此避免非特異性位點的引 物延伸。
[0005] -種熱啟動方法設及在低溫下結合并抑制聚合酶但在高溫下不結合和抑制聚合 酶的寡核巧酸，參見Dang和Jayasena(1996) ,Oligonucleotide inhibitors of !"aq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR, J.Mol.Biol. 264:268。運些寡核巧酸對祀標酶是極具特異性的并且對祀標酶具有高親和 力。
[0006] 然而，熱啟動方法不適于逆轉錄PCR(RT-PCR)應用，其中逆轉錄酶需要低于50°C的 溫度。某些熱穩(wěn)定性DNA聚合酶具有逆轉錄活性，其允許在同一反應混合物中使用單一酶進 行cDNA的逆轉錄和擴增（RT-PCR)，參見Myers和Gelfand( 1991) ,Reverse hanscription and DNA amplification by a Thermus thermophiIus DNA polymerase， Biochemi stry30:7661。然而，RNA在聚合酶活性需要的二價離子存在下在高溫下是不穩(wěn)定 的。為此，在傳統(tǒng)PCR熱循環(huán)開始之前，在較低溫度(50-6(TC)下進行逆轉錄。典型的寡核巧 酸適體具有接近60°C的解鏈溫度并且在較低溫度下沒有充分釋放聚合酶的抑制作用。因 此，期望獲得可W在較低溫度下釋放抑制作用的可逆聚合酶抑制劑。
[0007] 發(fā)明概述
[000引在一個實施方案中，本發(fā)明是包含具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA 寡核巧酸的核酸聚合酶的可逆抑制劑，其中至少一個所述區(qū)域包含至少一個尿喀晚堿基。 雙鏈二級結構在PCR混合物中在環(huán)境溫度下可W是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，可逆抑制劑 具有SEQ ID NO: 1，其中一個或多個胸腺喀晚堿基被尿喀晚堿基替代，例如，SEQ ID N0:2- 4。
[0009]在另一個實施方案中，本發(fā)明是設計核酸聚合酶的可逆抑制劑的方法，其包括設 計具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸，其中至少一個所述區(qū)域包含至 少一個尿喀晚堿基?？蒞使用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)，從寡核巧酸混合物中 選擇所述寡核巧酸。
[0010] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是可逆地抑制反應混合物中的核酸聚合酶的方 法，其包括將混合物接觸具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸，其中至少 一個所述區(qū)域包含至少一個尿喀晚堿基。該方法可W進一步包括將混合物接觸尿喀晚-N-糖基化酶，任選在40-65°C的溫度范圍中。該方法可W進一步包括將樣品接觸聚胺，例如，聚 胺選自亞精胺、精胺和=亞甲基二胺。
[0011] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是擴增祀標核酸的方法，其包括在擴增之前，將含 有祀標核酸的反應混合物與具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸接觸， 其中至少一個所述區(qū)域包含至少一個尿喀晚堿基。該方法可W進一步包括在擴增之前，將 樣品與尿喀晚-N-糖基化酶接觸，并且任選接觸聚胺，如例如，亞精胺、精胺或S亞甲基二 胺。
[0012] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于擴增祀標核酸的試劑盒，其含有核酸聚合 酶的可逆抑制劑，所述抑制劑包含具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸， 其中至少一個所述區(qū)域包含至少一個尿喀晚堿基。該試劑盒可W進一步包含尿喀晚-N-糖 基化酶和任選的聚胺，如例如，亞精胺、精胺或=亞甲基二胺。
[0013] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于擴增祀標核酸的反應混合物，其含有核酸 聚合酶的可逆抑制劑，所述抑制劑包含具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核 巧酸，其中至少一個所述區(qū)域包含至少一個尿喀晚堿基。反應混合物可W進一步包含尿喀 晚-N-糖基化酶和任選的聚胺，如例如，亞精胺、精胺或=亞甲基二胺。
[0014] 附圖簡述
[001引圖1顯示了預測的寡核巧酸SEQ ID NO: 1的二級結構和其中T被U替代形成SEQ ID NO: 2-4的位置。
[0016] 圖2-5顯示了在不同溫度下，在SEQ ID NO: 1-4存在下，引物延伸的結果。
[0017] 發(fā)明詳述 [001引 定義
