果膠裂解酶優(yōu)化基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及果膠裂解酶基因，尤其設(shè)及經(jīng)過優(yōu)化后的果膠裂解酶基因W及含有優(yōu) 化基因的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞，還設(shè)及它們?cè)谥苽涔z裂解酶中的應(yīng)用，屬于果 膠裂解酶領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠裂解酶(pectin lyase,EC 4.2.2.10)能夠特異地催化高醋化度果膠降解。通 過反式消去方式在果膠C-4位置處斷裂糖巧鍵，同時(shí)從C-5處消去一個(gè)氨原子，生成含不飽 和鍵的產(chǎn)物。果膠裂解酶是果膠酶中唯一一種能夠降解高醋化度果膠且不產(chǎn)生甲醇的酶 類，根據(jù)酶作用底物環(huán)境的酸堿性，可分為酸性果膠裂解酶和堿性果膠裂解酶兩類。其廣泛 地應(yīng)用于食品工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙業(yè)、含果膠類物質(zhì)的污水處理等（Y a d a V，S . e t al.Pectin lyase:A review.Proc Biochem,2009,44(1),1-10.)。
[0003] 果汁中含有豐富的維生素、酸分和無機(jī)鹽等人體所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著人們對(duì) 健康飲食的注重，果汁受到人們的喜愛，果汁市場(chǎng)規(guī)模不斷地?cái)U(kuò)大。但是在果汁生產(chǎn)中，由 于水果富含大量的果膠和纖維素等物質(zhì)，經(jīng)壓棒后的果漿非常粘稠，導(dǎo)致果汁的壓棒率低 且所得果汁難W澄清，是阻礙果汁生產(chǎn)的一大難題。傳統(tǒng)工藝中的處理方法不僅耗費(fèi)人力 財(cái)力，而且易造成高能耗、二次污染等問題。近年來人們通過使用酶處理法，添加果膠酶來 解決果汁生產(chǎn)中的問題。在果汁生產(chǎn)過程中添加果膠酶能夠有效的降低果漿粘稠度，果汁 的產(chǎn)量會(huì)大幅增加，比傳統(tǒng)的機(jī)械方法相比不僅所得果汁產(chǎn)量增加，果汁的感官得到改善 而且更多水果中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得W保留。果膠裂解酶作為果膠酶的一種也被應(yīng)用在果汁的生 產(chǎn)中。將真菌化nicillium e邱ansum F16來源的果膠裂解酶純化后，用來處理蘋果汁、葡萄 汁等，其能夠有效地澄清運(yùn)些果汁，提高果汁光穿透率，并對(duì)其處理的果汁進(jìn)行甲醇檢測(cè)， 沒有測(cè)到甲醇等有害物質(zhì)的存在。
[0004] 在紡織業(yè)中所用的果膠裂解酶為堿性果膠酶，主要用于棉麻紡織品的脫膠。傳統(tǒng) 堿法處理過程中產(chǎn)生的廢水中含有高COD、高B0D、高抑、高鹽分等，產(chǎn)生高能耗、二次污染等 不利因素，但經(jīng)酶處理所得的紡織品往往能夠避免運(yùn)些缺陷，且其產(chǎn)品吸水率高、易染色、 手感更好。有報(bào)道用果膠酸裂解酶來處理棉纖維，并對(duì)酶處理后的棉纖維的物理化學(xué)性質(zhì) 做了研究，所得纖維可濕潤(rùn)性強(qiáng)、潔白度更好、結(jié)晶度指數(shù)高、易染色，其優(yōu)于堿處理所得纖 維。
[0005] 在飼料中果膠裂解酶也被使用，非淀粉多糖是由果膠、纖維素、半纖維素和抗性淀 粉等組成的，在動(dòng)物飼料中存在許多的非淀粉多糖。非淀粉多糖是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響腸 胃內(nèi)消化酶的活性，不利于腸胃對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和利用。單胃動(dòng)物，自身缺乏降解非淀粉 多糖的酶系，故而不能夠利用運(yùn)些物質(zhì)，就會(huì)造成動(dòng)物食欲不佳等狀態(tài)。果膠裂解酶能夠降 解運(yùn)些非淀粉多糖，酶解得到的產(chǎn)物，能夠作為其他酶的反應(yīng)底物，從而促進(jìn)動(dòng)物腸胃對(duì)飼 料的消化吸收。目前，主要將果膠酶與其他酶類配成復(fù)合酶用于飼料中，來提高動(dòng)物對(duì)飼料 的利用率，提高其生產(chǎn)性能。
[0006] 果膠裂解酶也用于果膠低聚糖的生產(chǎn)，果膠低聚糖(POS)主要指由2~20個(gè)半乳糖 醒酸通過Q-I，4糖巧鍵相連接組成的一種功能性低聚糖，部分半乳糖醒酸被甲基化。果膠低 聚糖能夠促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的生長(zhǎng)，有效抑制腸道內(nèi)病原菌的增 殖，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)菌群的動(dòng)態(tài)平衡;可W促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增加對(duì)微量元素的吸收， 提高機(jī)體的免疫功能。用酶處理法來生產(chǎn)果膠低聚糖，不需要添加其他化學(xué)試劑，不會(huì)有副 反應(yīng)的發(fā)生。果膠低聚糖主要通過果膠裂解酶和聚半乳糖醒酸酶降解果膠來生成。
