雞新城疫糖蛋白病毒抗原的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利說明】
[000。 本申請是申請?zhí)枮?201410196203.2"，申請日為"2014年5月9印'，發(fā)明名稱為"雞 新城疫糖蛋白病毒抗原的制備方法及其產(chǎn)品"的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明設及一種雞新城疫病毒抗原的制備方法，尤其設及利用重組桿狀病毒在昆 蟲體內制備雞新城疫病毒抗原的方法W及由該制備方法得到重組抗原，本發(fā)明還設及一種 雞新城疫病毒抗原基因家蠶桿狀病毒呈遞載體的制備方法及其產(chǎn)品，本發(fā)明進一步設及它 們在預防、治療或診斷雞新城疫疫苗或試劑中的用途，屬于雞新城疫病毒抗原的制備和應 用領域。
【背景技術】
[0003] 新城疫于1926年首先發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞，同年發(fā)現(xiàn)于英國的新城，由于新城疫危 害嚴重，國際獸疫局(OIE)把新城疫定為烈性傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。世界動 物衛(wèi)生組織將其列為必須報告的動物疫病。因此，尋找一種理想的免疫保護性抗原用于該 病的快速診斷與免疫防治十分迫切。
[0004] 隨著桿狀病毒作為載體，在體外和體內轉導動物細胞并獲得目的蛋白的高效表 達，桿狀病毒日益顯示了其作為非復制型載體在基因治療中的應用前景，開辟了桿狀病毒 應用研究的新領域化iiser A.Am J陸armacogenomies,3(1 ):53-63,2003)。從桿狀病毒表 達系統(tǒng)建立W來，已有1000多種外源基因在運一系統(tǒng)中得到了表達。1985年，Maeda用家蠶 Bombyx mori NPV作表達載體，在家蠶體內高水平地表達出人a干擾素W來，W中國和日本 為代表的有蠶國家，不斷發(fā)展家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)，已成為比較成熟的一種蛋白表達技 術（呂鴻聲.昆蟲病毒分子生物學免疫研究，1998)。與細菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相 比，家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在一定方面具有許多優(yōu)勢，因此充分利用家蠶資源來生產(chǎn)外源 蛋白，對生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)具有重要意義。但是，至今尚無利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲體 內成功表達雞新城疫病毒抗原的報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用家蠶桿狀病毒 表達系統(tǒng)在昆蟲體內表達雞新城疫病毒抗原的方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是通過W下技術方案來實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種雞新城疫病毒抗原的制備方法，包括W下步驟：
[0008] (1)將雞新城疫病毒的糖蛋白基因F或優(yōu)化后的雞新城疫病毒的糖蛋白基因F-O克 隆到桿狀病毒運載載體中，構建得到轉移表達載體;或者將雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸 酶基因HN或優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN-O克隆到桿狀病毒運載載體 中，構建得到轉移表達載體;或者將雞新城疫病毒的糖蛋白基因F或優(yōu)化后的雞新城疫病毒 的糖蛋白基因F-O與雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN或優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝 素神經(jīng)氨酸酶基因HN-O串聯(lián)在一起的序列克隆到桿狀病毒運載載體中，構建得到轉移表達 載體；
[0009] (2)將構建得到的轉移表達載體與桿狀病毒DNA共轉染昆蟲細胞W發(fā)生同源重組 或轉座，獲得重組桿狀病毒；
[0010] (3)將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞;培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細 胞，誘導表達相應的雞新城疫病毒抗原;收獲并純化所表達的抗原。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種雞新城疫病毒抗原基因家蠶桿狀病毒呈遞載體的制備方法， 該方法包括W下步驟：