[0019] 術語"核酸"和"寡核巧酸"是指祀序列和探針。該術語不受限于長度并且通常是指 脫氧核糖核巧酸(單鏈或雙鏈DNA)、核糖核巧酸(RNA)和嚷嶺或喀晚堿基的任何其他N-糖巧 的線性聚合物，所述堿基包括腺巧、鳥巧、胞巧、胸巧和尿巧W及運些堿基的修飾。
[0020] 術語"常規(guī)的"或"天然的"設及核酸堿基、=憐酸核巧或核巧酸時，是指在描述的 多核巧酸中天然產(chǎn)生的那些（即，對于DNA，運些是腺嚷嶺或dATP、鳥嚷嶺或dGTP、胞喀晚或 dCTP和胸腺喀晚或dTTP，而對于RNA，運些是腺嚷嶺或dATP、鳥嚷嶺或dGTP、胞喀晚或dCTP和 尿喀晚或UTP )。
[0021] 術語"非常規(guī)的"、"非天然的"或"修飾的"設及核酸堿基、核巧或核巧酸時，包括不 是在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸中產(chǎn)生的的核酸堿基、核巧或核巧酸，而是常規(guī)堿基、核巧或核巧 酸的修飾、衍生或類似物。例如，(HTP和7-脫氮-dGTP不是在自然界中的核酸中產(chǎn)生的，但常 常用于替代dGTP，并且7-脫氮-dATP可W用于替代體外DNA合成反應中的dATP，如測序。某些 非常規(guī)核巧酸與常規(guī)的dNTP相比，在核糖的2'位置經(jīng)修飾。核糖核巧酸是作為DNA聚合酶底 物的非常規(guī)核巧酸。如本文中使用的，非常規(guī)核巧酸包括，但不限于，用作用于核酸測序終 止子的化合物。示例性終止子化合物包括但不限于具有2'，3'雙脫氧結構并稱為=憐酸雙 脫氧核巧的那些化合物，例如，ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP。終止子化合物的其他實例包括 核糖核巧酸的2'-P化類似物(參見，例如，美國專利No.7,947,817)。其他非常規(guī)核巧酸包括 硫逐憐酸醋dNTP ([ [ a ] -S ] dNTP)、5 ' -[ a ] -borano-dNTP、[ a ]-甲基-憐酸dNTP和S憐酸核糖 核巧(rNTP)。非常規(guī)的堿基可W用放射性同位素（如32P、 33P或35S);巧光標記;化學發(fā)光標 記;生物發(fā)光標記;半抗原標記，如生物素;或酶標記，如抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋 白來標記。巧光標記可W包括負電荷染料，如巧光素家族的染料，或電荷中性染料，如若丹 明家族的染料，或正電荷染料，如花青家族的染料。巧光素家族的染料包括，例如，F(xiàn)AM、肥X、 TET、JOE、NAN和ZOE。若丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。各種染料W 及用FAM、肥X、TET、J0E、NAN、Z0E、R0X、R110、R6G、TexasRed和TAMRA標記的核巧酸由 Perkin-Elmer(Boston,Mass.)、Applied Biosystems(Foster City，Cal. ^Invitrogen/ Molecular Probes化Ugene，0re.)銷售。花青家族的染料包括切2、切3、切5和切7并且由GE He曰Ithc曰re Biosciences(Pittsburgh，Penn.)銷售。
[0022] 術語"寡核巧酸"是指包括至少兩個核酸單體單位(例如，核巧酸）的核酸聚合物。 寡核巧酸通常包括約六個至約175個核巧酸，更常見為約八個至約75個核巧酸，例如，約15、 約20、約25、約30、約35或更多個核巧酸。寡核巧酸的確切大小將取決于許多因素，包括最終 的功能或寡核巧酸的用途。存在許多用于制備寡核巧酸的方法，例如，現(xiàn)有或天然序列的分 離，合適序列的DNA復制或擴增、逆轉錄、克隆和限制酶消化，或通過如下方法的直接化學合 成：Narang等的憐酸S醋法（Meth . Enzyml. 68 : 90-99，1979);化〇龍等的憐酸二醋法 (Meth. Enzyml.68:109-151,1979); Beaucage等的二乙基亞憐酷胺法（Tetrahedron Lett. 22 :1859-1862,1981) ;Matteucci 等的 S 醋法（J. Am.畑 em. Soc. 103 :3185-3191, 1981)。
[0023] 術語"探針"是指在合適條件下與祀標核酸選擇性地雜交的寡核巧酸。
[0024] 術語"祀標序狎'或"祀標"是指待分析的核酸序列的區(qū)域。
[0025] 術語"樣品"是指含有或推測含有核酸的任何組合物。運包括從個體分離的組織或 流體樣品，例如，皮膚、血漿、血清、脊髓液、淋己液、滑液、尿液、淚液、血細胞、器官、骨髓和 腫瘤，包括新鮮或新鮮冷凍的組織和福爾馬林固定石蠟包埋的組織(FFPET)，W及從獲自個 體的細胞體外培養(yǎng)建立的樣品，和從其分離的核酸。
[0026] 術語"適體"是指如美國專利No. 5，693，502中所述的，特異性地識別和結合DNA聚 合酶并有效抑制聚合酶活性的寡核巧酸。
[0027] 術語"突變體"，在本發(fā)明的DNA聚合酶的內(nèi)容中，是指多膚，通常是重組的，其相對 于相應的天然產(chǎn)生的或未修飾的DNA聚合物，其包含一個或多個氨基酸置換。
