一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、嗜熱堿性果膠裂解酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜熱堿性果膠裂解酶基因、工程菌、 嗜熱堿性果膠裂解酶及該酶在降解果膠物質(zhì)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠物質(zhì)主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)組成，并且側(cè)鏈還常帶有海藻糖、鼠李糖、 阿拉伯糖等，廣泛存在于植物初生細(xì)胞壁中。
[0003] 果膠酶是一系列分解果膠物質(zhì)的酶類的總稱，在高等植物和微生物中分布甚廣。 植物在成熟過程中，果膠酶使植物細(xì)胞壁更松軟，對植物組織腐敗再生平衡也起到了重要 作用。果膠酶按其作用方式的不同可分為兩大類，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分為水解酶 和裂解酶。水解酶是通過引入水分子水解糖苷鍵，而裂解酶是通過反式消去作用斷裂糖苷 鍵。
[0004] 果膠裂解酶是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細(xì)胞壁并導(dǎo)致植物組織 軟化甚至死亡的解聚酶，它在果膠降解過程中起著重要的作用。其作用機制是通過消旋 的方式作用于斷裂糖苷鍵，形成3 4,5不飽和雙鍵，產(chǎn)生不飽和的半乳糖醛酸寡聚糖。果膠裂 解酶也是麻料脫膠工藝和紡織工藝中不可缺少的主要酶類。在醫(yī)藥、生物技術(shù)、飼料加工、 環(huán)保方面也具有相當(dāng)?shù)匚?，在木材防腐和造紙等方面也?yīng)用廣泛。
[0005] 目前果膠裂解酶主要以堿性酶為主，而且大多是常溫酶，嗜熱酶較少，迄今為止， 關(guān)于嗜熱纖維素酶的報道很多，而關(guān)于嗜熱果膠酶的報道很少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一目的是提供一種Caldicellulosiruptor bescii基因來源的嗜熱堿 性果膠裂解酶工程菌以及構(gòu)建方法，所述的嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET20b( + )-PelC，其保藏編號為CGMCCNo.ll460，分類命名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC， 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，保藏日期為 2015年9月29日。
[0007] 工程菌表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞可溶性蛋白，通過細(xì)胞超聲破碎，加熱失活大腸桿菌雜蛋 白，進(jìn)行分離純化得到嗜熱蛋白，即嗜熱堿性果膠裂解酶。
[0008] 本發(fā)明制備的嗜熱堿性果膠裂解酶的產(chǎn)量可達(dá)到50mg/L (1L發(fā)酵液），相對現(xiàn)有國 內(nèi)篩選到的堿性果膠酶，是一種效價很高的堿性果膠酶，為進(jìn)一步實現(xiàn)工業(yè)化鋪墊，也為工 業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)堿性果膠酶提供了有效地方法。
[0009] 本發(fā)明所述的嗜熱堿性果膠裂解酶基因工程菌以源于熱梭桿菌 Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴增3'端 含有6個組氨酸標(biāo)簽的嗜熱堿性果膠裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 測序譜圖如圖1所示。將該嗜熱堿性果膠裂解酶基因 Peic連接到表達(dá)載體pET20b( + )上獲得 重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)中得到嗜熱堿性果膠 裂解酶工程菌。
[00?0] 本發(fā)明所述的嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn):Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach .2011,Shuying Fang，Jianghua Li ,Long Liu, Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102，Issue 22，November 2011，Pages 10671-10678。具 體步驟如下：
[0011] (1)以熱梭桿菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因組DNA為模板，設(shè) 計引物，通過PCR反應(yīng)擴增得到3 '端含有6個組氨酸標(biāo)簽基因的嗜熱堿性果膠裂解酶PelC基 因；
[0012] (2)將步驟（1)得到的嗜熱堿性果膠裂解酶基因 Pe 1C酶切后與pET20b (+)表達(dá)載體 連接，得到重組表達(dá)載體pET20b (+) -Pe 1C;
[0013] (3)將重組表達(dá)載體pET20b( + )-pelC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主Escherichia coli BL21(DE3)中，構(gòu)建得到本發(fā)明所述的嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌Escherichia coli BL21 (DE3)/pET20b(+)-PelC〇
[0014] PCR引物，包括上游引物和下游引物，
[0015] 上游引物：5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，
[0016] 下游引物：5，CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3，，
[0017] 上游引物5 '端CATATG為NdeI酶切位點，保護(hù)堿基GGAATTC;下游引物5 '端CTCGAG為 Xholl酶切位點，保護(hù)堿基CCG。
[0018] 所述的重組表達(dá)載體pET20b( + )_PelC是將嗜熱堿性果膠裂解酶基因 PelC插入到 表達(dá)載體pET20b (+)的Nde I和Xho 11位點間得到。
[0019] 所述工程菌是將重組表達(dá)載體導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)得到的。
[0020] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種應(yīng)用本發(fā)明所述的工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的嗜熱堿性 果膠裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其是將嗜熱堿性果膠裂解酶工程菌接種 (接種量2%〇~5%〇(v/v))至裝有20mL種子培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中，37°C、170r/min振蕩培養(yǎng) 至OD6〇q = 6.0，獲得種子液;然后將種子液接種至含有50yg/mL氨節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接菌量 為2%。~5%。(v/v)，裝液量為2L/5L(2L指的是發(fā)酵培養(yǎng)液體積，5L指的是錐形瓶的容積），于 37°C、170r/min振蕩培養(yǎng)至0D 6q() = 0.6時加入終濃度0.5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時將溫度調(diào)整 為25~28°C，轉(zhuǎn)速調(diào)整為100~120r/min，誘導(dǎo)發(fā)酵18~24h，從而得到工程菌發(fā)酵液。將細(xì) 胞超聲破碎，加熱失活大腸桿菌雜蛋白，通過鎳柱親和層析法得到嗜熱堿性果膠裂解酶。經(jīng) 過鎳柱純化處理后嗜熱堿性果膠裂解酶含量可達(dá)到50mg/L( 1L發(fā)酵液）。
