專利名稱：用于多肽的表達(dá)和分泌的果膠酸裂解酶融合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用微生物通過融合蛋白的表達(dá)而生產(chǎn)多肽。更具體地，本發(fā)明涉及一種能改進(jìn)融合蛋白的生產(chǎn)的細(xì)胞，所述融合蛋白包含與外源多肽融合的天然果膠酸裂解酶，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生所述融合蛋白和/或所述多肽的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)或多肽目前通過多種方式進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，所有方式均涉及能產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的微生物的培養(yǎng)。多種使蛋白質(zhì)的工業(yè)化產(chǎn)量最佳化的方法為本領(lǐng)域已知，并已常規(guī)應(yīng)用，如對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行操作，通過例如突變來改變微生物，使諸如啟動(dòng)子和信號(hào)序列等能影響編碼所需蛋白的基因表達(dá)的遺傳元件發(fā)生變異，以及對(duì)基因本身進(jìn)行操作以便例如增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或提高活性。
融合蛋白已被描述為生產(chǎn)用其它方法難以獲得的蛋白質(zhì)的一種途徑，這些蛋白質(zhì)如活性人類抗體(Goshorn，S.C.等，癌癥研究，(1993)第53卷(9)，第2123-2127頁)。
本發(fā)明的目的是提高一種利用微生物以高產(chǎn)量生產(chǎn)多肽的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明人鑒定了一種芽孢桿菌果膠酸裂解酶，該酶能以較高產(chǎn)量產(chǎn)生，其由分離的第一DNA片段編碼，該DNA片段可與編碼外源多肽的第二DNA片段融合在一個(gè)開放讀碼框中，該融合DNA序列編碼能在適當(dāng)條件下以較高產(chǎn)量產(chǎn)生的融合蛋白。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，特定氨基酸序列可在導(dǎo)入果膠酸裂解酶與外源多肽之間后作為蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)。
相應(yīng)地，本發(fā)明第一方面涉及一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。
本發(fā)明人還成功地在果膠酸裂解酶與外源多肽之間導(dǎo)入了一個(gè)氨基酸接頭，其在特定環(huán)境中增強(qiáng)融合蛋白的穩(wěn)定性。
相應(yīng)地，本發(fā)明第二方面涉及一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，含至少2個(gè)氨基酸的接頭，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。
本發(fā)明第三方面涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟i)構(gòu)建合適的細(xì)胞，其包含一種能編碼融合在一個(gè)開放讀碼框(ORF)內(nèi)的至少以下依次排列之元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽，ii)在適于生長和分泌的條件下培養(yǎng)步驟i)所構(gòu)建的細(xì)胞，iii)回收所述蛋白，和iv)任選在所述靶位點(diǎn)切割該蛋白。
通過利用本發(fā)明的細(xì)胞或方法，有可能以較高產(chǎn)量產(chǎn)生所需外源多肽如激素，功能型激素類似物，酶和人工多肽，從而使生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)，甚至對(duì)特定多肽而言使這類所需多肽的實(shí)際利用更經(jīng)濟(jì)可行。
附圖簡(jiǎn)述在所附圖中

圖1顯示W(wǎng)estern印跡，其放大了如實(shí)施例2所述融合多肽果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的表達(dá)。圖注泳道1果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的芽孢桿菌培養(yǎng)物；泳道2GLP1標(biāo)準(zhǔn)品100mg/l；圖2顯示W(wǎng)estern印跡，其放大了如實(shí)施例2所述融合多肽果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的表達(dá)。圖2的圖注泳道1純化的果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的10倍稀釋液；泳道2MI3(12.5mg/l)與GLP1(25mg/l)的混合標(biāo)準(zhǔn)品；圖3顯示W(wǎng)estern印跡，其放大了如實(shí)施例3所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物對(duì)融合多肽果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-GLP1(7-37)的表達(dá)。圖3的圖注泳道1培養(yǎng)物(對(duì)照)；泳道2GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(100mg/l)；泳道3GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(50mg/l)；泳道4GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(25mg/l)；和圖4顯示W(wǎng)estern印跡，其放大了如實(shí)施例4所述融合多肽果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-MI3的表達(dá)。圖4的圖注泳道1MB1009-1(果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-MI3)；泳道2MB1009-1(果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-MI3)；泳道3MB1009-4(果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-MI3)；泳道4MB1009-4(果膠酸裂解酶-AS-PEPTPEPTKR-MI3)；泳道5MB1009-7(陰性對(duì)照)；泳道6MB1009-7(陰性對(duì)照)；泳道7MB1009-7(陰性對(duì)照)；泳道8標(biāo)準(zhǔn)MI3，50mg/l；泳道9標(biāo)準(zhǔn)MI3，25mg/l；泳道10標(biāo)準(zhǔn)MI3，12.5mg/l。
圖5顯示W(wǎng)estern印跡，其放大了如實(shí)施例5所述融合多肽果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的表達(dá)以及Kex2p-裂解而對(duì)GLP1(7-37)的釋放。圖5的圖注泳道1果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的芽孢桿菌培養(yǎng)物用Kex蛋白酶處理；泳道2果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)的芽孢桿菌培養(yǎng)物；泳道3GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(12.5mg/l)；泳道4GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(25mg/l)；泳道5GLP1標(biāo)準(zhǔn)品(50mg/l)。
定義討論本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施方案之前，先就與本發(fā)明主要方面相關(guān)的特殊術(shù)語進(jìn)行限定。
本文中術(shù)語“細(xì)胞”或“菌株”指單個(gè)活細(xì)胞或由單個(gè)活細(xì)胞的營養(yǎng)生長所得的活細(xì)胞群體。
本文中術(shù)語“DNA序列”或“DNA片段”或“DNA元件”指4種堿基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、和胞嘧啶(C)在由序列或片段或元件所定性的特異性脫氧核糖核酸(DNA)鏈中的依次排列。
本文中術(shù)語“基因”或“開放讀碼框”指可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為多肽或蛋白質(zhì)的DNA鏈。相應(yīng)地，所述基因或開放讀碼框被限定為始于起始密碼子(通常為“ATG”、“GTG”、或“TTG”)而止于終止密碼子(通常為“TAA”、“TAG”、或“TGA”)。
本文中術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”指由RNA聚合酶將開放讀碼框或基因轉(zhuǎn)錄為信使RNA，然后由核糖體通過依次添加氨基酸并將它們用肽鍵相連而進(jìn)一步翻譯，最終所得的表達(dá)產(chǎn)物；此過程即本領(lǐng)域的“中心法則”。
本領(lǐng)域已知為了表達(dá)基因，該基因必需與一些元件相連，這些元件為該基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需。這類標(biāo)準(zhǔn)元件可包括啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，終止序列，以及本領(lǐng)域已知的其它元件。
本文中，當(dāng)至少兩個(gè)基因及可能還有其它DNA元件連接在一起形成一個(gè)開放讀碼框，且這些元件以與列舉它們相同的順序表達(dá)在一個(gè)多肽中時(shí)，稱這些元件“依次融合”，而該多肽則稱為“融合多肽”或“融合蛋白”。
術(shù)語“果膠”指果膠酸，聚半乳糖醛酸，以及可以酯化至更高級(jí)或更低級(jí)的果膠。
本文中術(shù)語“果膠酶”指能切割果膠(pectic)物質(zhì)，主要是聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐及其衍生物(參見Sakai等，果膠、果膠酶和原果膠酶生產(chǎn)、特性及應(yīng)用，在《應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展(Advances in Applied Microbiology)》第39卷，第213-294頁，1993)的糖苷鍵的果膠酶。
術(shù)語“果膠酸裂解酶”指能通過轉(zhuǎn)移消除作用催化果膠酸(也稱為聚半乳糖醛酸)中α-1，4-糖苷鍵隨機(jī)裂解的果膠酶，如聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.2)(PGL)一類，也稱為聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)裂解酶，還指已經(jīng)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式改變了的果膠酸裂解酶，所述方式如氨基酸缺失、插入或取代、C末端和/或N末端截短但仍保留上述催化活性。
術(shù)語“α-淀粉酶”指能催化寡糖和多糖中1，4-α-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的酶， 即根據(jù)酶學(xué)命名法數(shù)據(jù)庫歸類為EC 3.2.1.1的酶(http//www.expasy.ch/enzyme/)。
本文中術(shù)語“功能型激素類似物”指天然肽激素的衍生物，其通過本領(lǐng)域任何標(biāo)準(zhǔn)方法改變后仍保留了天然激素的生物學(xué)活性，所述方法如氨基酸缺失、插入或取代、C末端和/或N末端截短。功能型激素類似物的一個(gè)具體實(shí)例是人類GLP-1(7-37)，其包含SEQ ID 14中348-378位或SEQ ID16中356-386位所示氨基酸序列。
術(shù)語“單鏈人類胰島素(MI3)”指由SEQ ID 18所示氨基酸序列限定的原胰島素類似物。該蛋白序列公開在國際專利申請(qǐng)WO 95/34666中，其全文引入作為參考。
術(shù)語“核心酶”指一種單結(jié)構(gòu)域酶，其可能已經(jīng)或尚未被修飾或改變，但其保留了最初的活性；該催化結(jié)構(gòu)域如本領(lǐng)域已知的那樣保持完整無損并具有功能。
本文中術(shù)語“用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)”指由蛋白酶識(shí)別并被該蛋白酶酶解或通過化學(xué)化合物處理而裂解(分子生物學(xué)最新方案(Currentprotocols in Molecular Biology)(John Wiley & Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.編))的氨基酸序列。
本文中術(shù)語“外源”當(dāng)與細(xì)胞一詞連用時(shí)指由于所述細(xì)胞中外來基因(即已插入所述細(xì)胞且在該細(xì)胞中并非天然存在的基因)的存在而由該細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。
與此相反，本文中術(shù)語“天然”或“內(nèi)源”當(dāng)與特定微生物來源連用時(shí)，指由于特定來源中天然基因(即并未重組插入該來源的細(xì)胞而是其中天然存在的基因)的存在而由該來源產(chǎn)生的多肽。
術(shù)語“接頭”或“間隔臂”指含有至少兩個(gè)氨基酸的多肽，其可能出現(xiàn)在一種多結(jié)構(gòu)域蛋白(如含有核心酶以及結(jié)合結(jié)構(gòu)域如纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的酶或任何其它酶雜合體)的結(jié)構(gòu)域之間，或出現(xiàn)在表達(dá)為融合多肽(如含有兩種核心酶的融合蛋白或作為一個(gè)整體出現(xiàn)在本發(fā)明的細(xì)胞中的融合蛋白)的兩種蛋白或多肽之間。例如，可通過將編碼第一核心酶的DNA序列、編碼接頭的DNA序列和編碼第二核心酶的DNA序列依次融合在一個(gè)開放讀碼框中并表達(dá)該構(gòu)建體，從而提供兩種核心酶的融合蛋白。接頭還可包含用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)。
