高表達外源蛋白的畢赤酵母株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了高表達外源蛋白的畢赤酵母株，它是轉(zhuǎn)染了一種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，所述的表達質(zhì)粒，它是由下述方法制備的：用Bspt104和Sac Ⅱ雙酶切pPICZαA和基因序列為ttcgaaacgCMSYMMatg? 目的基因?ccgcgg所示的基因，連接；序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T，在畢赤酵母AOX啟動子作用下，在報告基因EGFP起始密碼子ATG前面插入6個堿基（CMSYMM），EGFP表達量提高到100?200%。
【專利說明】
高表達外源蛋白的畢赤酵母株
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及在畢赤酵母Α0Χ啟動子作用下高表達外源蛋白 的畢赤酵母株。
【背景技術】
[0002] 畢赤酵母(P.pastoris)，作為一種甲醇誘導型的酵母，可以將甲醇作為唯一的使 用碳源，已經(jīng)成為基因工程生產(chǎn)外源蛋白最重要的工具，與其他表達系統(tǒng)而言，具有很多優(yōu) 點，對于大腸桿菌表達系統(tǒng)而言，既具有操作簡單、生產(chǎn)成本較低、外源蛋白高產(chǎn)量等優(yōu)點， 同時還具有蛋白的翻譯后加工修飾的作用;對于釀酒酵母而言，具有質(zhì)粒表達的穩(wěn)定性高、 表達菌株較穩(wěn)定、分泌效率較高等的優(yōu)點；對于哺乳動物表達系統(tǒng)而言，具有操作簡單，培 養(yǎng)基低廉，生產(chǎn)過程中不易污染的特點;對于昆蟲細胞表達系統(tǒng)而言，具有成本顯著降低的 優(yōu)點。
[0003] 基因的表達調(diào)控在蛋白表達過程中發(fā)揮重要的作用，基因表達分為DNA轉(zhuǎn)錄成RNA 和RNA翻譯成蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄是基因表達的初始階段，在這個階段進行調(diào)控，對于生物來說是 最為經(jīng)濟的。真核生物中，基因調(diào)控也是主要在轉(zhuǎn)錄水平上進行的。通過順式作用元件和反 式作用因子的相互作用實現(xiàn)了真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。生物體基因調(diào)控主要發(fā)生在這些順式 作用元件上，如啟動子、GC盒、CCAAT盒、增強子、沉默子、阻遏子，最近發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG周 圍堿基影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，影響最終蛋白的產(chǎn)量。
[0004] 大量的實驗結(jié)果表明起始密碼子ATG周圍序列對蛋白表達有不同程度的影響。 Tatematsu，K.，et al.在2014年發(fā)表的文章中研究了家蠶中的起始密碼子ATG周圍的序 列對重組蛋白表達量的影響。文章中比較了 50種家蠶的自身基因，發(fā)現(xiàn)AAAAATCAAAATGG序 列影響轉(zhuǎn)錄效率，之后他們利用EGFP和熒光素酶作為報告基因，構(gòu)建了 8種由不同的序列組 成的質(zhì)粒，這些序列長度為包括ATG在內(nèi)的14個堿基，發(fā)現(xiàn)這些序列對基因轉(zhuǎn)錄和蛋白產(chǎn)量 有顯著影響，并且具有組織特異性。Dai，C.，et al.在2007年發(fā)表的文章中報道:他們將 鉀離子通道蝎毒素基因插入到pEGFP-ΝΙ真核表達載體的EGFP前面，并在融合蛋白的起始密 碼子ATG前插入了Kozak序列GCCACC，發(fā)現(xiàn)插入Kozak序列GCCACC使得融合蛋白的表達量大 大升高，而未插入Kozak序列的基本上沒有表達。Sano KI et al在2002年的文章中報道他 們在熒光素基因以及龍蝦原肌球蛋白的起始密碼子ATG前面插入了龍蝦原肌球蛋白cDNA的 ATG前21個氨基酸，發(fā)現(xiàn)能顯著的提高這兩種蛋白的表達量。這些報道證明ATG周圍序列對 于基因的表達具有極大的影響，但是目前尚未有人對畢赤酵母A0X1啟動子介導下ATG周圍 序列對基因表達的影響進行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了提高外源基因畢赤酵母表達系統(tǒng)蛋白的表達量，而提供一種 在畢赤酵母Α0Χ啟動子作用下，高表達外源蛋白的畢赤酵母株。