[0028] 術語"熱穩(wěn)定性聚合酶"是指在升高的溫度下穩(wěn)定的、抗熱的并保持足夠活性來實 現(xiàn)隨后的多核巧酸延伸反應并且在接受升高的溫度持續(xù)實現(xiàn)雙鏈核酸變性所需的時間時 沒有變成不可逆變性(滅活）的酶。來自嗜熱細菌的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶包括，例如，來自海 棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、水生棲熱菌(Thermus aquati州S)、嗜熱棲熱菌、黃棲熱 菌(Thermus flavus)、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)、棲熱菌種Spsl7、棲熱菌種Z05、 Thermus caldophilus、熱堅芽抱桿菌（Bacillus caldotenax)、那不勒斯棲熱袍菌 (Thermotoga neopolitana)和非洲棲熱腔菌（Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。
[0029] 術語"熱活性"是指在通常用于PCR反應中的退火和延伸步驟的溫度下（即，45-80 °C)維持其催化特性的酶。熱活性酶可W是或可W不是熱穩(wěn)定性的。熱活性DNA聚合酶可W 是依賴于嗜熱物種，或來自嗜溫種的DNA或RNA，所述嗜溫種包括，但不限，大腸桿菌 化SCherichia COli .)、莫洛尼鼠白血病病毒和鳥類成骨髓瘤病毒。
[0030] 在DNA聚合酶的內(nèi)容中，"對應"于另一個序列（例如，序列中的區(qū)域、片段、核巧酸 或氨基酸位置)是基于根據(jù)核巧酸或氨基酸位置編號的轉化，然后W最大化序列同一性的 方式來比對序列。因為不需要給定的"相應區(qū)域"內(nèi)的全部位置是相同的，相應區(qū)域內(nèi)的非 匹配位置可W認為是"相應位置"。因此，如本文中使用的，設及特定DNA聚合酶的"對應于氨 基酸位置[X]的氨基酸位置"是指基于比對的其他DNA聚合酶和聚合酶家族中的相等位置。
[0031] 兩個或更多個核酸或多膚序列內(nèi)容中的術語"同一的"或"同一性"或百分比同一 性是指相同的兩個或更多個序列或子序列。在比較窗口內(nèi)針對最大對應進行比較和比對， 或將區(qū)域指定為按照使用W下序列比較算法之一測量的或通過人工比對和視覺觀察時，如 果具有相同的核巧酸或氨基酸殘基的特定百分比（例如，特定區(qū)域內(nèi)至少60%、至少65%、 至少70%、至少75 %、至少80%、至少85 %、至少90%或至少95 %同一性），則序列是彼此"基 本上同一的"。運些定義也設及測試序列的補體。
[0032] 在兩個或更多個多膚序列的內(nèi)容中，術語"相似性"或巧分比相似性"是指在比較 窗口內(nèi)針對最大對應進行比較和比對，或將區(qū)域指定為按照使用W下序列比較算法之一測 量的或通過人工比對和視覺觀察時，具有特定百分比的相同或通過保守性氨基酸置換限定 的相似的氨基酸殘基的兩個或更多個序列或子序列（例如，特定區(qū)域內(nèi)60%相似性，任選 65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %相似）。如果彼此為至少20 %、至少25 %、至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或至少55%相似，則序列彼此是"基本上相 似的"。
[0033] 如本文中使用的，"比較窗口"包括參考選自20至600,通常約50至約200,更通常約 100至約150的任一個數(shù)目的連續(xù)位置的區(qū)段，其中在兩個序列最佳比對后，可W將一個序 列與相同數(shù)目的連續(xù)位置的參照序列進行比較。用于比較的序列比對方法是本領域熟知 的。例如，可W通過Smith和Waterman (Adv. A卵1 .Math. 2:482,1970)的局部同源性算法，通 過化edleman和WunschQ.Mol. Biol. 48 :443，1970)的同源性比對算法，通過Pearson和 Lipman(Proc.化tl. Acad. Sci . USA 85:2444，1988)的相似性捜尋方法，或通過運些算法的 計算機實施，例如，BLAST、BLASTN、GAP、肥STFIT、FASTA和TFASTA，或通過人工比對和視覺觀 察（參見，例如，Ausubel等，Qirrent Protocols in Molecular Biology(1995增補）），來進 行用于比較的序列的最優(yōu)比對。
[0034] 術語"或巧叉點'值，或"Ct值"或"闊值循壞'值可互換使用，是指允許輸入祀 標核酸定量的值。例如，可W根據(jù)二階導數(shù)最大值方法來確定Ct值，參見Van Luu-The等 (2005)，Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second deriv曰tive c曰Iculstion 曰nd double correction,BioTechniques,38： 287。