發(fā)明詳述細(xì)胞本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)胞，更優(yōu)選芽孢桿菌細(xì)胞，甚至更優(yōu)選選自下組的細(xì)胞地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、Bacillus clausii、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliguefacienss)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、凝固芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、和Bacillusagaradhaerens。
果膠酸裂解酶由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的、作為融合蛋白一部分的果膠酸裂解酶優(yōu)選選自以下果膠酸裂解酶，它們含有選自SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQ ID8，SEQ ID 10的氨基酸序列，和具有與SEQ ID 2，SEQ ID 4，SEQ ID 6，SEQID 8和SEQ ID 10中任何一個(gè)至少70％的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。
示于SEQ ID 2(其相應(yīng)DNA序列示于SEQ ID 1)并已證實(shí)十分有利于天然酶所結(jié)合的多肽異源表達(dá)的果膠酸裂解酶與其它四種果膠酸裂解酶密切相關(guān)。
那四種果膠酸裂解酶的完整DNA序列示于SEQ ID 3，SEQ ID 5，SEQID 7，和SEQ ID 9。它們?cè)诖俗鳛榭捎米魅诤吓鋵?duì)物以便在芽孢桿菌細(xì)胞中表達(dá)外源多肽的其它果膠酸序列的實(shí)例。這些序列公開在WO 99/27084中。
可將果膠酸裂解酶蛋白序列最小化至某種程度而仍維持其在融合蛋白表達(dá)中使用時(shí)的有利特性。這種對(duì)DNA序列以及因此對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)序列的最小化可通過分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)。
其中一個(gè)方法是，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，通過PCR構(gòu)建與目標(biāo)蛋白融合的果膠酸裂解酶的截短形式，并檢驗(yàn)這種新構(gòu)建體的表達(dá)水平。這類構(gòu)建體可缺失果膠酸裂解酶C末端的一部分，果膠酸裂解酶N末端的一部分，或二種末端都缺失。另一種方法是，用內(nèi)切核酸酶處理果膠酸裂解酶編碼序列，使得編碼果膠酸裂解酶C末端的部分被降解至各種程度。攜與目標(biāo)肽融合之果膠酸裂解酶的不同長度N末端部分的克隆組成一個(gè)文庫，可在該文庫中以鑒定最佳表達(dá)構(gòu)建體的方式篩選這些克隆的表達(dá)能力。該方法也可應(yīng)用于果膠酸裂解酶融合構(gòu)建體，使得果膠酸裂解酶N末端的部分或N末端及C末端均缺失，從而使融合蛋白得到最佳表達(dá)。
酶解位點(diǎn)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是由蛋白酶識(shí)別并裂解的氨基酸序列。
文獻(xiàn)中已描述了數(shù)種經(jīng)策略性定位而能促進(jìn)融合產(chǎn)物有效裂解的氨基酸序列。這些策略大多數(shù)涉及在親本酶與目標(biāo)肽之間的接頭區(qū)中定點(diǎn)進(jìn)行蛋白酶剪切(Polyak等(1997)蛋白質(zhì)工程，第10卷(6)，第615-619頁；Kjeldsen等(1996)基因，笫170卷，第107-112頁；Sun等(1995)蛋白表達(dá)和純化，卷6(5)，第685-692頁；Martinez等(1995)生物化學(xué)雜志，第306卷(第2部分)第589-597頁)。
為了確保有效裂解，可在親本酶(本例為果膠酸裂解酶)與外源多肽(編碼位點(diǎn)特異性蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn))之間插入氨基酸序列。文獻(xiàn)中已描述了識(shí)別位點(diǎn)和蛋白酶的多種組合。以下我們將顯示來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α細(xì)胞的Kex2基因編碼的膜結(jié)合蛋白酶。Kex2蛋白酶能水解具有堿性氨基酸對(duì)的肽和蛋白質(zhì)，在其肽鍵的C末端裂解(Bessmertnaya等(1997)生物化學(xué)，第62卷(8)第850-857頁)。在第一和第二方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Kex2裂解位點(diǎn)為Lys-Arg(K-/-R)序列，但可插入堿性氨基酸的其它組合從而使Kex2的裂解最優(yōu)化(Ledgerwood等，(1995)生物化學(xué)雜志，卷308(1)321-325；或Ghosh，S.等(1996)基因(AmsterDNA)，卷176(1-2)249-255)。
蛋白酶和裂解位點(diǎn)的其它有效組合是優(yōu)先裂解氨基酸序列X-D-D-D-K-/-X的腸激酶(La Vallie等(1993)生物學(xué)化學(xué)雜志，第268卷第2311-2317頁)，優(yōu)先裂解氨基酸序列X-K-R-/-X的胰蛋白酶(Jonasson等(1996)歐洲生物化學(xué)雜志，卷236(2)656-661)，優(yōu)先裂解氨基酸序列X-I-E-G-R-/-X的Xa因子(Nagai等(1985)PNAS，第82卷第7252-7255頁)，優(yōu)先裂解氨基酸序列P-X-/-G-P-X-X的膠原酶(Chinery等(1993)歐洲生物化學(xué)雜志，卷212(2)557-553)，優(yōu)先裂解氨基酸序列X-G-V-R-G-P-R-/-X的凝血酶(Rahman等(1992)細(xì)胞分子生物學(xué)，卷38(5)529-542)，優(yōu)先在賴氨酸處裂解的ALP(水解無色桿菌(Achromobacter lyticus)的Lys特異性蛋白酶)(Kjeldsen等(1996)基因，卷170(1)107-112)，以及地衣芽孢桿菌的在Glu處裂解的C-組分蛋白酶(Kakudo等(1992)生物學(xué)化學(xué)雜志，卷267(33)23782-23788)。
另一種在特異性靶位點(diǎn)裂解肽的優(yōu)選方法是利用化學(xué)化合物如能裂解X-M-/-X的溴化氰或能裂解S-N-/-G-X的羥胺(分子生物學(xué)最新方案，JohnWiley & Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.編)。
接頭在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由本發(fā)明方法產(chǎn)生的融合蛋白在果膠酸裂解酶與外源多肽之間插入了一個(gè)接頭。優(yōu)選地，該接頭包含以下氨基酸序列，該序列中至少25％的氨基酸為脯氨酸。更優(yōu)選地，該接頭包含以下次序的氨基酸的至少一個(gè)循環(huán)重復(fù)Pro-Glu-Pro-Thr(PEPT，EPTP，PTEP或TPEP)，更優(yōu)選該接頭包含氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)的至少一個(gè)重復(fù)。
外源多肽通常，外源多肽是本發(fā)明方法的目標(biāo)產(chǎn)物。外源多肽可以是能作為由本發(fā)明方法產(chǎn)生的融合多肽的一部分而成功表達(dá)的任何多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，外源多肽選自激素、功能型激素類似物、酶和人工多肽。
人工多肽的一個(gè)實(shí)例是單鏈人類胰島素(MI3)，優(yōu)選包含SEQ ID 18所示氨基酸序列(其由SEQ ID 17所示密碼子最優(yōu)化型人工序列編碼)的胰島素。所述外源多肽甚至可能是包含攜SEQ ID 20中356-408位所示氨基酸序列的單鏈人類胰島素(MI3)的多肽；或單鏈人類胰島素(MI3)的包含SEQ ID42中366-418位所示氨基酸序列的MW變體。
據(jù)認(rèn)為激素可以是本領(lǐng)域已知的任何肽激素，如人類GLP1的全長氨基酸序列。
功能型激素類似物的一個(gè)實(shí)例是人類GLP-1(7-37)激素類似物，優(yōu)選包含SEQ ID 14中348-378位或SEQ ID 16中356-386位所示氨基酸序列的類似物。
酶的一個(gè)實(shí)例是α-淀粉酶。優(yōu)選的α-淀粉酶包括美國專利5003257；EP 252666；WO/9I/00353；FR 2676456；EP 285123；EP 525610；EP 368341；和英國專利說明書1296839(Novo)所公開的那些。
其它淀粉酶有WO94/18314和WO 96/05295所述的穩(wěn)定性增強(qiáng)型淀粉酶和在WO 95/10603中所公開的直接親本的具有額外修飾的第二代變體。EP 277216，WO 95/26397和WO 96/23873中所述的淀粉酶也合適。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-淀粉酶包含SEQ ID 12中350-834位所示的氨基酸序列。
市售α-淀粉酶產(chǎn)物有來自Genencor的Purafect Ox Am和來自丹麥的Novo Nordisk A/S的Termamyl，Ban，F(xiàn)ungamyl和Duramyl。WO95/26397描述了其它合適的淀粉酶通過Phadebasα-淀粉酶活性試驗(yàn)測(cè)得在25-55℃，pH8-10的條件下，比活性比Termamyl高至少25％的α-淀粉酶。上述酶的變體也合適，它們述于WO 96/23873。其它在活性水平方面具有改良特性的淀粉分解酶，和即具有穩(wěn)定性又具有較高活性的淀粉裂解酶述于WO 95/35382。
可由本發(fā)明方法產(chǎn)生的優(yōu)選的淀粉酶有，以商標(biāo)名Termamyl，Duramyl和Maxamyl出售的淀粉酶，包含SEQ ID 12中350-834位所示氨基酸序列的JP170淀粉酶，和或證實(shí)穩(wěn)定性已增加的、如WO 96/23873中SEQ ID 2所公開的α-淀粉酶變體。
產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法該方法中一個(gè)基本要素是本文所述細(xì)胞的應(yīng)用。能產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞的特異性構(gòu)建和培養(yǎng)可以是本領(lǐng)域的任何標(biāo)準(zhǔn)方案(Maniatis，T.Fritsch，E.F.，Sambrook，J.“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1982；Ausubel，F(xiàn).M.等(編)，“分子生物學(xué)最新方案”，John Wiley & Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法”，John Wiley & Sons，1990)。
相似地，第三方面第iii)項(xiàng)所述蛋白的特異性分離策略可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何分離方案；該分離方案可能包括在如本領(lǐng)域已知的那樣進(jìn)行分離之前或之后以任意多種方式對(duì)所述蛋白進(jìn)行蛋白酶解。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下非限制性實(shí)施例舉例說明。
材料和方法菌株和供體生物地衣芽孢桿菌ATCC14580包含SEQ ID 1所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
大腸桿菌DSM 11789包含一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜有本發(fā)明SEQ ID 1所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
大腸桿菌DSM 12403包含一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜有本發(fā)明SEQ ID 3所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
大腸桿菌DSM 12404包含一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜有本發(fā)明SEQ ID 5所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
大腸桿菌DSM 11788包含一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒攜有本發(fā)明SEQ ID 7所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
芽孢桿菌KJ59菌株(DSM 12419)包含SEQ ID 9所示DNA序列編碼的果膠酸裂解酶。
枯草芽孢桿菌PL1801。該菌株是攜有中斷的apr和npr基因的枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.Hedegaard，L.Jensen，B.R.，Sjholm，C.(1990)，對(duì)編碼短芽孢桿菌胞外酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆，細(xì)菌學(xué)雜志，172，4315-4321)。
枯草芽孢桿菌WB600。該菌株是有6個(gè)主要蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌。Wu，X-C.，S-C.Ng，R.I.Near，和S-L.Wong，1993，通過工程化枯草芽孢桿菌表達(dá)分泌系統(tǒng)有效產(chǎn)生功能性單鏈抗地高辛抗體，生物/技術(shù)，1171-76。
枯草芽孢桿菌WB600asn。該菌株是amyE基因已被四環(huán)素標(biāo)記中斷的WB600菌株。此外，WB600中的氯霉素標(biāo)記基因已被新霉素標(biāo)記取代。該菌株抗四環(huán)素、新霉素、鏈霉素和博萊霉素。