[0006] -種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，它是由下述方法制備的：用Bsptl04和Sac Π 雙 酶切pPICZaA和基因序列為ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，連接； 序列表中所述的 CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T; 所述的 CMSYMM 為:CCCGCC、CCCCCC、CCCGAA、CAGTGC、CATAGT 或 AACCCC; 所述的基因序列為SEP ID NO.6。
[0007] 高表達外源蛋白的畢赤酵母株，它是轉(zhuǎn)染了上述的一種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì) 粒。
[0008] 本發(fā)明提供了高表達外源蛋白的畢赤酵母株，它是轉(zhuǎn)染了上述的一種畢赤酵母表 達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，所述的表達質(zhì)粒，它是由下述方法制備的：用Bspt 104和Sac Π 雙酶切 pPICZaA和基因序列為ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，連接;序列表 中所述的CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T，在畢赤酵母Α0Χ啟動子作用下，在報告基 因 EGFP起始密碼子ATG前面插入6個堿基(CMSYMM)，EGFP表達量提高到100-200%。
【附圖說明】
[0009] 圖 1 EcoRI和Sacn 雙酶切重組質(zhì)粒pPICZaA-EGFP電泳圖（1:DNA Marker DL2000; 2:酶切前的重組質(zhì)粒pPICZaA-EFGP; 3:酶切后的重組質(zhì)粒）； 圖2 PCR法篩選EGFP陽性轉(zhuǎn)化菌株1:DNA分子標識物lOObp; 2-13:部分克隆酵母基因 組PCR產(chǎn)物； 圖3普通視野和熒光視野下陰性(X-33)菌體的EGFP熒光檢測，Scale bars: 15 mm; 圖4普通視野和熒光視野下陽性克隆的菌體的EGFP熒光檢測，Scale bars: 15 mm; 圖5普通視野和熒光視野下陰性(X-33)菌體的EGFP熒光檢測，Scale bars: 15 mm; 圖6普通視野和熒光視野下陽性克隆上清的EGFP熒光檢測，Scale bars: 15 mm。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1重組質(zhì)粒PPICZaA-EGFP的構(gòu)建 根據(jù)EGFP-pcDNA3.1質(zhì)粒上EGFP基因序列（基因序列如SEP ID N0.1所示）及引物設計 原則，設計引物，PCR引物中引入了酶切位點EcoR I和Sac Π 。
[0011 ]上游引物：5'- gctgaattCatggccaccatggtgagc _3' 下游引物：5'_ CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg -3' PCR反應體系為
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
將上述PCR反應得到的EGFP基因片段經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，然后將PCR片段 和載體pPICZaA用EcoRI和SacII酶切消化，分別將消化后的質(zhì)粒和PCR片段用UNIQ-10柱式 微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠純化回收，瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果后，用T4 DNA連 接酶16 °C過夜連接。連接體系為：
將連接產(chǎn)物用熱激轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在LB+Zeocin平 板上篩選，挑取單菌落，培養(yǎng)擴增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0試劑盒提取質(zhì)粒DNA，將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sac Π 37 °C過夜消 化，產(chǎn)物取2μ1進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。如圖1所示，將酶切鑒定質(zhì)粒送金唯智生物科 技(北京)有限公司測序，序列如SEQ ID NO. 2所示(序列左側(cè)為EcoR I，右側(cè)為SacII)，最終 將序列正確的菌株標記為pPICZaA-EGFP。