[0012] (1)將雞新城疫病毒的糖蛋白基因F或優(yōu)化后的雞新城疫病毒的糖蛋白基因F-O與 哺乳動物細胞啟動子一起克隆到桿狀病毒運載載體中，構建得到轉移表達載體;或者將雞 新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN或優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN-0與哺乳動物細胞啟動子一起克隆到桿狀病毒運載載體中，構建得到轉移表達載體;或者優(yōu) 化后的雞新城疫病毒的糖蛋白基因F-O與優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因 HN-O串聯(lián)在一起的序列與哺乳動物細胞啟動子一起克隆到桿狀病毒運載載體中，構建得到 轉移表達載體；
[0013] (2)將構建得到的轉移表達載體與桿狀病毒DNA共轉染昆蟲細胞W發(fā)生同源重組 或轉座，獲得重組桿狀病毒，將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞擴增重組桿狀病毒， 即得。
[0014] 所述雞新城疫病毒基因F的核巧酸序列為SEQ ID NO. 1所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示;優(yōu)化后的雞新城疫病毒的糖蛋白基因F-O的核巧酸序列為SEQ ID NO.5所示， 其氨基酸序列為SEQ ID NO.6所示;所述雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN的核巧酸 序列為SEQ ID NO. 3所示，其氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示;所述優(yōu)化后的雞新城疫病毒 血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN-O的核巧酸序列為SEQ ID NO.7所示，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.8所示;所述優(yōu)化后的雞新城疫病毒的糖蛋白基因F-O與優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝 素神經(jīng)氨酸酶基因HN-O串聯(lián)在一起的序列(F-IRES-HN-O)為SEQ ID NO.9所示。
[0015] 所述的桿狀病毒運載載體選自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWa-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、BlucBacII(祀化）、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEI、pAcJPI、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF 8、 pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG，pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、 pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、 地 acl、地 ac2、地 lueBacIII、地 IueBa 地 is、祀 ￥55、111乂1￥，口161化〇、口1￥6化、口1￥化61、口1￥口10、 pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pW(MEXl.l、pSYNXIVVI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV ￥1-、9化1391、9化 1392、9化 1393、9￥1941、9化 945、9￥1 985、9￥18曰。、981030、91^(：-5或其 它類似的桿狀病毒同源重組或轉座載體，優(yōu)選為PVL1393桿狀病毒運載載體。
[0016] 所述的哺乳動物細胞啟動子包括但不限于CAG啟動子、PEC啟動子、CMV啟動子、人 巨細胞病毒早期啟動子、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤長末端重復序列、人 Ieukosial in基因啟動子、鼠3-憐酸甘油激酶1基因啟動子、人泛素蛋白C基因啟動子、雞0-肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構成的雜合啟動子、鼠乳房瘤病毒啟動子;優(yōu)選為CAG啟 動子。
[0017] 所述的桿狀病毒選自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、 OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV或Sp 1 tNPV;優(yōu)選為家蠶桿狀病毒親本株BmNPV。