枯草芽孢桿菌PL2306。該菌株是具有已被破壞的apr和npr基因的枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.Hedegaard，L.Jensen，B.R.，Sjholm，C.(1990)，對(duì)編碼短芽孢桿菌胞外酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆，細(xì)菌學(xué)雜志，172，4315-4321)，其中已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄單位中有破壞，導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素陰性細(xì)胞。所述破壞基本如(A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick編(1993)，枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌，美國微生物學(xué)協(xié)會(huì)，第618頁)所述進(jìn)行。
感受態(tài)細(xì)胞如Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.(1975)枯草芽孢桿菌溶原性菌株中的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染在感受態(tài)細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)噬菌體的證據(jù)，細(xì)菌學(xué)雜志，121296-304所述進(jìn)行制備和轉(zhuǎn)化。
質(zhì)粒pSJ1678(參見WO 94/19454，其已全文引入作為參考)。
pMOL944該質(zhì)粒為pUB110的衍生物，其主要包含能使其在枯草芽孢桿菌中增殖的元件，卡那霉素抗性基因并具有克隆自地衣芽孢桿菌ATCC 14580的amyL基因的強(qiáng)啟動(dòng)子和信號(hào)肽。該信號(hào)肽包含一個(gè)SacII位點(diǎn)，使得可方便地對(duì)與該信號(hào)肽融合為一體的蛋白的成熟部分之編碼DNA進(jìn)行克隆。這導(dǎo)致可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外的前蛋白的表達(dá)。
質(zhì)粒用常規(guī)遺傳工程技術(shù)構(gòu)建，簡(jiǎn)述如下。
pMOL944的構(gòu)建用唯一限制性酶NciI消化pUB110質(zhì)粒(Mckenzie，T.等，1986，質(zhì)粒1593-103)。由質(zhì)粒pDN1981(P.L.Jrgensen等，1990，基因，96，第37-41頁)上的amyL啟動(dòng)子擴(kuò)增的PCR片段用NciI消化并插入用NciI消化的pUB110以產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ2624。
所用的兩種PCR引物具有以下序列#LWN5494(SEQ ID 21)5’-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC#LWN5495(SEQ ID 22)5’-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT引物#LWN5494(SEQ ID 21)在所述質(zhì)粒中插入了一個(gè)NotI位點(diǎn)。
質(zhì)粒pSJ2624然后用SacI和NotI消化，由pDN1981上amyL啟動(dòng)子擴(kuò)增的新PCR片段用SacI和NotI消化，將該DNA片段插入用SacI-NotI消化的pSJ2624中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ2670。
該克隆取代了與相同啟動(dòng)子一起克隆但方向相反的第一amyL啟動(dòng)子。用于PCR擴(kuò)增的兩種引物具有以下序列#LWN5938(SEQ ID 23)5’-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT#LWN5939(SEQ ID 24)5’-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC質(zhì)粒pSJ2670用限制酶PstI和BclI消化，由編碼堿性淀粉酶SP722(公開于國際專利申請(qǐng)WO 95/26397，其已全文引入作為參考)的克隆化DNA序列擴(kuò)增的PCR片段用PstI和BclI消化并插入以產(chǎn)生質(zhì)粒pMOL944。用于PCR擴(kuò)增的兩種引物具有以下序列#LWN7864(SEQ ID 25)5’-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC#LWN7901(SEQ ID 26)5’-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG引物#LWN7901(SEQ ID 26)在所述質(zhì)粒中插入了一個(gè)SacII位點(diǎn)。
質(zhì)粒pMB541(構(gòu)建如下)供體菌株的增殖將地衣芽孢桿菌菌株ATCC 14580在ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，USA)所特指的液體培養(yǎng)基3中培養(yǎng)。以37℃、300rpm培養(yǎng)18小時(shí)后，收獲細(xì)胞，用下述方法分離基因組DNA。
基因組DNA制備如上述在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述地衣芽孢桿菌菌株。收獲細(xì)胞，用Pitcher等所述方法[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J；用異硫氰酸胍快速提取細(xì)菌基因組DNA；應(yīng)用微生物學(xué)通信(Lett Appl Microbiol)1989 8151-156]分離。
pMB541的構(gòu)建。
克隆地衣芽孢桿菌的果膠酸裂解酶地衣芽孢桿菌菌株ATCC 14580的基因組DNA用限制酶Sau3A進(jìn)行部分消化，通過在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳而進(jìn)行分級(jí)分離。大小介于2-7kb之間的片段通過在DEAE-纖維素濾紙上的電泳而分離(Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P(1981)，一種從瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的可靠方法，生物化學(xué)年鑒，112，295-298)。
將所分離的DNA片段連接至已用BamHI消化的pSJ1678質(zhì)粒DNA中，用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。將來自地衣芽孢桿菌ATCC14580的基因組文庫的已轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪板于包含10μg/ml氯霉素和0.7％聚半乳糖醛酸鈉(SIGMA P-1879)的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。
將菌落影印至含10μg/ml氯霉素和0.7％聚半乳糖醛酸鈉(SIGMA P-1879)的新鮮LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)8小時(shí)。將起始主平板用5ml 1MCaCl2淹沒，5-30分鐘后在假定的聚半乳糖醛酸鈉降解克隆周圍出現(xiàn)明顯的云霧狀環(huán)。取主平板上的相應(yīng)克隆進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。即，從大腸桿菌在TY液體培養(yǎng)基上30℃過夜培養(yǎng)所得的克隆制備質(zhì)粒DNA，并用Qiagen QiaspinPrep試劑盒按廠商建議(Qiagen，德國)制備質(zhì)粒DNA，以便進(jìn)一步鑒定所述克隆。
地衣芽孢桿菌ATCC 14580基因庫中的果膠酸裂解酶陽性克隆以DSM11789的名義進(jìn)行保藏。在對(duì)大腸桿菌DSM 11789的質(zhì)粒進(jìn)行了引物步行試驗(yàn)后，鑒定出地衣芽孢桿菌ATCC 14580中編碼果膠酸裂解酶的DNA的序列SEQ ID 1。
利用活性鑒定陽性克隆平板培養(yǎng)后，將菌落影印至一組LB+6 CAM瓊脂平板上，然后再于37℃培養(yǎng)約20小時(shí)。將含有1％HSB瓊脂糖、0.37％聚半乳糖醛酸鈉的適當(dāng)緩沖液上層傾注在這些影印平板上，40℃培養(yǎng)約20小時(shí)。用5ml 1M CaCl2沉淀，5-30分鐘后，在存在果膠酸裂解酶陽性克隆之處出現(xiàn)透明環(huán)(clearhalo)，由此可鑒定果膠酸裂解酶陽性菌落。
果膠酸裂解酶陽性菌落的細(xì)胞通過在瓊脂上劃線分離而分出單菌落，針對(duì)所鑒定的每一果膠酸裂解酶生產(chǎn)菌落篩選產(chǎn)果膠酸裂解酶的單菌落。
陽性克隆的鑒定從再劃線接種的平板上獲得果膠酶陽性克隆的單菌落，用QiagenPlasmid Prep按廠商建議(Qiagen，德國)提取質(zhì)粒。表型通過大腸桿菌SJ2的再次轉(zhuǎn)化而證實(shí)，質(zhì)粒通過限制性消化來鑒定。
地衣芽孢桿菌ATCC 14580基因庫中的果膠酸裂解酶陽性克隆以DSM11789的名義進(jìn)行保藏。在對(duì)大腸桿菌DSM 11789的質(zhì)粒進(jìn)行了引物步行試驗(yàn)后，鑒定出地衣芽孢桿菌ATCC 14580中編碼果膠酸裂解酶的DNA的序列SEQ ID 1。
枯草芽孢桿菌的再克隆編碼本發(fā)明果膠酸裂解酶的成熟部分(由氨基酸序列SEQ ID 2表示，其編碼DNA序列如SEQ ID 1中所示)的DNA用含有以下兩種寡核苷酸的PCR引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增Pecl.B.lich.upper.SacII(SEQ ID 27)5’-CTA ACT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCC TTA AAC TCGGGCPecl.B.lich.lower.NotI(SEQ ID 28)5’-GCG TTG AGA CGCGCG GCC GCT GAA TGC CCC GGA CGTTTC ACCSacII和NotI的限制性位點(diǎn)均已下劃線。
用上述地衣芽孢桿菌ATCC 14580的染色體DNA為模板，用AmplitaqDNA聚合酶(Perkin Elmer)根據(jù)廠商建議，在含dNTP各200μM、AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer，Cetus，美國)2.5個(gè)單位以及每種引物各100pmol的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR反應(yīng)用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)進(jìn)行。94℃保溫1分鐘，然后以94℃30秒的變性、60℃1分鐘的退火、72℃2分鐘的延伸進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上進(jìn)行電泳分析。1.0kb的DNA片段的出現(xiàn)表示對(duì)基因片段的擴(kuò)增是正確的。
對(duì)PCR片段的再克隆對(duì)PCR片段的再克隆如實(shí)施例1所述進(jìn)行，不同的是所純化的PCR片段用SacII和NotI消化。保留一個(gè)包含果膠酸裂解酶基因的克隆，將其命名為MB541，MB541中的質(zhì)粒因此命名為pMB541。
對(duì)應(yīng)于果膠酸裂解酶成熟部分的DNA通過引物步行法進(jìn)行DNA測(cè)序來鑒定，其中使用Taq脫氧末端化循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer，美國)，熒光標(biāo)記的終止子，并使用相應(yīng)寡核苷酸作為引物。
對(duì)序列數(shù)據(jù)的分析如Devereux等(1984)，核酸研究12387-395所述進(jìn)行?？寺』疍NA序列在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，出現(xiàn)在上清中的蛋白對(duì)應(yīng)于SEQ ID 1所示的成熟蛋白。
普通分子生物學(xué)方法除非另外指明，DNA操作和轉(zhuǎn)化用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等(編)“分子生物學(xué)最新方案”，John Wiley & Sons，1995；Harwood，C.R.& Cutting，S.M.(編)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法”，John Wiley &Sons，1990)。
用于DNA操作的酶根據(jù)廠商說明使用(如，限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等均得自New England Biolabs公司)。
培養(yǎng)基TY(如Ausubel，F(xiàn).M.等(編)“分子生物學(xué)最新方案”，John Wiley &Sons，1995所述)。LB瓊脂(如Ausubel，F(xiàn).M.等(編)“分子生物學(xué)最新方案”，John Wiley & Sons，1995所述)。LBPG是添加了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀的LB瓊脂(pH7.0)。BPX培養(yǎng)基如EP 0506780(WO 91/09129)所述。CAL18-2培養(yǎng)基(1L)酵母提取物(#0127-17-9 Difco實(shí)驗(yàn)室，MI，美國)40g；硫酸鎂(#5886 Merck，Darmstadt，德國)1.3g；Glucidex 12(Roquette Feres，法國)50g；磷酸二氫鈉(#6346 Merck，Darmstadt，德國)20g；EDF-痕量金屬(配方如下)6.7ml；Na2MoO4-痕量金屬(配方如下)6.7ml；Pluronic PE6100(BASF，德國)0.1ml；用離子交換水調(diào)整至1000ml?；旌纤形镔|(zhì)，調(diào)整體積，測(cè)量pH并用NaOH將pH調(diào)整至6.0。該培養(yǎng)基通過121℃20分鐘高壓滅菌。EDF-痕量金屬(1L)硫酸錳(II)(#5963 Merck，Darmstadt，德國)4.48g；氯化鐵(III)(#3943 Merck，Darmstadt，德國)3.33g；硫酸銅(II)(#2790Merck，Darmstadt，德國)0.625g；硫酸鋅(#8883 Merck，Darmstadt，德國)7.12g；用離子交換水調(diào)整至1000ml?；旌纤形镔|(zhì)，調(diào)整體積。將溶液用濾膜過濾除菌，于4℃保存。Na2MoQ4-痕量金屬(1L)鉬酸鈉(#6521 Merck，Darmstadt，德國)2.0g；用離子交換水調(diào)整至1000ml?；旌纤形镔|(zhì)，調(diào)整體積。將溶液過濾除菌，于4℃保存。