[0012] 實施例2重組質(zhì)粒pPICZaA-EGFP-1的構(gòu)建 根據(jù)a信號肽序列和EGFP序列設計一對引物，并在上游引物中引入Pst I限制性內(nèi)切酶 酶切位點，下游引物使用與構(gòu)建pPICZaA-EGFP相同的引物。
[0013] 引物1:5 ' - GCTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT-GCAGTTTTATTCGCAGCATC-3 ' 引物2:5'- CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg _3' PCR反應體系為：
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
擴增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后純化回收，得到突變出Pst I酶切位點的PCR片 段，將上述反應得到的突變片段和載體pPICZaA用Bsptl041和SacII消化，酶切產(chǎn)物用瓊脂 糖凝膠電泳驗證后，按照UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠純化回收，瓊 脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果后，用T4 DNA連接酶16°C過夜連接。連接體系為：
轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在LB+Zeocin平板上篩選，挑取單菌落，培養(yǎng)擴增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒提取質(zhì)粒DNA，送金唯智生物科技(北京）有限 公司測序，測序正確的標記為pPICZαA-EGFP-l，序列如SEPIDN0.3所示。
[0014] 實施例3重組質(zhì)粒pPICZaA-EGFP-n的構(gòu)建 提取質(zhì)粒pPICZaA-EGFP-Ι，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗證質(zhì)粒的質(zhì)量，用Bspt 104 I和 Pst I雙酶切質(zhì)粒pPICZaA-EGFP-1，瓊脂糖凝膠電泳驗證后進行膠純化回收雙酶切產(chǎn)物； 同時將兩條含有6個隨機堿基的短寡核苷酸單鏈用退火緩沖液（10mM Tris pH8.0，50mM NaCl，ImM EDTA)稀釋成濃度lOOpmol/yL的溶液，各取10yL與EP管仲，在水浴鍋中95°C高溫 變性5 m i η，自然緩慢冷卻至室溫，用T 4 D N A連接酶連接到膠回收產(chǎn)物上，得到重組質(zhì)粒 pPICZaA-EGFP-n， 短寡核苷酸單鏈序列為： 引物 1:5 ' - CGAAACGNNNNNNATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCA-3 ' 引物 2:5 ' -GTAAAAATTGAAGGAAATCTCATNNNNNNCGTTT-3 ' 連接體系如下：
16°C恒溫水浴槽中過夜連接反應，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞中，在 LB+Zeocin平板上篩選，刮下平板上所有菌體，用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0試劑盒提取質(zhì)粒DNA，成功獲得重組質(zhì)粒庫pPICZaA-EGFP-n。
[0015] 實施例4酵母菌株的轉(zhuǎn)化 用限制性內(nèi)切酶SacI將質(zhì)粒庫pPICZaA-EGFP-n過夜消化，獲得線性化的DNA，按照 invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊的點轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到山梨醇法制備的感受態(tài)酵母細胞 中，在YPD+Zeocin平板上篩選，將生長出的酵母轉(zhuǎn)化子采用CTAB法提取酵母基因組DNA，采 用PCR法對菌株進行鑒定，使用引物如下： 引物 1: GGGCGAGGAGCTGTTCAC 引物2: TCGTTGGGGTCTTTGCTC PCR反應體系為：
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
PCR后約獲得630bp長度片段，結(jié)果如圖2所示，序列如SEP ID N0.4所示。
[0016] 實施例5起始密碼子ATG前插入的六個堿基序列測定 起始密碼子ATG前插入的六個堿基的具體序列，通過PCR結(jié)合測序的方法進行測定。取 提取的酵母基因組DNA為模板，使用如下引物： 引物1:5 '-ttctaacccctacttgacagca-3 ' 弓丨物2:5 '- gaacttcagggtcagcttgc-3 ' PCR反應體系為：