[0021] 在上述方法中，所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的終 濃度分別為:胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.2;發(fā)酵 培養(yǎng)基的成份如下:培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度為:胰蛋白 胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;培養(yǎng)基的pH值為7.0~7.2;
[0022] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述的嗜熱堿性果膠裂解酶在降解果膠物質(zhì)中的應(yīng) 用。
[0023]在本發(fā)明應(yīng)用中，所述果膠物質(zhì)為多聚半乳糖醛酸。
[0024] 本發(fā)明所述嗜熱堿性果膠裂解酶，在70°C降解多聚半乳糖醛酸的酶活為900U/mg; 熱穩(wěn)定較好，在70°C保溫下，半衰期為6h;最適反應(yīng)溫度為70°C，最適Ca2+濃度為0.8mM，底物 為0.2% (w/v)pH = 9.5。本發(fā)明所提供的工程菌中嗜熱堿性果膠裂解酶發(fā)酵量比野生菌株 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725有大幅度的提高，更加適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求，為 工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)堿性果膠酶提供了有效地方法。
【附圖說明】
[0025]圖1為嗜熱堿性果膠裂解酶基因測序譜圖（分為圖1(a)和圖1(b)兩部分）。
[0026]圖2為嗜熱堿性果膠裂解酶SDS-PAGE蛋白電泳圖；其中，1道是Marker，2道透析后 溶液中的蛋白。
[0027] 圖3為本發(fā)明嗜熱堿性果膠裂解酶的最適pH曲線。
[0028] 圖4為本發(fā)明嗜熱堿性果膠裂解酶的最適反應(yīng)溫度曲線。
[0029 ]圖5為本發(fā)明嗜熱堿性果膠裂解酶的最適Ca2+濃度曲線。
[0030]圖6為本發(fā)明嗜熱堿性果膠裂解酶的熱穩(wěn)定性曲線。 具體實施方案
[0031 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)實驗方法。
[0032]下述實施例中所使用的耗材、試劑、儀器，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 [0033]下述實施例中蛋白含量的測定使用的儀器為Nano Drop微型分光光度計檢測蛋白 濃度。
[0034]實施例1:嗜熱工程菌的構(gòu)建及酶的表達(dá)
[0035] (1)引物設(shè)計及用PCR方法獲取嗜熱堿性果膠裂解酶基因 PelC
[0036] 以熱梭桿菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因組為模板，設(shè)計引物， 通過PCR方法擴增PelC基因，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化1300bp，測序表明， 該片段的大小為1305bp，其序列如SEQ ID N0.1所示。
[0037]上游引物的序列如下：
[0038] 上游引物1:
[0039] 5 ' GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3，
[0040](下劃線堿基為Ndel酶切識別序列）；
[0041]下游引物的序列如下：
[0042]下游引物2:
[0043] 5 ' CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'
[0044](下劃線堿基為Xholl酶切識別序列）。
[0045] PCR反應(yīng)體系如下：（引物濃度為20ymol/L)
[0046]
[0047] PCR 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 lOmin，94°C 變性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 個 循環(huán)后72°C延伸10min，4°C保存，得到序列表序列所示的DNA片段。將序列表序列的DNA片 段，用Ndel和Xholl雙酶切，與經(jīng)過Ndel和Xholl雙酶切的載體pET20b( + )的骨架片段進(jìn)行過 夜連接，獲得重組載體pET20b( + )-PelC，經(jīng)過測序證實，重組載體為在載體pET20b( + )的Nde I和Xho 11位點間插入序列表序列。
[0048] 酶切體系如下（20yL):
[0049]
[0050] pET20b( + )-pelC(pET20b( + )購于EMD Biosciences(Novagen)公司）的構(gòu)建方法參 考文獻(xiàn)：Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach.2011,Shuying Fang， Jianghua Li，Long Liu，Guocheng Du，Jian Chen.Volume 102,Issue 22,November 2011， Pages 10671-10678。
[0051 ] (2)制備工程菌
[0052]感受態(tài)細(xì)胞的制備：將E. coli BL21(DE3)在劃線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種 到LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)。測定OD600值，當(dāng)OD600值達(dá)到0.3時(大約培養(yǎng)3-4小時，此為實 驗成功的關(guān)鍵）。取上述菌體培養(yǎng)液于50mL離心管中，冰上放置lOmindt離心10min (4000r/min)，倒出培養(yǎng)基，將管口倒置以便培養(yǎng)基流盡。用冰冷(4°C)的0. lmol/L CaCl2 10mL懸浮細(xì)胞沉淀，冰上放置30min。4°(3離心10min(4000r/min)。倒出上清液，用冰冷的 0.1mol/L CaCl22mL懸浮細(xì)胞沉淀(務(wù)必放在冰上）。分裝細(xì)胞，加入預(yù)冷的含30%(v/v)甘 油，每管200yL分裝，-80°C冰箱保存，此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。本感受細(xì)胞可以直接用于DNA的 轉(zhuǎn)化實驗，也可以于-80°C冰箱保存，以備