α-淀粉酶活性試驗(yàn)α-淀粉酶活性通過用4，6-亞乙基(G7)-對(duì)硝基苯(G1)-α，D-麥芽糖庚苷(亞乙基-G7PNP)作為底物(Boehringer Mannheim，Germany art.1442309)經(jīng)酶比色檢驗(yàn)來測(cè)定。在特定條件(溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、緩沖條件)下，1mg指定的α-淀粉酶將水解特定量的底物并產(chǎn)生黃色。在405nm處測(cè)量顏色強(qiáng)度。所測(cè)吸光度與目標(biāo)α-淀粉酶在所給條件下的活性直接成比例。
SDS-PAGE和免疫印跡在Novex(Novex，San Diego)梯度Tricine 10-20％凝膠上進(jìn)行變性和還原條件(在別處所述(SvH))下的SDS-PAGE。用Hoefer印跡儀將蛋白帶印跡至硝酸纖維素膜上。為了對(duì)果膠酸裂解酶-胰島素融合蛋白進(jìn)行免疫印跡，使用產(chǎn)生于House of Ivan Svendsen，Cell Technology的單克隆抗體F19作為第一抗體，用偶聯(lián)了過氧化物酶的兔抗鼠抗體作為第二抗體(來自DakoImmunoglobulins，Copenhagen，丹麥)。
對(duì)果膠酸裂解酶-GLP1的免疫印跡分別用第一抗體(產(chǎn)生于house of PiaKirschhoff Borre，Cell Technology的單克隆αGLP 26.1)進(jìn)行。與過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體的結(jié)合通過與3-氨基-9-乙基咔唑的反應(yīng)來顯示。
實(shí)施例1果膠酸裂解酶與JP170α-淀粉酶的融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)JP170α-淀粉酶的編碼DNA序列(公開于國際專利申請(qǐng)WO95/26397，其已全文引入作為參考)用以下兩種寡核苷酸組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增145424.正向.NheI(SEQ ID 29)
5’-GAC AAT GTC GAC AAT GTA AAA TCA ATC GTC AAG CAAAAT GCC GGA GTC GGC AAA ATC AAT CCA GCT AGC ATT GAA GGCAGA CAT CAT AAT GGG ACA AAT GGG ACG101450.反向(SEQ ID 30)5’-CAT GGT GAA CCA AAG TGA AAC CSalI和NheI的限制性位點(diǎn)均已下劃線。在最終構(gòu)建中，將NheI位點(diǎn)插入果膠酸裂解酶基因最后一個(gè)密碼子的右側(cè)。
用編碼JP170α-淀粉酶的質(zhì)粒DNA樣品(pMOL944)作為模板，用Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)根據(jù)廠商建議，在含dNTP各200μM、AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer，Cetus，美國)2.5個(gè)單位以及每種引物各100pmol的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
PCR反應(yīng)用DNA熱循環(huán)儀(MJ Research，PCT-200)進(jìn)行。94℃保溫1分鐘，然后以94℃30秒的變性、60℃1分鐘的退火、72℃2分鐘的延伸進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上進(jìn)行電泳分析。約1.6kb的DNA片段的出現(xiàn)表示對(duì)基因片段的擴(kuò)增是正確的。
對(duì)PCR片段的再克隆編碼JP170的純化PCR片段和上述pMB541質(zhì)粒用SalI和NotI消化，1639 bp的JP170片段和5722bp的pMB541載體片段用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)從瓊脂糖凝膠中純化。然后將所述兩種片段用T4 DNA連接酶和緩沖系統(tǒng)(Biolab，英國)于16℃連接16小時(shí)。將連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的PL1801，將這些細(xì)胞鋪板至添加了10mg卡那霉素的LB瓊脂平板上。從過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)液中分離質(zhì)粒DNA，對(duì)多個(gè)克隆進(jìn)行分析。
將一個(gè)這樣的陽性克隆于上述所用的添加了10mg/ml卡那霉素的瓊脂平板上進(jìn)行多次劃線接種，將該克隆保藏為MOL1578。將MOL1578克隆在TY-10μg/ml卡那霉素中37℃過夜培養(yǎng)，次日取1ml細(xì)胞，用Qiaprep SpinPlasmid Miniprep試劑盒#27106按廠商針對(duì)枯草芽孢桿菌質(zhì)粒制備的建議從細(xì)胞中分離質(zhì)粒。對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示了對(duì)應(yīng)于融合蛋白果膠酸裂解酶-JP170的DNA序列。將該質(zhì)粒命名為pMOL1578。編碼果膠酸裂解酶-JP170的ORF的總DNA序列示于SEQ ID 11，其衍生的蛋白序列見SEQ ID 12。在SEQ ID 12中的氨基酸具有以下起點(diǎn)和特征
a.a.1-29地衣芽孢桿菌的amyL的信號(hào)肽。
a.a.30-343地衣芽孢桿菌的果膠酸裂解酶。
a.a.344-345衍生自NheI克隆位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸。
a.a.346-349IEGR接頭。
a.a.350-834JP170淀粉酶。
果膠酸裂解酶-JP170融合蛋白的表達(dá)和檢測(cè)編碼果膠酸裂解酶-JP170雜合體的MOL1578和兩株參照菌株編碼JP170的MOL944和編碼果膠酸裂解酶的MB541均在BPX培養(yǎng)基上以30℃和300rpm培養(yǎng)5天。將100ml無細(xì)胞上清與100ml SDS上樣緩沖液混合，取25μl上樣至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEX凝膠(Novex，美國)。按廠商建議在XcellTMMini-Cell(NOVEX，美國)上電泳，后續(xù)凝膠操作包括用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色和干燥均按廠商建議進(jìn)行。
約90kDa的蛋白帶的出現(xiàn)表示質(zhì)粒pMOL1578上所編碼的果膠酸裂解酶-JP170融合蛋白已在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。但凝膠上的主要帶分別對(duì)應(yīng)于兩種核心酶果膠酸裂解酶(35kDa)和JP170淀粉酶(55kDa)，表明融合蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)期間或剛剛轉(zhuǎn)運(yùn)之后被加工。
按上述方法分析MOL1578、MOL944和MB541這三種菌株的樣品的α-淀粉酶活性，以確定JP170的產(chǎn)量。表1顯示，在含有果膠酸裂解酶-JP170融合蛋白的MOL1578菌株中淀粉酶的產(chǎn)量相對(duì)于僅編碼JP170的MOL944菌株有2.2倍的顯著增加。結(jié)論是，顯然果膠酸裂解酶可作為諸如JP170淀粉酶這樣的大分子酶的分泌增強(qiáng)子。
表1菌株酶 單位MOL944a JP170 0.93MOL944b JP170 1.26MOL1578a 果膠酸裂解酶-JP1702.32MOL1578b 果膠酸裂解酶-JP1702.52MB541a果膠酸裂解酶 0.1MB541b果膠酸裂解酶 0.1實(shí)施例2果膠酸裂解酶與GLP-1融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)人類GLP-1激素可使2型糖尿病患者體內(nèi)血糖水平正常化(WO9517510-A1)。GLP-1(7-37)類似物有31個(gè)氨基酸長，很難用傳統(tǒng)技術(shù)從酵母中產(chǎn)生(Egel-Mitani等(inpress)，在YPS1已被破壞的釀酒酵母菌株中表達(dá)的各種異源多肽的產(chǎn)量增加)。
GLP-1基因用下述重疊引物擴(kuò)增。將編碼特異性Kex2識(shí)別位點(diǎn)Lys-Arg(KR)的DNA序列插入緊鄰GLP-1(7-37)的第一密碼子的上游，使得可在果膠酸裂解酶和GLP-1(7-37)之間進(jìn)行特異性裂解。(參見關(guān)于Kex2的文獻(xiàn)，如Ledgerwood等(1995)，生物化學(xué)雜志，卷308(1)321-325，或Ghosh，S.等(1996)基因(Amsterdam)，卷176(1-2)249-255)。以下兩種引物用于擴(kuò)增GLP-1(7-37)-Kex2序列149217.正向.NheI(SEQ ID 31)5’-TGT TTG CTA GCA AAA GAC ATG CCG AAG GAA CAT TTACGT CAG ACG TCT CAT CAT ATT TAG AAG GCC AGG CAG CCA AAG149216.反向.EagI(SEQ ID 32)5’-GCA AAC GGC CGA AAG CTT ATC CCC TGC CTT TGA CTAACC ATG CGA TGA ATT CTT TGG CTG CCT GGC CTT C重疊延伸反應(yīng)在含dNTP各200μM、AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer，Cetus，美國)2.5個(gè)單位以及每種引物各100pmol的PCR緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠)中進(jìn)行。
該重疊延伸反應(yīng)用DNA熱循環(huán)儀(MJ Research，PCT-200)進(jìn)行。94℃保溫1分鐘，然后以55℃1分鐘的退火、72℃0.5分鐘的延伸進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。所擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl在2.0％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上進(jìn)行電泳分析。129bp的DNA片段的出現(xiàn)指示擴(kuò)增是正確的。
GLP1片段的再克隆用pMOL1578質(zhì)粒作為載體，將GLP-1(7-37)序列克隆在同一讀碼框內(nèi)以便制備融合構(gòu)建體。GLP-1(7-37)片段和pMOL1578載體用NheI和EagI消化。如針對(duì)pMOL1578的構(gòu)建所述，純化119bp的GLP-1(7-37)片段和5779bp的載體片段并克隆。
將一個(gè)陽性PL1801轉(zhuǎn)化型克隆于上述所用的添加了10mg/ml卡那霉素的瓊脂平板上進(jìn)行多次劃線接種，將該克隆保藏為MOL1635。將MOL1635克隆在TY-10μg/ml卡那霉素中37℃過夜培養(yǎng)，次日取1ml細(xì)胞，用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep試劑盒#27106按廠商針對(duì)枯草芽孢桿菌質(zhì)粒制備的建議從細(xì)胞中分離質(zhì)粒。對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示了對(duì)應(yīng)于果膠酸裂解酶-GLP-1(7-37)融合蛋白的DNA序列。將該質(zhì)粒命名為pMOL1621。
編碼果膠酸裂解酶-GLP-1(7-37)的ORF的總DNA序列示于SEQ ID13，其衍生的蛋白序列見SEQ ID 14。在SEQ ID 14中的氨基酸具有以下起點(diǎn)和特征a.a.1-29地衣芽孢桿菌的amyL的信號(hào)肽。
a.a.30-343地衣芽孢桿菌的果膠酸裂解酶。
a.a.344-345衍生自NheI克隆位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸。
a.a.346-347Kex2內(nèi)切蛋白酶加工位點(diǎn)。
a.a.348-378人類GLP-1(7-37)序列。
果膠酸裂解酶-GLP-1(7-37)融合蛋白的表達(dá)和檢測(cè)用質(zhì)粒pMOL1621轉(zhuǎn)化蛋白酶較弱的枯草芽孢桿菌菌株WB600asn。其中一個(gè)攜有pMOL1621的WB600asn命名為MOL1636。將該菌株在含有10μg/ml卡那霉素的Cal18-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在帶有兩個(gè)擋板的500ml燒瓶中的100ml培養(yǎng)基上接種約10E8個(gè)細(xì)胞，37℃以300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。取樣，離心培養(yǎng)液，回收無細(xì)胞上清，通過傳統(tǒng)Western印跡進(jìn)行分析(見圖1和2)。
實(shí)施例3帶PEPT接頭的果膠酸裂解酶與GLP1之融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)為了避免在果膠酸裂解酶與GLP-1(7-37)之間的區(qū)域中的蛋白酶剪切性攻擊，插入了一個(gè)穩(wěn)定的接頭區(qū)。所選接頭序列為WO 99/01543中報(bào)道的PEPT基元。所述接頭基元出現(xiàn)在親本酶與CBD(纖維素酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域)之間的要求專利權(quán)的纖維素酶中，在本發(fā)明中，該P(yáng)EPT接頭已證實(shí)在枯草芽孢桿菌中針對(duì)蛋白酶剪切作用是穩(wěn)定的。