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
PCR后約獲得612bp長度片段，將PCR產(chǎn)物直接送金唯智生物科技(北京)有限公司用引 物1進行序列測定，序列如SEP ID NO.5所示。（插入序列每個克隆不一樣，所以插入的六個 喊基用NNNNNN標識）。
[0017] 實施例6起始密碼子ATG前插入的不同序列對EGFP的表達量及mRNA水平的影響 EGFP在激發(fā)光波長為488nm的藍光或紫外光激發(fā)下，會產(chǎn)生不同強度的綠色熒光，用蔡 司焚光顯微鏡觀察未插入任何序列的EGFP和插入不同序列的陽性克隆的菌體的焚光，放大 倍數(shù)為40倍，如圖3-6,圖3和圖5為陰性對照，我們沒有觀察到熒光。圖4陽性克隆的酵母菌 體在熒光顯微鏡下觀察到布滿綠色熒光，證明陽性菌株表達了綠色熒光蛋白，圖6陽性克隆 的細胞培養(yǎng)液離心后上清液中觀察到綠色熒光，證明菌株表達的綠色熒光蛋白分泌到細胞 外的培養(yǎng)基中。
[0018] 用酶標儀VICT0R3V 1420-012測定在ATG周圍插入序列及未插入任何序列的EGFP 在488nm紫外光激發(fā)下的熒光值。插入序列的熒光值為陽性克隆的熒光值減去陰性對照組 的熒光值;變化率的計算方法為插入序列的熒光值減去未插入任何序列的熒光值的差值再 除以未插入任何序列的熒光值。
[0019] 使用Takra公司的試劑RNAiso Plus提取酵母總RNA，PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著采用熒光定量PCR法監(jiān)測mRNA的表達水平，選擇 ACT1為內(nèi)參基因，EGFP為靶基因，設計擴增引物，每個陽性克隆平行做4組，通過ABI公司的 Step One Plus熒光定量PCR儀處理數(shù)據(jù)得到不同克隆的EGFP相對內(nèi)參基因表達量的比值 RQ值，熒光強度變化率的模式大小基本與RQ值變化基本一致。
[0020] 熒光強度變化率如表1所示。
[0021] 內(nèi)參基因 ACT1引物 引物1:5'- ATGGACGGAGTCATTGGTGGAGC -3' 引物2:5'- CTACCTACGACCGATGGGAACAC -3' EgFP表達量引物 引物1:5'_ CGACAAGCAGAAGAACGGCATCA _3' 引物2:5'- GAACTCCAGCAGGACCATGTGAT -3' PCR反應體系為：
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：


根據(jù)表1中ATG前插入的序列及熒光值變化率分析總結(jié)得出ATG前插入序列中A、T、C、G 出現(xiàn)的頻率表。（C=C; M=A/C; R=A/G; W=A/T; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; H=A/C/T; D=A/G/T; B=G/C/ T；N=A/G/C/T) 表2顯著增強序列中A，T，C，G出現(xiàn)的頻率表
表3中等程度增強序列中A，T，C，G出現(xiàn)的頻率表
表4低程度增強序列中A，T，C，G出現(xiàn)的頻率表
表5降低序列中A，T，C，G出現(xiàn)的頻率表
在ATG前面插入6個隨機堿基，熒光值及變化率如表1，將變化率高于100%的定義為顯著 增強EGFP的表達量，序列特征為CMSYMM;將變化率在50-100%的定義為中等程度增強EGFP的 表達量，序列特征為RHSDYC;將變化率在0-50%的定義為低程度的增強EGFP的表達量，序列 特征為CMBNCB;將變化率降低的定義為降低EGFP的表達量，序列特征為KWBKTN。
[0022] mRNA水平分析：以未插入任何序列的EGFP作為對照組，將其RQ值默認為1，得到在 ATG前面插入序列的不同陽性克隆的RQ值，根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)可以看出，mRNA表達量的高低 基本上與改造后的EGFP熒光強度變化一致，這說明，在ATG前面插入的序列是通過影響了 EGFP的轉(zhuǎn)錄，使得mRNA的水平發(fā)生改變，進而影響了蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)量，實現(xiàn)了基因的表達 調(diào)控。
[0023] 實施例7高表達EGFP酵母菌株的構(gòu)建 根據(jù)pPICZaA-EGFP-1質(zhì)粒上序列特征設計引物，在表達EGFP基因的菌株α信號肽序列 的起始密碼子前插入序列CCCGCC，且在該引物中引入了酶切位點Bsptl04和Sac Π 。
[0024]引物1:5，- GCTTCGAAACGCCCGCCATGAGATTTCCTTC 引物2:5'- CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg _3' PCR反應體系為
