甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因BnNF-YA3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，設及一種甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3 及其應用。
【背景技術】
[0002] 干旱、高鹽等非生物逆境是影響植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要逆境因素。所W人 們長期W來一直在尋找有效措施來培育能夠抵抗非生物脅迫和在各種逆境下生長的農(nóng)作 物。隨著分子生物學的發(fā)展，利用基因工程改良農(nóng)作物抗逆基因，培育具有抗逆能力的新品 種成為一種可行性方案。
[0003] 每一個生物個體體內的基因表達都是受到時空限制和外界刺激引發(fā)的并被嚴格 調節(jié)和控制的。轉錄因子(Transcription Factor)又稱為反式作用因子，是指那些具有同 真核生物基因啟動子中的順式作用元件特異性結合活性的蛋白質，它是由轉錄因子基因編 碼的。真核生物體內調控基因表達的是被稱為轉錄因子的一類蛋白質，它可W激活下游相 關基因的轉錄。利用激活抗逆基因的轉錄因子改良和增強植物的綜合抗逆性成為一種很有 潛力的方法。
[0004] 最初在植物中報道NF-Ys基因可W追溯到上世紀九十年代(Albani and Robert 1995；Edwards et al.1998；Kusnetsov et al.l999；Li et al.1992)〇NF-Y(Nuclear factor Y)是一類轉錄因子，屬于CCAAT框結合因子家族即CBF(CCAAT box binding factor)并存在于高等的真核生物中，它也被稱為HAP(Heme-associated proteins) (Laloum et al.2012):它由S個亞單位組成，分別是NF-YA(動植物VCBF-B(絲狀真菌)/ HAP2(酵母）、NF-YB/CBF-A/HAP3及NF-YC/CBF-C/HAP5(Mantovani 1999)。運S個亞單位能 形成=聚合的復合體，該復合體能與下游基因啟動子區(qū)域順式作用元件CCAAT框結合，從而 調控其表達(Sinha et al. 1996b)。在真菌和動物中，每個亞基一般均是由一個單獨的基因 編碼;然而，在植物中，不管是單子葉植物還是雙子葉植物，均是多個序列相近的基因編碼 一個亞基的，從而形成一個基因家族(Petroni et al. 2012)。
[0005] NF-YA(CBF-B或HAP2)是轉錄調控因子NF-Y的一個亞基，它與另外兩個亞基NF-YB、 NF-YC組成異源S聚體，共同結合于下游基因的CCAAT框上，從而激活或抑制基因的表達 (Romier等，2003) cXCAAT-box-般位于啟動子轉錄起始位點（TSS)上游-60~-IOObp處，是 啟動子中的基本調控元件之一(Mantovani，1999) eNF-Y是非常保守的一類轉錄調控因子， 每個亞基都有其特定的保守區(qū)域。NF-YA的保守區(qū)域位于C端，該區(qū)域負責與DNA序列結合， 引導NF-YB/NF-YC異源二聚體結合于CCAAT-box(Li等，1992)。關于NF-Y異源S聚體的組裝， 一種可能的組裝過程如圖1-2所示:首先NF-YB與NF-YC結合形成異源二聚體，接著NF-YA再 同異源二聚體結合形成完整的NF-Y，最后轉錄調控因子NF-Y與下游基因的CCAAT框結合 (RoncM等，1995 ,Sinha等，1995)。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，NF-YA與CO的蛋白結構相似。CO同 樣可W與NF-YB、NF-YC結合形成一個S聚體，該S聚體結合于FT基因的啟動子中的CCAAT框 上，并激活FT基因的表達。當對NF-YA過表達時，植物會表現(xiàn)出FT基因被抑制的現(xiàn)象。運說明 在植物體內NF-YA與CO是相互競爭的關系，大量表達的NF-YA會競爭性地與NF-YB/NF-YC異 源二聚體結合，從而造成CO的脫祀，進而抑制了 FT基因的表達。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種甘藍型油菜基因核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3及其應 用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：
[000引一種甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3,具有如SEQ ID NO. 1所示的核巧 酸序列。
[0009] 所述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因 BnNF-YA3 W甘藍型油菜"南鹽油1號" cDNA為模板，W化NF-YA3-F和化NF-YA3-R為引物，通過PCR擴增得到。
[0010] &iNF-YA3-F:5'GGATCTTGGGGATGGCTATG 3'(沈Q ID N0.4)
[0011] &iNF-YA3-R:5'GGTCAAAATATCAGGTTTTG 3'(SEQ ID N0.5)
[0012] 上述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3編碼的蛋白質，具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
[OOU] -種含有上述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因&1NF-YA3的重組載體。