[0035] 術語"PCR效率"是指用于完全匹配的引物模板的循環(huán)至循環(huán)擴增效率的指示。使 用等式：％PCR效率=(l〇r^)-l) X 100，針對每個條件計算PCR效率，其中使用y-軸上繪制 的對數(shù)拷貝數(shù)和X-軸上繪制的Ct，通過線性回歸來計算斜率。
[0036] 本發(fā)明包括具有寡核巧酸形式的DNA聚合酶的可逆抑制劑。具體地，所述寡核巧酸 是包括一個或多個脫氧尿巧(加)核巧酸的DNA寡核巧酸（即，由脫氧核糖核酸組成）（含加的 抑制劑寡核巧酸）。寡核巧酸的序列能夠形成包括一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的二級結 構。寡核巧酸在環(huán)境溫度條件下在常見的反應混合物(例如，PCR混合物）中形成穩(wěn)定的二級 結構。根據(jù)本發(fā)明，在雙鏈二級結構區(qū)域內(nèi)放置一個或多個尿喀晚。本發(fā)明的寡核巧酸的抑 制特性不依賴于確切的核巧酸序列，而是依賴于由序列形成的二級結構的構象或形狀和該 結構的解鏈溫度(Tm)。在低于Tm的溫度下，例如，在常見反應混合物的環(huán)境溫度下，寡核巧酸 采用的形狀允許其形成寡核巧酸-酶復合物。寡核巧酸可逆地抑制聚合酶，同時與寡核巧 酸-酶復合物中的酶結合。
[0037] 已經(jīng)顯示出引入非天然核巧酸可W影響由寡核巧酸形成的二級結構的形成和Tm (并且因此影響其穩(wěn)定性），并且因此影響其抑制特性。為此，已經(jīng)修飾DNA寡核巧酸來含有 核糖核巧酸、核巧酸類似物、具有非常規(guī)堿基的核巧酸、非核巧酸接頭或其組合。（對于抑制 劑寡核巧酸中的運種非天然核巧酸的描述，參見，例如，美國專利No. 6，183，679)。本領域技 術人員可W設計具有適用于特定酶的解鏈溫度和形狀的抑制劑寡核巧酸(包括本發(fā)明的含 加-抑制劑寡核巧酸）。
[0038] 在一些實施方案中，通過在現(xiàn)有適體NTQ21-46A(也稱為UOKSEQ ID N0:1)中用尿 喀晚替代一個或多個胸腺喀晚來設計含加-抑制劑寡核巧酸。
[0039] 日 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3 '。
[0040] 在運個實施方案的變化中，含加-抑制劑寡核巧酸是W下序列之一：
[0041 ] Ul(沈Q ID NO:2)
[0042] 日 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3 '
[0043] 肥(沈Q ID N0:3)
[0044] 5 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3 '
[0045] U3(沈Q ID N0:4)
[0046] 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3 '
[0047] 適體NTQ21-64A化0) W及Ul、U2和U3的預測二級結構顯示于圖I中。
[0048] 本領域技術人員可W通過用尿喀晚替代胸腺喀晚或通過在寡核巧酸內(nèi)（例如，在 SEQ ID N0:1中）的任何其他位置或在另一個已知或新的抑制劑寡核巧酸的序列中引入尿 喀晚，而容易地設計相似的含加抑制劑寡核巧酸。
[0049] W下實例描述了本發(fā)明的方法應用于可逆地抑制來自棲熱菌種Z05的DNA聚合酶 (公開于國際公開NO.W01992/06200中）。然而，該方法同樣適用于其他DNA聚合酶。X-射線晶 體結構的分析掲示了來自不同生物體的DNA聚合酶折疊成相似的S維結構。DNA聚合酶的整 體折疊模式表示人右手并且含有=個截然不同的亞結構域，稱為"手掌"、"手指"和"拇指" (參見Beese等，（1993) ,Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA,Science 260:352;Patel等，（1995)，Insights into DNA polymerization mechanisms from structure and function analysis of HIV-I reverse transcriptase，Biochemishy 34:5351)。盡管手指和拇指亞結構域的結構在大小和細胞 功能不同的聚合酶之間有很大不同，但催化性手掌亞結構全部是重疊的 (superimposable)。例如，基序A,其與引入的dNTP相互作用并在化學催化過程中穩(wěn)定過渡 態(tài)，與哺乳動物POla和原核POl I家族DNA聚合酶中的約一 A的平均偏差重疊（Wang等， (1997)，Crystal structure of a pal alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69，Cell 89:1087) eDNA聚合酶活性位點的一級氨基酸序列特別保 守。例如，在基序A的情況中，序列DYSQIELR(SEQ ID N0:6)保留在通過數(shù)百萬年進化分離的 生物體的聚合酶中，所述生物體包括，例如，水生棲熱菌、沙眼衣原體（C h 1 a m y d i a trachomat i S)和大腸桿菌。