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
將上述PCR反應得到的帶有六個增強基因表達的序列CCCGCC的PCR片段段經(jīng)過0.8%的 瓊脂糖凝膠電泳驗證，并將載體pPICZaA及PCR產(chǎn)物用Bsptl04和SacII酶切消化，分別將消 化后的質(zhì)粒和PCR片段用UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行膠純化回收，瓊 脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果后，用T4 DNA連接酶16°C過夜連接。連接體系為：
將連接產(chǎn)物用熱激轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞中，在LB+Zeocin平 板上篩選，挑取單菌落，培養(yǎng)擴增后用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0試劑盒提取質(zhì)粒DNA，將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Bsptl04和Sac Π 37°C過夜消 化，產(chǎn)物取2μ1進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。將酶切鑒定質(zhì)粒送金唯智生物科技(北京)有 限公司測序，序列如SEQ ID如.6所示(序列左側(cè)為8叩丨104，右側(cè)為3&(：11)，最終將序列正 確的菌株標記為pP I CZa A-EGFP-2。
[0025]接著用限制性內(nèi)切酶SacI將質(zhì)粒庫pPICZaA-EGFP-2過夜消化，獲得線性化的DNA， 按照inv i trogen公司的畢赤酵母表達手冊的點轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到山梨醇法制備的感受態(tài)酵母 細胞中，在YPD+Zeocin平板上篩選，將生長出的酵母轉(zhuǎn)化子采用CTAB法提取酵母基因組 DNA，采用PCR法對菌株進行鑒定，使用引物如下： 引物 1: GGGCGAGGAGCTGTTCAC 引物2: TCGTTGGGGTCTTTGCTC PCR反應體系為：
在PCR儀上進行擴增反應。擴增程序為：
PCR后約獲得630bp長度片段。
[0026] 選擇陽性轉(zhuǎn)化子，在30°C，220轉(zhuǎn)，BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，離心收集菌體，用 BMMY培養(yǎng)基重懸繼續(xù)誘導培養(yǎng)，第二天起，每天按照每10ml培養(yǎng)液加入甲醇50yL量加入甲 醇繼續(xù)誘導，第四天，對選擇的每個酵母目的基因 EGFP表達量進行測定，最終得到高水平表 達EGFP的酵母菌株。
[0027] 其余構(gòu)建在起始密碼子ATG前添加增強基因表達的序列CCCGAA;CAGTGC;CATAGT; AACCCC; CTGACA等序列的酵母菌株的方法與加入CCCGCC的方法相同。
【主權(quán)項】
1. 一種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，其特征在于，它是由下述方法制備的：用Bspt 104 和Sac Π 雙酶切pPICZaA和基因序列為ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因 -ccgcgg所示的基 因，連接，序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C，M=A/C，S=G/C，Y=C/T。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，其特征在于：所述的 CMSYMM為CCCGCC、CCCCCC、CCCGAA、CAGTGC、CATAGT或AACCCC。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種畢赤酵母表達系統(tǒng)表達質(zhì)粒，其特征在于:所述的基因 序列為SEP ID NO.6所示。4. 高表達外源蛋白的畢赤酵母株，它是轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求1所述的一種畢赤酵母表達系 統(tǒng)表達質(zhì)粒。
【文檔編號】C12R1/84GK105886525SQ201610468884
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月25日
【發(fā)明人】張新民, 滕思瑩
【申請人】吉林大學