為確保在果膠酸裂解酶與GLP-1之間有一個(gè)正確間隔臂，將該基元重復(fù)兩次，使之成為PEPTPEPT(2x(PEPT))。將編碼特異性Kex2識(shí)別位點(diǎn)Lys-Arg(KR)的DNA序列插入緊鄰GLP-1(7-37)的第一密碼子的上游，使得可于純化后，在果膠酸裂解酶和GLP-1(7-37)之間進(jìn)行特異性裂解(參見關(guān)于Kex2的文獻(xiàn)，如Ledgerwood等(1995)，生物化學(xué)雜志，卷308(1)321-325，或Ghosh，S.等(1996)基因(Amsterdam)，卷176(1-2)249-255)。
用pMOL1621為模板進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。PCR條件如實(shí)施例1所述。兩個(gè)引物對(duì)的序列如下1.引物對(duì)159639.正向.NheI(SEQ ID 33)5’-CCA GCT AGC CCA GAA CCA ACA CCT GAG CCC ACA AAAAGA CAT GCC GAA GGA ACA TTT ACG101450.反向(SEQ ID 34)5’-CAT GGT GAA CCA AAG TGA AAC C2.引物對(duì)B5456H02.反向(SEQ ID 35)5’-GGT GTT GGT TCT GGG CTA GCT GGA TTG ATT TTG CCG142670.正向(SEQ ID 36)5’-CAG CGA TAA TTA CAA CAG GAC G兩種PCR反應(yīng)物經(jīng)Qiagen柱(QIAquick PCR純化試劑盒#28106)純化為220bp和400bp的片段。在上述PCR條件下用每種片段各10ng進(jìn)行SOE(序列重疊延伸)。PCR循環(huán)為94℃保溫1分鐘，然后以94℃10秒的變性、55℃30秒的退火、72℃2分鐘的延伸進(jìn)行10個(gè)循環(huán)。將100pmol側(cè)翼引物142670.正向(SEQ ID 36)和101450.反向(SEQ ID 34)加入該反應(yīng)中，再進(jìn)行20輪PCR。所擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl在2.0％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上進(jìn)行電泳分析。600bp的DNA片段的出現(xiàn)表示擴(kuò)增是正確的。
GLP1片段的再克隆用pMOL1578質(zhì)粒作為載體，將上述2x(PEPT)-GLP-1(7-37)基因克隆在同一讀碼框內(nèi)以便制備融合構(gòu)建體。將含有PEPT-GLP-1(7-37)序列和pMOL1578載體的600bp PCR片段用NheI和EagI消化。如針對(duì)pMOL1578的構(gòu)建所述，純化137bp的PEPT-GLP-1(7-37)片段和5779bp的載體片段并克隆。
將陽性WB600asn轉(zhuǎn)化克隆于上述所用的添加了10mg/ml卡那霉素的瓊脂平板上進(jìn)行多次劃線接種，將該克隆保藏為MOL1698。將MOL1698克隆在TY-10μg/ml卡那霉素中37℃過夜培養(yǎng)，次日取1ml細(xì)胞，用QiaprepSpin Plasmid Miniprep試劑盒#27106按廠商針對(duì)枯草芽孢桿菌質(zhì)粒制備的建議從細(xì)胞中分離質(zhì)粒。對(duì)純化的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示了對(duì)應(yīng)于果膠酸裂解酶-接頭-GLP1融合蛋白的DNA序列。將該質(zhì)粒命名為pMOL1698。
編碼果膠酸裂解酶-接頭-的ORF的總DNA序列示于SEQ ID 15，其衍生的蛋白序列見SEQ ID 16。在SEQ ID 16中的氨基酸具有以下起點(diǎn)和特征a.a.1-29地衣芽孢桿菌的amyL的信號(hào)肽。
a.a.30-343地衣芽孢桿菌的果膠酸裂解酶。
a.a.344-345衍生自NheI克隆位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸。
a.a.346-353PEPTPEPT接頭區(qū)。
a.a.354-355Kex2內(nèi)切蛋白酶加工位點(diǎn)。
a.a.356-386人類GLP-1(7-37)序列。
果膠酸裂解酶-接頭-GLP-1(7-37)融合蛋白的表達(dá)和檢測(cè)編碼果膠酸裂解酶雜合體的MOL1698在含有10μg/ml卡那霉素的Cal18-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在帶有兩個(gè)擋板的500ml燒瓶中的100ml培養(yǎng)基上接種約10E8個(gè)細(xì)胞，37℃以300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。取樣，離心培養(yǎng)液，回收無細(xì)胞上清，通過傳統(tǒng)Western印跡進(jìn)行分析，取25μl上樣至4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEx凝膠(Novex，美國)。按廠商建議在XcellTMMini-Cell(NOVEX，美國)上電泳，后續(xù)凝膠操作，包括用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色和干燥均按廠商建議進(jìn)行(見圖3)。
實(shí)施例4果膠酸裂解酶和單鏈人類胰島素(MI3)的融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)編碼人類胰島素MI3的DNA序列通過將SEQ ID 18所限定的其蛋白序列逆轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。涉及該蛋白序列的專利申請(qǐng)是WO 95/34666。使該DNA序列在密碼子應(yīng)用方面進(jìn)一步優(yōu)化，以便接近SEQ ID 1所述果膠酸裂解酶中的密碼子應(yīng)用性。這只需簡(jiǎn)單通過使用果膠酸裂解酶SEQ ID 1的最優(yōu)選密碼子作為編碼SEQ ID 18所示MI3分子的密碼子便可實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選DNA序列可在SEQ ID 17中找到。
為了在果膠酸裂解酶和MI3之間具有彈性區(qū)(接頭)，我們使用了由PEPT重復(fù)單元組成的接頭。我們特別為本實(shí)驗(yàn)使用了該P(yáng)EPT的兩個(gè)重復(fù)單元。再次使密碼子最優(yōu)化至接近果膠酸裂解酶的密碼子使用特點(diǎn)。
為了能在從培養(yǎng)細(xì)胞的上清中純化出融合蛋白后，從果膠酸裂解酶上裂解出MI3，將一個(gè)Kex2內(nèi)切蛋白酶加工位點(diǎn)導(dǎo)入緊鄰該接頭之后以及MI3蛋白之前。(參見關(guān)于Kex2的文獻(xiàn)，如Ledgerwood等(1995)，生物化學(xué)雜志，卷308(1)321-325，或Ghosh，S.等(1996)基因(Amsterdam)，卷176(1-2)249-255)。這里所用Kex2位點(diǎn)為Lys-Arg(KR)。果膠酸裂解酶-接頭-Kex-MI3編碼質(zhì)粒的構(gòu)建如下設(shè)計(jì)兩個(gè)重疊寡核苷酸，使得當(dāng)它們?cè)赑CR反應(yīng)中使用時(shí)將導(dǎo)致形成主要由SEQ ID 17中所示序列、接頭編碼序列、蛋白酶酶解位點(diǎn)編碼序列和再克隆DNA片段所必需的兩個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)組成的DNA片段。
該DNA片段的構(gòu)建如下兩個(gè)重疊寡核苷酸Pecl.ISFUS.NheI.upper(#149171)(SEQ ID 37)5′-CAT CATGCT AGCCCG GAA CCA ACA CCA GAG CCG ACC AAA AGG TTCGTC AAC CAG CAT TTA TGT GGC TCA CAT CTG GTA GAG GCC CTG TAT TTAGTC TGT GGA GAG AGG GGA TTC TTT TAT ACA CCGPecl.ISFUS.NotI.Lower(#149172)(SEQ ID 38)5′-GCG TTG AGA CGC GGC CGCTTA GTT GCA GTA ATT TTC CAG CTG ATATAA GCT ACA GAT TGA TGT GCA ACA CTG TTC AAC AAT GCC TTT CGC GGCTTT CGG TGT ATA AAA GAA TCC CCT CTCNheI和NotI的限制性位點(diǎn)均已下劃線。
所述寡核苷酸用于PCR反應(yīng)，該反應(yīng)在添加了每種dNTP各200μM、HiFidelityTMExpand酶混合物2.6個(gè)單位以及每種引物各200pmol的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)中進(jìn)行。
用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)進(jìn)行。94℃保溫1分鐘，然后以94℃15秒的變性、60℃1分鐘的退火、72℃2分鐘的延伸進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，再以94℃15秒的變性、60℃1分鐘的退火、72℃2分鐘的延伸(在此延伸步驟中，每個(gè)循環(huán)加20秒)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。所擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl在1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上用ReadyLoad 100bp DNA序列梯(GibcoBRL，丹麥)作為分子量標(biāo)志進(jìn)行電泳分析。0.2kb的清晰DNA片段表示所述兩個(gè)引物的正確裝配。
如上述所得的PCR產(chǎn)物取45μl用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，美國)按廠商建議進(jìn)行純化。純化的DNA在50μl 10mM Tris-HCl，pH8.5中洗脫。
5μl pMOL1578和25μl純化的PCR片段用NheI和NotI消化，消化后的pMOL1578在0.8％的低熔點(diǎn)瓊脂糖(SeaPlaque GTG，F(xiàn)MC)凝膠中電泳，從凝膠中切出相關(guān)片段，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，美國)按廠商建議進(jìn)行純化。所分離的PCR DNA片段在消化后用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，美國)按廠商建議進(jìn)行簡(jiǎn)單純化。純化的DNA在50μl10mM Tris-HCl，pH8.5中洗脫。
然后將PCR片段和質(zhì)粒連接至經(jīng)過NheI-NotI消化并純化的pMOL1578上。該連接在16℃，用每種DNA片段各0.5μg、T4 DNA連接酶1個(gè)單位、和T4連接酶緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)實(shí)施過夜。
用該連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的枯草芽孢桿菌PL2306細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板于LBPG-10μg/ml卡那霉素平板上。37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，選數(shù)個(gè)克隆在新鮮瓊脂平板上再劃線接種，并于含有10μg/ml卡那霉素的TY液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。次日取1ml細(xì)胞，用Qiaprep Spin Plasmid Miniprep試劑盒#27106按廠商針對(duì)枯草芽孢桿菌質(zhì)粒制備的建議從細(xì)胞中分離質(zhì)粒。用該質(zhì)粒DNA作為DNA測(cè)序的模板。
保留含有對(duì)應(yīng)于果膠酸裂解酶DNA序列的兩個(gè)克隆，其中所述DNA序列與接頭以及MI3基因?yàn)橐蝗诤象w，將這些克隆命名為MB929-1和MB929-3。編碼信號(hào)肽-果膠酸裂解酶-接頭-MI3的ORF的DNA序列如SEQID 19所示，所衍生的蛋白序列見SEQ ID 20。
在SEQ ID 20中的氨基酸具有以下特征a.a.1-29地衣芽孢桿菌的amyL的信號(hào)肽。
a.a.30-343地衣芽孢桿菌的果膠酸裂解酶。
a.a.344-345衍生自NheI克隆位點(diǎn)的兩個(gè)氨基酸。
a.a.346-353PEPT接頭。
a.a.354-355Kex2內(nèi)切蛋白酶加工位點(diǎn)a.a.356-408人類單鏈胰島素MI3。
從如上所述的相同克隆過程中分離出一個(gè)克隆，其不產(chǎn)生全長果膠酸裂解酶-接頭-MI3，將該克隆命名為pMB929-5。DNA測(cè)序顯示，在緊鄰PEPT-KRFVN序列之后導(dǎo)入了一個(gè)終止密碼子。用該克隆作為表達(dá)和檢測(cè)分析中的對(duì)照。
果膠酸裂解酶-接頭-MI3融合蛋白的表達(dá)用pMB929質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛋白酶較弱的枯草芽孢桿菌菌株WB600asn。將其中一個(gè)攜有pMB929-1的WB600asn菌株命名為MB1009-1。將一個(gè)攜有pMB929-3的WB600asn菌株命名為MB1009-4。將其中一個(gè)攜有pMB929-5的WB600asn菌株命名為MB1009-7并作為陰性對(duì)照菌株使用(如上所述)。這些菌株在含有10μg/ml卡那霉素的Cal18-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在帶有兩個(gè)擋板的500ml燒瓶中的100ml培養(yǎng)基上接種約10E8個(gè)細(xì)胞，37℃以300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。取樣，離心培養(yǎng)液，回收無細(xì)胞上清，通過傳統(tǒng)Western印跡進(jìn)行分析(見圖4)。