[0050] 在一些實施方案中，可W設計根據(jù)本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸，并且可W使用本 文公開的寡核巧酸序列并進一步優(yōu)化來相似地可逆地抑制其他熱穩(wěn)定性或熱活性DNA聚合 酶，例如，來自海棲熱袍菌、水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、黃棲熱菌、絲狀棲熱菌、棲熱菌種 SpslTJhermus caldophilus、熱堅芽抱桿菌、那不勒斯棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌的DNA聚 合酶或與其至少95 %相同的DNA聚合酶。
[0051] -般地說，根據(jù)本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸可W設計成相似地可逆地抑制其他 熱穩(wěn)定性或熱活性酶，如連接酶、螺旋酶和核酸酶(包括DNA聚合酶的核酸酶活性）。用于運 些酶的可逆寡核巧酸抑制劑已經(jīng)描述于，參見，例如，美國專利N〇.8,470,531。運些寡核巧 酸抑制劑可W變成本發(fā)明的含U寡核巧酸抑制劑，W得益于本文中所述的改善的特性。
[0052] 在一些實施方案中，本發(fā)明是一種設計核酸聚合酶的可逆抑制劑的方法，包括設 計具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至 少一個尿喀晚堿基。
[0053] 可W使用美國專利No.6,183,679中所述的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX) 的體外選擇程序來設計和優(yōu)化本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸。簡而言之，在SELEX方法中，將 具有不同序列的寡核巧酸的混合物接觸祀標，例如，酶。將結合祀標的寡核巧酸的混合物分 級、擴增并接受另一輪的選擇，直至鑒定出少量對祀標具有最大親和力的寡核巧酸。
[0054] 可W通過任何合適的方法，例如，通過N a r a n g等（1 9 7 9 )的憐酸S醋法， Meth . Enzyml. 68 : 90-99 ; Brown(1979)等的憐酸二醋法，Meth . Enzyml. 68 :109-151; Beaucage(1981)等的二乙基亞憐酷胺法，Tetrahedron Lett. 22:1859-1862;Matteucci (1981)等的S醋法，J. Am. ^em. Soc. 103:3185-3191的直接化學合成;任一種自動化合成方 法;或美國專利齡.4,458,066的固態(tài)支持法，來制備本發(fā)明的含巧巧制劑寡核巧酸。
[0055] 在一些實施方案中，阻斷含巧巧制劑寡核巧酸的3'-端，W防止通過DNA聚合酶的延 伸。在一些實施方案中，將阻斷基團(化學部分)添加至寡核巧酸中的末端3'-OH或2'-OH。阻 斷基團的一些非限制性實例包括烷基、非核巧酸接頭、憐酸醋基團、PhosphotMoate基團、 鏈燒-二醇部分或氨基。在其他實例中，通過用氨替代氣或通過醋、酷胺、硫酸醋或糖巧的形 成，來修飾3 '-徑基基團。在還另一個實例中，用氨替代3 '-OH基團（W形成二脫氧核巧酸）。
[0056] 在其他實施方案中，本發(fā)明是一種通過含加抑制劑寡核巧酸調(diào)節(jié)DNA聚合酶抑制 的方法。本發(fā)明的寡核巧酸含有尿喀晚。DNA序列中尿喀晚的存在使得寡核巧酸成為尿喀晚 DNA糖基化酶的祀標。運些酶識別單鏈或雙鏈DNA中存在的尿喀晚，并裂解尿喀晚堿基和脫 氧核糖之間的N-糖巧鍵，留下無堿基位點，參見，例如，美國專利No. 6，713，294。尿喀晚-DNA 糖基化酶，縮寫為"UD護或"UN護，包括UNG化C 3.2.2.3 )、線粒體UNG1、核UNG2、SMUG1 (單鏈-選擇性尿喀晚-DNA糖基化酶）、TDG (TU錯配DNA糖基化酶）、MBD4 (具有甲基結合結構域的尿 喀晚-DM糖基化酶）W及其他真核和原核酶(參見Krokan H.E.等（2002) ,Uracil in DM- occurrence,consequences and repair,Oncogene 21:8935-9232)。
[0057] 因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，反應混合物不再需要加熱至超過抑制性寡核巧酸的Tm 的溫度，W便拆開其二級結構并在寡核巧酸-酶復合物中釋放酶的抑制作用。替代地，含有 本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸的反應混合物接觸一種尿喀晚-N-糖基化酶，如例如，UNG。方 便地，UNG在標準PCR反應混合物中是有活性的。運能夠將UNG添加至裝配的PCR反應或甚至 添加至PCR預混液(mastermix)中。在熱循環(huán)開始前，將反應混合物在PCR預混液范圍內(nèi)對 UNG活性最佳的溫度(約50°C )或UNG有活性的溫度范圍內(nèi)解育反應混合物。UNG將裂解含加 抑制劑寡核巧酸中的尿喀晚，留下無堿基位點。已知具有無堿基位點的DNA的主鏈是不穩(wěn)定 的，尤其是在高pH條件下的高溫下。根據(jù)本發(fā)明，從UNG裂解得到的一個或多個尿喀晚并且 因此得到的一個或多個無堿基位點位于雙鏈二級結構的區(qū)域中，所述結構將在裂解時W及 隨后的主鏈裂解時拆開。