[0018] 本發(fā)明中所構建的重組桿狀病毒包括：（1)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV-NDV-F JBmNPV-NDV-F-O 或 rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-0;(2)重組家蠶核型多角體病毒 rBmNPV-CAG-NDV-F-O或rBmNPV-CAG-NDV-F-1RES-HN-O。所述的昆蟲宿主選自家蠶（BombyX mori )、野蠶 (Bombyx mandarina)、藍麻蠶（Phi Iosamia cynthia ricim)、精蠶（Dictyoploca japanica)、轉蠶（Philosamia cynthia pryeri )、昨蠶（Antheraea pernyi)、日本昨蠶 (Antheraea yamamai )、野天蠶（Antheraea po Iyphymus )、首猜尺曖（Atographa califorica)、茶尺曖化Ctropis obliqua)、甘蘭夜蛾（Mamesha brassicae)、斜紋夜蛾 (Spodoptera Iittoralis)、秋粘蟲（Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni)、行軍蟲（Thaumetopoea wiIkinsoni)、棉鈴蟲（胎Iiothis armigera)、美國棉鈴蟲 巧eliothis zea)、煙青蟲巧eliothis assul1:a)、煙草夜蛾巧eliothis virescens)、東方 粘蟲（Pseudaletia separata)、舞毒蛾化 ymantria dispar)等；優(yōu)選為家蠶（Bombyx mori) O
[0019] 本發(fā)明中所述的感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲 幼蟲或蛹體;更優(yōu)選為將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或 蛹，在感染3-6天后收集含各種雞新城疫病毒糖蛋白抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻 漿;其中，所述的蛹體最優(yōu)為1-2天的早期嫩蛹。
[0020] 雞新城疫病毒抗原基因F、優(yōu)化的基因F-0、雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因 HN或優(yōu)化后的雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基因HN-O W及串聯(lián)的F-IRES-HN-O基因在多 角體啟動子、CAG啟動子或別的病毒和真核生物的強啟動子控制之下，在家蠶中高效表達雞 新城疫病毒抗原，所表達的抗原或所構建的重組桿狀病毒具有良好的免疫原性，能夠為包 括雞在內的動物提供良好的免疫保護，可用于制備預防雞新城疫的疫苗或藥物組合物。
[0021] 本發(fā)明所構建的雞新城疫病毒抗原基因家蠶桿狀病毒呈遞載體通過注射或口服 等方式將其進入到動物體內后，能在動物體內高效呈遞抗原基因，有效抵御新城疫病毒的 攻擊。
[0022] ELISA檢測表明，本發(fā)明中所構建的重組桿狀病毒rBmNPV-NDV-F中NDV-F基因在家 蠶中表達量高，平均每頭家蠶或蠶蛹中的表達量至少Img，在3200倍稀釋甚至更高稀釋度下 仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應。Western blotting結果表明，在重組病毒感染后家 蠶血淋己樣品的上清液中可檢測到59kD大小的特異性條帶。動物免疫實驗證明，NDV-F基因 實驗組全部產(chǎn)生針對NDV的抗體，50支苗/組實驗組的檢測效價可達1600倍W上；而對照組 沒有檢測到抗體;攻毒后，50支苗/組免疫組沒有雞死亡，而對照組攻毒后3天內全部死亡， 表現(xiàn)典型的雞新城疫癥狀。
[0023] 本發(fā)明所構建的重組桿狀病毒巧mNPV-NDV-F-0中NDV-F-O基因在家蠶中表達量 高，比NDV-F基因在家蠶中表達量高出2-3倍，在6400倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到 抗原與抗體的特異性反應。Western blotting結果表明，在重組病毒感染后家蠶血淋己樣 品的上清液中可檢測到59kD大小的特異性條帶。動物免疫實驗證明，實驗組全部產(chǎn)生針對 NDV的抗體，100支苗/組實驗組檢測效價可達3200倍W上；而對照組沒有檢測到抗體;攻毒 后，100支苗/組免疫組沒有雞死亡，而對照組攻毒后3天內全部死亡，表現(xiàn)典型的雞新城疫 癥狀。
[0024] ELISA 法檢測 rBmNPV-NDV-F-IRES-HN-0 中 NDV-F-IRES-HN-O 抗原蛋白表達量，結果 表明，在3200倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測到抗原與抗體的特異性反應。Western blotting結果表明在重組病毒感染后家蠶的血淋己樣品的上清液中可檢測到F、HN蛋白大 小約為59kD、64kD的特異性條帶。動物免疫實驗證明，實驗組全部產(chǎn)生針對NDV的抗體，200 支疫苗/組實驗組檢測效價可達3200倍W上；而對照組沒有檢測到抗體；攻毒后，200支疫 苗/組免疫組沒有雞死亡，而對照組攻毒后3天內全部死亡，表現(xiàn)典型的雞新城疫癥狀。
[0025] 用本發(fā)明所構建的雞新城疫病毒抗原基因家蠶桿狀病毒呈遞載體rBmNPV-CAG-NDV-F-O(或重組桿狀病毒rBmNPV-CAG-NDV-F-0)注射或口服實驗雞，實驗組全部產(chǎn)生針對 NDV的抗體，抗體滴度達到1600左右，而對照組檢測到的抗體滴度在20左右;攻毒后，免疫組 沒有雞死亡，而對照組攻毒后3天內全部死亡，表現(xiàn)典型的雞新城疫癥狀。用所構建的雞新 城疫病毒抗原基因家蠶桿狀病毒呈遞載!"BmNPV-CAG-NDV-F-I RES-HN-O (或重組桿狀病毒 rBmNPV-