[0014] 上述的重組載體，是將甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3插入表達載體 地1121的甜al與BamHl酶切位點之間所得。
[001日]一種含有上述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因&1NF-YA3重組載體的根癌農(nóng)桿 菌EHA105。
[0016]所述的根癌農(nóng)桿菌，將上述的重組載體經(jīng)電轉化轉入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。
[0017]上述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3CDS在培育該基因的擬南芥過 表達植株中的應用。
[0018] 上述的應用，其在于將含有甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3CDS重組載 體的根癌農(nóng)桿菌EHA105,轉入擬南芥中，多代繁殖后篩選獲得純合體。
[0019] -種含有所述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3的擬南芥過表達植 株。
[0020] 所述的擬南芥過表達植株，所述的含有甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因 BnNF-YA3重組載體的根癌農(nóng)桿菌邸A105,通過薩花法轉入擬南芥(Col-O)中，多代繁殖后篩選獲 得純合體。
[0021] 所述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3的擬南芥過表達植株對鹽處理 表現(xiàn)敏感。
[0022] 所述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因化NF-YA3的擬南芥過表達植株對干旱處 理表現(xiàn)敏感。
[0023] 所述的甘藍型油菜核轉錄因子NF-YA基因 BnNF-YA3的擬南芥過表達植株對外源 ABA處理表現(xiàn)敏感。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明利用油菜降解組測序數(shù)據(jù)庫和已知的核轉錄因子NF-YA基因家族成員的序 列，通過在油菜降解組測序數(shù)據(jù)庫中blast相似序列，得到具有相同保守結構域的新基因序 列命明為NF-YA3,該基因的CDS全長為846bp，編碼281個氨基酸。通過對該基因的初步序列 分析表明，BnNF-YA3是一個NF-YA基因，具有兩個不同功能的螺旋結構域Al和A2。其中Al可 與NF-YB/C亞基相互作用，A2的特異序列CCAAT框和DNA相互作用（Const巧et al. 1996 ; Olesen and Guarente 1990；Xing et al.l994)〇
[0026] 構建化NF-YA3的過表達載體，利用農(nóng)桿菌邸A105介導，采用薩花法侵染野生型擬 南芥(Co 1-0)。經(jīng)過多代的篩選成功獲得化NF-YA3轉基因純合體。
[0027] 對化NF-YA3的轉基因純合體擬南芥進行各項生理實驗，結果顯示:BnNF-YA3的過 表達植株對鹽、干旱和ABA處理表現(xiàn)出敏感。說明化NF-YA3參與植物的非生物脅迫調控過 程。
【附圖說明】
[002引圖1、甘藍型油菜基因化NF-YA3序列的擴增結果。
[00巧]圖2、化NF-YA3和表達載體地I 121的限制性酶切結果。
[0030] 圖3、PCR驗證轉基因植株在轉錄水平上的表達。
[0031] 圖4、逆境處理下轉基因擬南芥株系和野生型的萌發(fā)率。
[0032] 圖5、根的伸長率測定。
[0033] 圖6、根系掃描的結果(A、B)。
【具體實施方式】
[0034] 1.實施NF-YA基因化NF-YA3的預測及克隆
[0035] 利用生物軟件對4個甘藍型油菜降解組測序數(shù)據(jù)庫（儒處理的根、儒處理的莖葉、 對照組的根和對照組的莖葉，本數(shù)據(jù)來源于周兆勝老師)進行分析(Zhou et al. ,2012)，根 據(jù)擬南芥和油菜在進化上的同源性，將已知的擬南芥NF-YA基因家族成員的序列和油菜的 NF-YA基因家族成員的序列導入甘藍型油菜降解組測序數(shù)據(jù)庫，挑選相似度最大的序列，下 載其cDNA序列，使用引物設計軟件Primer Premier 5,在編碼起始位點和結束位點設計合 適的引物。引物序列如下：
[0036] &iNF-YA3-F:5'GGATCTTGGGGATGGCTATG 3'(沈Q ID N0.4)
[0037] &iNF-YA3-R:5'GGTCAAAATATCAGGTTTTG 3'(沈Q ID N0.5)
[0038] W甘藍型油菜'南鹽油1號'的CDNA為模板，用所設計的油菜化NF-YA3的引物進行 擴增，其PCR體系與反應程序如下：
[0039]
[0040]
[0041] PCR產(chǎn)物點入1%的瓊脂糖凝膠中電泳，得到約85化P左右的特異條帶，如圖I所示。 對目的片段進行切膠回收，連接克隆載體PMD19-T，將陽性菌株送交金維智公司測序。通過 在線DNA折疊預測分析，確定新成員化NF-YA3具有NF-YA基因家族的典型結構。
[0042] 2.實施NF-YA基因化NF-YA3過表達載體的構建
[0043] 由于化NF-YA3是編碼基因，所W將其插入過表達載體pBI 121中的35S和GUS基因中 并將其與GUS連在一起形成一個融合蛋白，需要將化NF-YA3的終止密碼子去掉。根據(jù)載體上 的已有的酶切位點的化NF-YA3的序列上的酶切位點，我們選擇Xba 1與BamHl限制性內切酶， 設計的引物如下，酶切位點如下劃線所示：
[0044] 化NF-Y