[0058] 在一些實施方案中，該方法進一步包括將反應混合物接觸聚胺，如例如，亞精胺、 精胺和=亞甲基二胺，如美國申請2010/0093041中所述的。在一些實施方案中，聚胺是間插 胺。運組聚胺具有插入部分，能夠插入核酸中的堿基對或堿基之間。聚胺上的插入部分的實 例包括芳控和聚芳控，如糞和蔥釀。在一些實施方案中，間插部分自身也可W被一個或多個 聚胺側鏈取代。聚胺的添加已經(jīng)顯示出有助于從UNG裂解得到的無堿基DNA的降解。特別是 在50°C下，降解提高1000倍。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的方法，含U抑制劑寡核巧酸在低于之前所述的寡核巧酸抑制劑的溫 度下可W從穩(wěn)定的二級結構轉變成拆開的結構。運一特征對于設及在釋放酶抑制作用需要 的溫度下在常見的反應混合物中不穩(wěn)定的RNA模板的反應混合物和方法中尤為有益。在較 低溫度下的抑制作用的釋放將通過提高可用模板的含量來提高RT-PCR的逆轉錄步驟的效 率。
[0060] 通常，本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸可W用于其中需要DNA聚合酶的可逆抑制的任 何方法中。例如，寡核巧酸可W用于DNA測序、DNA或RNA擴增、逆轉錄、逆轉錄PCR( RT-PCR)或 引物衍生中，例如，用于通過單核巧酸引物延伸檢測單核巧酸多態(tài)性中。
[0061] 在一些實施方案中，本發(fā)明是一種擴增和任選檢測祀標核酸序列的方法，包括將 反應混合物(任選含有除了DNA聚合酶W外的PCR所有組分的PCR反應混合物）中的樣品接觸 DNA聚合酶和含U抑制劑寡核巧酸形式的可逆DNA聚合酶抑制劑。在運個實施方案的變化中， 該方法進一步包括用尿喀晚-N-糖基化酶接觸并解育反應混合物。在運個實施方案的變化 中，該方法進一步包括隨后同時用聚胺解育反應混合物，所述聚胺任選選自亞精胺、精胺或 =亞甲基二胺。解育可W在40-65°C下進行，或在40、45、55、60或65°(：中的任一個溫度或其 中的任一個溫度下進行，例如，在50°C下進行。該方法進一步包括通過PCR擴增和任選檢測 祀標核酸。
[0062] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于擴增祀標核酸的反應混合物，其含有核酸 聚合酶的可逆抑制劑，所述可逆抑制劑包括本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸，其是具有一個或 多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少一個尿喀晚 堿基。反應混合物進一步含有尿喀晚-N-糖基化酶，如UNG。反應混合物優(yōu)選進一步含有聚 胺，任選選自亞精胺、精胺或=亞甲基二胺。在運個實施方案的進一步變化中，試劑盒還包 括用于PCR或RT-PCR的試劑，包括不限于，核酸前體(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核巧酸（引物和 任選，探針)和適用于支持酶活性的緩沖劑。在一些實施方案中，祀標核酸是RNA。在一些實 施方案中，聚合酶酶選自來自海棲熱袍菌、水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、黃棲熱菌、絲狀棲熱 菌、棲熱菌種59317、棲熱菌種205、化61'111118〇31(1〇911；[1113、熱堅芽抱桿菌、那不勒斯棲熱袍 菌和非洲棲熱腔菌的DNA聚合酶。在一些實施方案中，聚合酶是來自棲熱菌種Z05或嗜熱棲 熱菌的DNA聚合酶。
[0063] 在還另一個實施方案中，本發(fā)明是用于擴增祀標核酸的試劑盒，其含有核酸聚合 酶的可逆抑制劑，所述抑制劑包括本發(fā)明的含U抑制劑寡核巧酸，其是具有一個或多個雙鏈 二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核巧酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少一個尿喀晚堿基。試劑 盒進一步含有尿喀晚-N-糖基化酶，如UNG。試劑盒優(yōu)選進一步含有聚胺，任選選自亞精胺、 精胺或S亞甲基二胺。在運個實施方案的進一步變化中，試劑盒還可W包括用于PCR或RT-PCR的試劑，包括不限于，核酸前體(dNTP或NTP)、聚合酶、寡核巧酸（引物和任選，探針)和適 用于支持酶活性的緩沖劑。在一些實施方案中，聚合酶酶選自來自海棲熱袍菌、水生棲熱 菌、嗜熱棲熱菌、黃棲熱菌、絲狀棲熱菌、棲熱菌種Sp S 1 7、棲熱菌種Z05、Thermus caldophilus、熱堅芽抱桿菌、那不勒斯棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌的DNA聚合酶。在一些實施 方案中，聚合酶是來自棲熱菌種Z05或嗜熱棲熱菌的DNA聚合酶。 實施例
[0064] 實施例1.含巧巧制劑寡核巧酸化-適體)的設計 [00化]現(xiàn)有的適體NTQ21-46A(U0)(沈Q ID N0:1)