實(shí)施例5果膠酸裂解酶與GLP-1的融合蛋白的表達(dá)以及kex2p裂解蛋白酶較弱的WB600asn菌株用質(zhì)粒pMOL1621轉(zhuǎn)化，以備過表達(dá)和裂解果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)融合產(chǎn)物。將該菌株在含有10μg/ml卡那霉素的Cal18-2培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在帶有兩個(gè)擋板的500ml燒瓶中的100ml培養(yǎng)基上接種約10E8個(gè)細(xì)胞，37℃以300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。取樣，離心培養(yǎng)液，回收無細(xì)胞上清并分析。Kex2p裂解如下進(jìn)行a)0.8ml上清b)0.1ml 1M Na2HPO4，pH7.5c)加入0.1ml Kex2p(制劑號(hào)KMK0087，Steen B.Mortensen，NovoNordisk贈(zèng))d)于37℃水浴中保溫2小時(shí)e)將樣品快速冷凍并保存在-20℃。
將樣品立即解凍，然后進(jìn)行SDS-PAGE。30μl樣品用20μl樣品緩沖液和5μl PMSF(溶于異丙醇)以及5μl 25％w/v DTT處理，然后煮沸。每孔上樣10μl。每份樣品均描述在工作單(worksheet)上。所有其它條件如前文材料和方法部分所述。
圖5證實(shí)，果膠酸裂解酶-ASKR-GLP1(7-37)融合蛋白被Kex2p有效裂解，使GLP1產(chǎn)物被GLP1抗體識(shí)別。GLP1的產(chǎn)量在50mg/l的水平上。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>用于多肽的表達(dá)和分泌的果膠酸裂解酶融合體<130><140><141><160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1026<212>DNA<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580<220><221>CDS<222>(1)..(1026)<400>1atg aag aaa tta atc agc atc atc ttt atc ttt gta tta ggg gtt gtc 48Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Ile Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val1 5 10 15ggg tca ttg aca gcg gcg gtt tcg gca gaa gca gct tct gcc tta aac 96Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn20 25 30tcg ggc aaa gta aat ccg ctt gcc gac ttc agc tta aaa ggc ttt gcc 144Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala35 40 45gca cta aac ggc gga aca acg ggc gga gaa ggc ggt cag acg gta acc 192Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr50 55 60gta aca acg gga gat cag ctg att gcg gca tta aaa aat aag aat gca 240Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala65 70 75 80aat acg cct tta aaa att tat gtc aac ggc acc att aca aca tca aat 288Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn85 90 95aca tcc gca tca aag att gac gtc aaa gac gtg tca aac gta tcg att 336Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile100 105 110gtc gga tca ggg acc aaa ggg gaa ctc aaa ggg atc ggc atc aaa ata 384Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile115 120 125tgg cgg gcc aac aac atc atc atc cgc aac ttg aaa att cac gag gtc 432Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val130 135 140gcc tca ggc gat aaa gac gcg atc ggc att gaa ggc cct tct aaa aac 480Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn145 150 155 160att tgg gtt gat cat aat gag ctt tac cac agc ctg aac gtt gac aaa 528Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys165 170 175gat tac tat gac gga tta ttt gac gtc aaa aga gat gcg gaa tat att 576Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile180 185 190aca ttc tct tgg aac tat gtg cac gat gga tgg aaa tca atg ctg atg 624Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met195 200 205ggt tca tcg gac agc gat aat tac aac agg acg att aca ttc cat cat 672Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His210 215 220aac tgg ttt gag aat ctg aat tcg cgt gtg ccg tca ttc cgt ttc gga 720Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly225 230 235 240gaa ggc cat att tac aac aac tat ttc aat aaa atc atc gac agc gga 768Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly245 250 255att aat tcg agg atg ggc gcg cgc ate aga att gag aac aac ctc ttt 816Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe260 265 270gaa aac gcc aaa gat ccg att gtc tct tgg tac agc agt tca ccg ggc 864Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly275 280 285tat tgg cat gta tcc aac aac aaa ttt gta aac tct agg ggc agt atg 912Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met290 295 300ccg act acc tct act aca acc tat aat ccg cca tac agc tac tca ctc 960Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu305 310 315 320gac aat gtc gac aat gta aaa tca atc gtc aag caa aat gcc gga gtc 1008Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val325 330 335ggc aaa atc aat cca taa 1026Gly Lys Ile Asn Pro340<210>2<211>341<212>PRT<213>地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580<400>2Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Ile Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val1 5 10 15Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn20 25 30Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala35 40 45Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr50 55 60Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala65 70 75 80Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn85 90 95Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile100 105 110Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile115 120 125Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val130 135 140Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn145 150 155 160Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys165 170 175Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile180 185 190Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met195 200 205Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His
210 215 220Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly225 230 235 240Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly245 250 255Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe260 265 270Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly275 280 285Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met290 295 300Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu305 310 315 320Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala Gly Val325 330 335Gly Lys Ile Asn Pro340<210>3<211>1530<212>DNA<213>芽孢桿菌屬(Bacillus)的種<220><221>CDS<222>(1)..(1530)<400>3atg atg aag atg aga aaa gca tta agt gta tta gtg att ttc gga tta 48Met Met Lys Met Arg Lys Ala Leu Ser Val Leu Val Ile Phe Gly Leu1 5 10 15ttc gta tct ttt ttt agt ttt ggt cat caa gga gca gaa gcg gca tca 96Phe Val Ser Phe Phe Ser Phe Gly His Gln Gly Ala Glu Ala Ala Ser20 25 30ttt cag tct aat aaa aat tat cat cta gtg aat gtg aac agt ggc aag 144Phe Gln Ser Asn Lys Asn Tyr His Leu Val Asn Val Asn Ser Gly Lys35 40 45tac tta gaa gtg ggg gct gcc tca aca gag aac ggt gca aat gtc caa 192Tyr Leu Glu Val Gly Ala Ala Ser Thr Glu Asn Gly Ala Asn Val Gln50 55 60caa tgg gaa aat acg aat tgt cat tgt caa caa tgg cga ttg gtg caa 240Gln Trp Glu Asn Thr Asn Cys His Cys Gln Gln Trp Arg Leu Val Gln65 70 75 80aat cag gat ggt tat tat gag att gta aac cga cat agt ggc aaa gca 288Asn Gln Asp Gly Tyr Tyr Glu Ile Val Asn Arg His Ser Gly Lys Ala85 90 95ttg gat gta ttt gaa cgt tct tca gct gat gga gcg aac att gta caa 336Leu Asp Val Phe Glu Arg Ser Ser Ala Asp Gly Ala Asn Ile Val Gln100 105 110tgg gat tcg aat gga cgt agc aat caa caa tgg acg att caa caa gtg 384Trp Asp Ser Asn Gly Arg Ser Asn Gln Gln Trp Thr Ile Gln Gln Val115 120 125ggt tcc tct tat aaa ata gtt agc aga cat agt ggg aag gca ctc gaa 432Gly Ser Ser Tyr Lys Ile Val Ser Arg His Ser Gly Lys Ala Leu Glu130 135140gta ttt aac cat tct aat caa aat gga gca aat gtc gta cag tgg caa 480Val Phe Asn His Ser Asn Gln Asn Gly Ala Asn Val Val Gln Trp Gln145 150 155 160gat ttt ggt aat ccg aat caa ctt tgg aat atc