[0007] 天然果膠裂解酶普遍存在于植物和微生物中，來自植物的果膠酶產(chǎn)量低且不易進(jìn) 行大規(guī)模的生產(chǎn)，而微生物因具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低、易于大規(guī)模培養(yǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)成 為果膠酶的主要來源。有許多微生物來源的果膠裂解酶已經(jīng)被報(bào)道，其中真菌來源的較多， 如來源于曲霉、青霉等，細(xì)菌來源的果膠酶也有不少報(bào)道。目前，國內(nèi)果膠裂解酶的生產(chǎn)主 要是用產(chǎn)果膠裂解酶的菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，但其產(chǎn)量往往不高、酶活力低下且不易于保存。 效價(jià)比較高的果膠酶仍然依賴于國外進(jìn)口，但進(jìn)口酶的價(jià)格昂貴，使企業(yè)的生產(chǎn)成本增加。 隨著中國食品工業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)酸性果膠酶的需求量不斷增加。對(duì)于產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好、 專一性強(qiáng)、酶活力高的果膠酶制劑是市場(chǎng)所要求的。
[000引隨著分子生物學(xué)技術(shù)的深入研究，利用一些高效微生物菌種來生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良的果 膠裂解酶已經(jīng)成為一種新的途徑。國內(nèi)外研究者已經(jīng)從不同微生物中篩選出許多具有優(yōu)良 性質(zhì)的果膠裂解酶基因，運(yùn)些果膠裂解酶性質(zhì)各異，如高比活、耐熱、耐低溫等。為了提高運(yùn) 些酶的表達(dá)量與純度，有研究者將運(yùn)些果膠裂解酶基因在大腸桿菌、畢赤酵母等宿主菌中 進(jìn)行異源重組表達(dá)。強(qiáng)慧妮等利用RT-PCR技術(shù)從黑曲霉化IM-6)中擴(kuò)增得到去除信號(hào)膚的 果膠裂解酶基因A，將其插入到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-pelA，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,得到了表達(dá)成功的工程菌株。用終濃度1.5%的甲醇對(duì)其進(jìn) 行誘導(dǎo)，將發(fā)酵上清液濃縮后，用鹽酸法測(cè)定其酶活可W達(dá)到2.3U/mL(Qiang，H.et al.Expression of a pectin lyase A gene from Aspergillus niger in Pichia pastoris GS115.Chinese journal of biotechnology,2009,25(12),1962)0Claudio P有 rez-Fuentes等將來源于青霉的果膠多核巧酸裂解酶基因克隆，將其插入表達(dá)載體pPICZA 上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GS115,得到兩株表達(dá)量高的菌株，用鹽酸法測(cè)得的酶活分別為 1.07U/mL和1.16U/mL(P有rez-Fuentes,C.et al.Heterologous expression of a Penici Ilium purpurogenum pectin lyase in Pichia pastoris and its CharacterizationJungal Biology ,2014,118(5-6) ,507-515.)。但運(yùn)些報(bào)道中關(guān)于酸性 果膠裂解酶的很少，且其表達(dá)量不高，純化回收率低，導(dǎo)致其不能被廣泛應(yīng)用。
[0009]通常提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)有密碼子優(yōu)化、mRNA結(jié)構(gòu)改造、GC含 量調(diào)整等策略。其中，優(yōu)化外源基因的密碼子是主要的手段(憂東宋，梁宋平.外源蛋白在己 氏畢赤酵母中高效表達(dá)的策略，吉首大學(xué)學(xué)報(bào).2001,22,（3) ,40-44)。研究發(fā)現(xiàn)物種具有密 碼子偏愛性，即不同物種對(duì)密碼子的使用頻率是不同的，有些密碼子甚至從來不使用，那些 不經(jīng)常使用甚至從不使用的密碼子稱為稀有密碼子或非偏愛型密碼子。非偏愛型密碼子形 成的原因主要是細(xì)胞內(nèi)缺乏識(shí)別運(yùn)些密碼子的tRNA。對(duì)于不同的表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母和大 腸桿菌，其密碼子偏好性是不同的。若外源基因含有較多的宿主菌非偏愛型密碼子，尤其是 連續(xù)出現(xiàn)的話，將會(huì)嚴(yán)重影響其在宿主菌中的表達(dá)量。為了消除稀有密碼子對(duì)蛋白表達(dá)量 的影響，可采用對(duì)異源基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)，即在不改變外源基因氨基酸序列的 情況下，將外源基因中的稀有密碼子替換為宿主常用的密碼子。不同來源的酶蛋白外源基 因經(jīng)密碼子優(yōu)化后其在畢赤酵母中的表達(dá)量提高程度差別很大，例如:Teng等通過優(yōu)化護(hù) 1,3-1，4葡聚糖酶的密碼子組成，使其在畢赤酵母中的表達(dá)量提高10倍(Teng D，et al.， Codon optimization of Bacillus Iicheniformis beta-l，3-1，4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:1074-1083) ;Chang將來源于假絲酵母的脂肪酶密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，在畢赤酵母中的表達(dá)量提高 4.6倍（Chang S胖，et al,Codon optimization of Candida rugosa Iiplgene for improving expression in Pichia pastoris and