[0066] 5 ' -CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3 '，通過用加替代肌， 生成W下適體：
[0067] Ul(沈Q ID NO:2)
[006引 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3 '
[0069] 肥(沈Q ID N0:3)
[0070] 5 '-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3 '
[0071] U3(沈Q ID N0:4)
[0072] 5 '-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3 '
[0073] 適體的預測二級結構顯示于圖I中。
[0074] 實施例2. U-適體的解鏈溫度的確定
[0075] 在含有50mm TrisHCl,P冊.0, IOOmM KCiamM dNTP，2.5mM MgCb, 0.5XSYBR? Green KMolecular P;robes(Life Technologies，Inc. )&;rlsbad，Cal.)，20nM DNA聚合酶 Z05-D(在所示的情況中）和0.適體之一的反應混合物中確定了UO、Ul、U2和U3適體(SEQ ID NO: 1、2、3和4)的解鏈溫度。根據(jù)制造商的說明，在LightCycler?480(Roche Molecular Diagnostics,Indianapolis，Ind.)中進行解鏈曲線分析。結果顯示于表1中。該結果證明用 U替代T降低了寡核巧酸二級結構的解鏈溫度。
[0076] 表1.適體的解鏈溫度
[0077]
[007引實施例3.在UNG存在下的U-適體的解鏈溫度的確定
[00巧]在實施例1中所述的反應混合物中確定了U0、U1、U2和U3適體(SEQ ID N0:l、2、3和 4)的解鏈溫度，除了在所示的情況中，添加了 0.抓/化UNG。為了允許UNG裂解，在解鏈曲線 分析前，將所有反應混合物在37°C下解育。結果顯示于表2中。結果證明了用U替代T并且隨 后用UNG裂解顯著降低了寡核巧酸二級結構的解鏈溫度。
[0080] 表2.用UNG裂解后適體的解鏈溫度
[0081]
[0082] 實施例4.不同溫度下在U-適體和UNG存在下的引物延伸
[0083] 通過在不同濃度的U0、U1、U2或U3適體(SEQ ID N0:l、2、3和4)存在下的引物延伸 來確定寡核巧酸抑制劑存在下的DNA聚合酶活性。使用M13mpl8單鏈DNA(M13;GenBank登錄 號X02513)進行試驗，用具有W下序列（SEQ ID N0:5)的寡核巧酸作為引物：
[0084] 5 '-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC-3 '
[0085] 通過將12.5化的MgCh添加至96-孔PCR平板中的12.5此含有InM引物延伸的M13模 板的反應預混液中來啟動反應。針對所示溫度下LightCyclei@480熱循環(huán)儀上的99個循 環(huán)，每6秒監(jiān)控引物延伸的模板的延伸。預混液含有2.5mM MgCh，50mM Tris P冊.OaOOmM KC1，所有四種 dNTP 的混合物，20nM Z05-D DNA 聚合酶和 0.5xSYBR?Green I(Life Technologies,化rlsbad，化I.)，其允許引物鏈延伸的巧光檢測。測試的適體的濃度范圍為 0、50、200、2000碰，^確保適體^相對于205-0 0魁聚合酶0、2.5、10或100《摩爾超量存在 (參見圖2-5上的圖例）。通過確定隨著線性范圍中的時間增加的巧光的斜率來定量DNA聚合 酶活性。通過標準化至每個溫度下不存在適體進行的所有反應的平均斜率來計算相對活 性。結果顯示于圖2-5中。結果證明了添加 UNG顯著降低了DNA聚合酶的適體抑制，特別是對 于U3d
[0086] 實施例5. U-適體和UNG存在下KRAS密碼子12祀標的實時PCR擴增
[0087] 在運個實施例中，在各種濃度的U0、U1、U2或U3適體(SEQ ID N0:l、2、3和4)的存在 下進行人DNA中的KRAS祀標的擴增。KRAS祀標的性質使其對引物二聚化和非特異性擴增尤 為敏感。在熱啟動不存在的情況下，非特異性擴增遮掩了祀標濃度中的差異并且妨礙了定 量分析。在運個實施例中，添加連續(xù)十倍稀釋的KRAS祀標，W評價該方法的定量范圍和特異 性。擴增在含有3mM MgCl2,50mM Tricine P服.0,55mM醋酸鐘，200yM每種dATP，dCTP和 dGTP，300yM dUTP，30yM dTTP，20nM Z05DNA聚合酶和0.2xSYBR?Green ULife Technologies，Ca;rlsbad，Cal.)，W及在所指示的UNG的反應混合物中進行。Light切cle儀 器中的溫度概況為95°C，15秒，50個循環(huán)，50、55或60°C，40秒。通過測量不同濃度的UO、U1、 U2或U3適體(SEQ ID NO: 1、2、3和4)存在下的Ct值，來檢測擴增。測試適體的濃度范圍為0、 200、1000和2000碰，^確保適體^相對于205-0 0臟聚合酶0、10、100或200義摩爾超量存在。 結果顯示于表3-6中。