gtc gag gtt ggt tca 528Asp Phe Gly Asn Pro Asn Gln Leu Trp Asn Ile Val Glu Val Gly Ser165 170 175gga caa gct cac gat ttc agt aag ccg ttg ggg tat gcc tca atg aat 576Gly Gln Ala His Asp Phe Ser Lys Pro Leu Gly Tyr Ala Ser Met Asn180 185 190ggc ggg acc act ggc ggt caa ggt gga cga gtc gaa tac gcg agt act 624Gly Gly Thr Thr Gly Gly Gln Gly Gly Arg Val Glu Tyr Ala Ser Thr195 200 205ggc tct caa cta caa aaa tta atc gat gat cga agt cga agc aat aat 672Gly Ser Gln Leu Gln Lys Leu Ile Asp Asp Arg Ser Arg Ser Asn Asn210 215 220ccc aat caa cca ctt acc att tat gta act ggg aaa atc acc ctg caa 720Pro Asn Gln Pro Leu Thr Ile Tyr Val Thr Gly Lys Ile Thr Leu Gln225 230 235 240aac tcc tct gat gat aaa att gaa gtg aaa aat cat cgt gga caa gct 768Asn Ser Ser Asp Asp Lys Ile Glu Val Lys Asn His Arg Gly Gln Ala245250 255cat gaa ata cgt aat ctg tct atc ata ggt caa gga aca aga gga gag 816His Glu Ile Arg Asn Leu Ser Ile Ile Gly Gln Gly 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Asn Phe Phc370 375 380cac aat ctt aat tcc aga gtt ccg tta att cga ttc gca gat gtt cat 1200His Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Leu Ile Arg Phe Ala Asp Val His385 390 395 400atg gtt aac aac tat ttc aaa gat att aaa gat aca gca att aat agt 1248Met Val Asn Asn Tyr Phe Lys Asp Ile Lys Asp Thr Ala Ile Asn Ser405 410 415cgt atg gga gca aga gta ttt gta gaa aat aac tat ttt gag aat gta 1296Arg Met Gly Ala Arg Val Phe Val Glu Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Val420 425 430gga tca ggt caa caa gat ccg acc aca cga caa att aaa act gct gtt 1344Gly Ser Gly Gln Gln Asp Pro Thr Thr Arg Gln Ile Lys Thr Ala Val435 440 445ggg tgg ttt tat ggt agt tct agc act gga tat tgg aat tta aga gga 1392Gly Trp Phe Tyr Gly Ser Ser Ser Thr Gly Tyr Trp Asn Leu Arg Gly450 455 460aat caa ttt att aac aca cca tca agc cac ttg tct tcc aca acg aat 1440Asn Gln Phe Ile Asn Thr Pro Ser Ser His Leu Ser Ser Thr Thr Asn465 470 475 480ttc aca cca cct tat cag ttc aac gcc caa tcc gct caa gat gca aag 1488Phe Thr Pro Pro Tyr Gln Phe Asn Ala Gln Ser Ala Gln Asp Ala Lys485 490 495caa gcc gtt gaa cag ttt tcg ggt gta ggg gtt gta cag tag 1530Gln Ala Val Glu Gln Phe Ser Gly Val Gly Val Val Gln500 505 510<210>4<211>509<212>PRT<213>芽孢桿菌屬(Bacillus)的種<400>4Met Met Lys Met Arg Lys Ala Leu Ser Val Leu Val Ile Phe Gly Leu1 5 10 15Phe Val Ser Phe Phe Ser Phe Gly His Gln Gly Ala Glu Ala Ala Ser20 25 30Phe Gln Ser Asn Lys Asn Tyr His Leu Val Asn Val Asn Ser Gly Lys35 40 45Tyr Leu Glu Val Gly Ala Ala Ser Thr Glu Asn Gly Ala Asn Val Gln50 55 60Gln Trp Glu Asn Thr Asn Cys His Cys Gln Gln Trp Arg Leu Val Gln65 70 75 80Asn Gln Asp Gly Tyr Tyr Glu Ile Val Asn Arg His Ser Gly Lys Ala85 90 95Leu Asp Val Phe Glu Arg Ser Ser Ala Asp Gly Ala Asn Ile Val Gln100 105 110Trp Asp Ser Asn Gly Arg Ser Asn Gln Gln Trp Thr Ile Gln Gln Val115 120 125Gly Ser Ser Tyr Lys Ile Val Ser Arg His Ser Gly Lys Ala Leu Glu130 135 140Val Phe Asn His Ser Asn Gln Asn Gly Ala Asn Val Val Gln Trp Gln145 150 155 160Asp Phe Gly Asn Pro Asn Gln Leu Trp Asn Ile Val Glu Val Gly Ser165 170 175Gly Gln Ala His Asp Phe Ser Lys Pro Leu Gly Tyr Ala Ser Met Asn180 185 190Gly Gly Thr Thr Gly Gly Gln Gly Gly Arg Val Glu Tyr Ala Ser Thr195 200 205Gly Ser Gln Leu Gln Lys Leu Ile Asp Asp Arg Ser Arg Ser Asn Asn210 215 220Pro Asn Gln Pro Leu Thr Ile Tyr Val Thr Gly Lys Ile Thr Leu Gln225 230 235 240Asn Ser Ser Asp Asp Lys Ile Glu Val Lys Asn His Arg Gly Gln Ala
245 250 255His Glu Ile Arg Asn Leu Ser Ile Ile Gly Gln Gly Thr Arg Gly Glu260 265 270Phe Asp Gly Ile Gly Leu Arg Leu Ile Asn Ala His Asn Val Ile Val275 280 285Arg Asn Leu Ser Ile His His Val Arg Ala Gly Ser Gly Glu Gly Thr290 295 300Ser Ile Glu Val Thr Gln Gly Ser Lys Asn Ile Trp Ile Asp His Asn305 310 315 320Glu Phe Tyr Ser Gln Leu Asp Gly Asn Asn Asn Pro Asp Leu Tyr Asp325 330 335Gly Leu Val Asp Ile Lys Arg Asn Ser Glu Tyr Ile Thr Val Ser Trp340 345 350Asn Lys Phe Glu Asn His Trp Lys Thr Met Leu Val Gly His Thr Asp355 360 365Asn Ala Ser Leu Ala Pro Asp Lys Val Thr Tyr His His Asn Phe Phe370 375 380His Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Leu Ile Arg Phe Ala Asp Val His385 390 395 400Met Val Asn Asn Tyr Phe Lys Asp Ile Lys Asp Thr Ala Ile Asn Ser405 410 415Arg Met Gly Ala Arg Val Phe Val Glu Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Val420 425 430Gly Ser Gly Gln Gln Asp Pro Thr Thr Arg Gln Ile Lys Thr Ala Val435 440 445Gly Trp Phe Tyr Gly Ser Ser Ser Thr Gly Tyr Trp Asn Leu Arg Gly450 455 460Asn Gln Phe Ile Asn 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155 160Glu Leu Tyr Asn Ser Leu Asp Val His Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu165 170 175Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr180 185 190Val His Asp Ser Trp Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp195 200 205Ser Tyr Asn Arg Lys Ile Thr Phe His Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Leu210 215 220Asn Ser Arg Val Pro Ser Ile Arg Phe Gly Glu Ala His Ile Phe Ser225 230 235 240Asn Tyr Tyr Asn Gly Ile Asn Glu Thr Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly245 250 255Ala Lys Val Arg Ile Glu Glu Asn Leu Phe Glu Arg Ala Asn Asn Pro260 265 270Ile Val Ser Arg Asp Ser Arg Gln Val Gly Tyr Trp His Leu Ile Asn275 280 285Asn His Phe Thr Gln Ser Thr Gly Glu Ile Pro Thr Thr Ser Thr Ile290 295300Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Gln Ala Thr Pro Val Gly Gln Val305 310 315 320Lys Asp Val Val Arg Ala Asn Ala Gly Val Gly Lys Val Thr Pro325 330 335<210>7<211>1077<212>DNA<213>芽孢桿菌屬(Bacillus)的種<220><221>CDS<222>(1)..(1077)<400>7atg act aaa gtc ttt aaa ttg tta ctg gca tta gct ctc gtt tta cca 48Met Thr Lys Val Phe Lys Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Val Leu Pro1 5 10 15gtt atc tca ttt agt tct cct gcc tcg caa gct gct tca aat cag cca 96Val Ile Ser Phe Ser Ser Pro Ala Ser Gln Ala Ala Ser Asn Gln Pro20 25 30act tct aac gga cca caa ggc tat gcg tca atg aat gga ggg aca acc 144Thr Ser Asn Gly Pro Gln Gly Tyr Ala Ser Met Asn Gly Gly Thr Thr35 40 45ggt ggt gca ggc ggc cgt gtc gaa tat gca agc acc gga gcg caa att 192Gly Gly Ala Gly Gly Arg Val Glu Tyr Ala Ser Thr Gly Ala Gln Ile50 55 60cag caa ttg ata gat aat cgc agc cga agt aat aac cct gat gaa cca 240Gln Gln Leu Ile Asp Asn Arg Ser Arg Ser Asn Asn Pro Asp Glu Pro65 70 75 80tta acg att tat gta aac gga acg att aca caa gga aat tcc cca cag 288Leu Thr Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Gln Gly Asn Ser Pro Gln85 90 95tcc ctt ata gat gtt aaa aat cac cgt gga aaa gct cat gaa att aaa 336Ser Leu Ile Asp Val Lys Asn His Arg Gly Lys Ala His Glu Ile Lys100 105 110aac atc tct att atc ggt gta gga aca aat gga gag ttt gat ggc att 384Asn Ile Ser Ile Ile Gly Val Gly Thr Asn Gly Glu Phe Asp 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Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ala20 25 30Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly35 40 45Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr50 55 60Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys65 70 75 80Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr85 90 95Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val100 105 110Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile115 120 125Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His130 135 140Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser145 150 155 160Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val165 170 175Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu180 185 190Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met195 200 205Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe210 215 220His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg225 230 235 240Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp245 250 255Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn260 265 270Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser275 280 285Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly290 295 300Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr305 310 315 320Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys Gln Asn Ala325 330 335Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro340 345 350Thr Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu355 360 365Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys370 375 380Ala Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu385 390 395 400Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
405<210>21<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN5494<400>21gtcgccgggg cggccgctat caattggtaa ctgtatctca gc42<210>22<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN5495<400>22gtcgcccggg agctctgatc aggtaccaag cttgtcgacc tgcagaatga ggcagcaaga 60agat 64<210>23<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN5938<400>23gtcggcggcc gctgatcacg taccaagctt gtcgacctgc agaatgaggc agcaagaaga 60t 61<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN5939<400>24gtcggagctc tatcaattgg taactgtatc tcagc35<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN7864<400>25aacagctgat cacgactgat cttttagctt ggcac35<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物#LWN7901<400>26aactgcagcc gcggcacatc ataatgggac aaatggg 37<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Pecl.B.lich.upper.SacII<400>27ctaactgcag ccgcggcagc ttctgcctta aactcgggc39<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Pecl.B.lich.lower.NotI<400>28gcgttgagac gcgcggccgc tgaatgcccc ggacgtttca cc42<210>29<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物145424.正向.NheI<400>29gacaatgtcg acaatgtaaa atcaatcgtc aagcaaaatg ccggagtcgg caaaatcaat 60ccagctagca ttgaaggcag acatcataat gggacaaatg ggacg 105<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物101450.反向<400>30catggtgaac caaagtgaaa cc 22<210>31<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物149217.正向.NheI<400>31tgtttgctag caaaagacat gccgaaggaa catttacgtc agacgtctca tcatatttag 60aaggccaggc agccaaag 78<210>32<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物149216.反向.EagI<400>32gcaaacggcc gaaagcttat cccctgcctt tgactaacca tgcgatgaat tctttggctg 60cctggccttc70<210>33<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物159639.正向.NheI<400>33ccagctagcc cagaaccaac acctgagccc acaaaaagac atgccgaagg aacatttacg 60<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物101450.反向<400>34catggtgaac caaagtgaaa cc 22<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物B5456H02.反向<400>35ggtgttggtt ctgggctagc tggattgatt ttgccg 36<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物142670.正向<400>36cagcgataat tacaacagga cg 22<210>37<211>126<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Pecl.ISFUS.NheI.upper(#149171)<400>37catcatgcta gcccggaacc aacaccagag ccgaccaaaa ggttcgtcaa ccagcattta 60tgtggctcac atctggtaga ggccctgtat ttagtctgtg gagagagggg attcttttat 120acaccg126<210>38<211>120<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Pecl.ISFUS.NotI.Lower(#149172)<400>38gcgttgagac gcggccgctt agttgcagta attttccagc tgatataagc tacagattga 60tgtgcaacac tgttcaacaa tgcctttcgc ggctttcggt gtataaaaga atcccctctc 120
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。
2.一種細(xì)胞，其包含一種能編碼依次融合在一個(gè)開放讀碼框內(nèi)的至少以下元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，含至少2個(gè)氨基酸的接頭，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為革蘭氏陽性微生物細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為芽孢桿菌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自地衣芽孢桿菌、Bacillus clausii、短芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝固芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、和Bacillus agaradhaerens。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是由蛋白酶識(shí)別并切割的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是氨基酸序列Lys-Arg(KR)。
8.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)。
9.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是當(dāng)所融合的多肽被所述細(xì)胞分泌時(shí)被切割的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)是能被化學(xué)化合物切割的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中所述化學(xué)化合物是溴化氰或羥胺。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述果膠酸裂解酶選自以下果膠酸裂解酶，這些酶含有選自SEQ ID 2、SEQ ID 4、SEQ ID 6、SEQ ID 8、和SEQID 10的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述果膠酸裂解酶是一種同系物，其與含有選自SEQ ID 2、SEQ ID 4、SEQ ID 6、SEQ ID 8、和SEQ ID10的氨基酸序列的果膠酸裂解酶具有70％的氨基酸序列相似性。
14.權(quán)利要求2-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中出現(xiàn)在接頭中的氨基酸殘基至少25％為脯氨酸。
15.權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述接頭依次包含氨基酸的至少一個(gè)循環(huán)重復(fù)Pro-Glu-Pro-Thr，Glu-Pro-Thr-Pro，Pro-Thr-Pro-Glu，或Th-Pro-Glu-Pro(PEPT，EPTP，PTEP，或TPEP)。
16.權(quán)利要求2-13中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述接頭包含氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)的至少一個(gè)重復(fù)。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽選自激素，功能型激素類似物，酶和人工多肽。
18.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ ID12中350-834位所示氨基酸序列的α-淀粉酶。
19.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ ID14中348-378位或SEQ ID 16中356-386位所示氨基酸序列的人類GLP-1(7-37)激素類似物。
20.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽為包含SEQ ID18中所示氨基酸序列的單鏈人類胰島素(MI3)。
21.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述外源多肽包含含有SEQID 20中356-408位所示氨基酸序列的單鏈人類胰島素(MI3)。
22.一種生產(chǎn)蛋白的方法，該方法包括以下步驟i)構(gòu)建合適的細(xì)胞，其包含一種能編碼融合在一個(gè)開放讀碼框(ORF)內(nèi)的至少以下依次排列之元件的DNA序列，所述元件有果膠酸裂解酶，用于蛋白酶剪切的靶位點(diǎn)，和外源多肽，ii)在適于生長和分泌的條件下培養(yǎng)步驟i)所構(gòu)建的細(xì)胞，和iii)回收含有外源多肽的蛋白。
23.權(quán)利要求22的方法，其進(jìn)一步包括在回收所述外源多肽之前或之后對(duì)所述蛋白進(jìn)行蛋白酶剪切的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能改進(jìn)融合蛋白的生產(chǎn)的細(xì)胞,所述融合蛋白包含一種與外源多肽融合的天然果膠酸裂解酶,本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)所述融合蛋白的方法。
文檔編號(hào)C07K14/62GK1353762SQ00808288
公開日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日
發(fā)明者邁克爾·D·拉斯馬森, 馬茲·E·比約恩瓦德, 伊凡·迪爾斯 申請(qǐng)人:諾維信公司