[008引表3. KRAS祀標(Ct)的擴增，不含UNG，60 °C 10 X超量適體 [0089]
[i
[i 「mw
[0093] 表3-4中的結果證明了需要適體來基于Ct值確定濃度，并且在60°C下在UNG不存在 下，含U適體(SEQ ID N0:2、3和4)行為與親本適體(SEQ ID N0:1)相似。
[0094] 表5. KRAS 祀標(Ct)的擴增，55 °C
[0095]
[0099]
[0100] 表5-6中的結果證明了在較低退火溫度和提高的適體濃度下，添加 UNG顯著降低了 DNA聚合酶的含加適體抑制，特別是對于U3，如通過較低的Ct值證明。
[0101] 實施例6.在U-適體和UNG存在下的RNA的RTPCR擴增
[0102] 在運個實施例中，在標準PCR條件下，按照實施例5中所述的，在含有UNG的反應混 合物中，在不同濃度的U0、U1、U2或U3適體(SEQ ID N0:l、2、3和4)的存在下，進行RNA祀標 化CV JP2-5,1000個拷貝/反應）的擴增。測試適體的濃度范圍為相對于ZO加 NA聚合酶無、 100倍和200倍摩爾超量。結果顯示于表7中。
[0103] 表7. 55°C下HCVRNA祀標(Ct)的擴增
[0104]
[0105]
[0106] 表7中的結果證明在較低退火溫度(
例如，55°C)下，在UNG存在下的含加適體具有 降低的DNA聚合酶抑制，如通過較低的Ct值證明的。
【主權項】
1. 一種核酸聚合酶的可逆抑制劑，其包括具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈 DNA寡核苷酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少一個尿嘧啶堿基。2. 權利要求1的可逆抑制劑，其中所述雙鏈二級結構在PCR混合物中在環(huán)境溫度下是穩(wěn) 定的。3. 權利要求1或2的可逆抑制劑，其包括SEQ ID NO: 1，其中一個或多個胸腺嘧啶被尿嘧 啶堿基替代。4. 權利要求1-3中任一項的可逆抑制劑，選自SEQ ID N0:2-4。5. -種設計核酸聚合酶的可逆抑制劑的方法，其包括設計具有一個或多個雙鏈二級結 構區(qū)域的單鏈DNA寡核苷酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少一個尿嘧啶堿基。6. 權利要求5的方法，其中使用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(SELEX )，從寡核苷酸的 混合物選擇DNA寡核苷酸。7. -種可逆地抑制反應混合物中的核酸聚合酶的方法，包括將混合物與具有一個或多 個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核苷酸的混合物接觸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少 一個尿嘧啶堿基。8. 權利要求7的方法，其進一步包括將混合物與尿嘧啶-N-糖基化酶接觸。9. 權利要求7或8的方法，其中所述接觸在40-65 °C的溫度范圍中發(fā)生。10. 權利要求7-9任一項的方法，進一步包括將樣品與聚胺接觸。11. 權利要求10的方法，其中所述聚胺選自亞精胺、精胺或三亞甲基二胺。12. -種擴增靶標核酸的方法，其包括在擴增前，將含有所述靶標核酸的混合物與具有 一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核苷酸接觸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少 一個尿嘧啶堿基。13. 權利要求12的方法，進一步包括在擴增前，將樣品與尿嘧啶-N-糖基化酶接觸。14. 權利要求12或13的方法，進一步包括將樣品與聚胺接觸。15. 權利要求14的方法，其中所述聚胺選自亞精胺、精胺或三亞甲基二胺。16. -種用于擴增靶標核酸的試劑盒，其含有（1)核酸聚合酶的可逆抑制劑，其包括具 有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核苷酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至少一 個尿嘧啶堿基；（2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任選選自亞精胺、精胺或三亞甲基二胺。17. -種用于擴增靶標核酸的反應混合物，其含有（1)核酸聚合酶的可逆抑制劑，其包 括具有一個或多個雙鏈二級結構區(qū)域的單鏈DNA寡核苷酸，其中至少一個所述區(qū)域包括至 少一個尿嘧啶堿基；（2)尿嘧啶-N-糖基化酶和(3)聚胺，任選選自亞精胺、精胺或三亞甲基 二胺。
【文檔編號】C12N15/115GK105874069SQ201480069584
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】E·H·菲斯, J·桑菲里普波
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司