一個用于鑒定與內質網upr反應相關植物因子的基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物基因工程領域，特別的屬于一種可用于鑒定本氏煙中與內質網 UPR反應相關植物因子的基因W及該基因的應用。
【背景技術】
[0002] 蛋白在內質網上翻譯表達后往往需要進一步的折疊或修飾才具有生物學功能或 被運輸?shù)较鄳膩喖毎髦行旭偣δ堋．斣趦荣|網上未折疊或錯誤折疊的蛋白大量積累 時，就導致了內質網的脅迫，從而引起了內質網的未折疊蛋白反應（Unfolded protein response, UPR)。除了機體自身的未折疊蛋白能引起UPR外，病原物的入侵(如病毒、細菌等） 和非生物脅迫也能引起機體的IPR反應。UPR反應的最終目的是為了讓機體的內質網恢復功 能，緩解內質網上的脅迫，W及阻止錯誤的蛋白對細胞的毒害。然而當WR反應一直持續(xù)而 不能解除時，就能引起細胞的程序性死亡(Programmed cell death,PCD)。
[0003] 文獻報道，一些植物病毒入侵寄主后能引起植物的WR反應，且UPR反應往往是由 病毒編碼的單個蛋白引起的。如馬鈴馨X病毒(Potato virus X，PVX)編碼的TG化3蛋白，憲 菁花葉病毒（Turnip mosaic virus,TuMV)編碼的6K2蛋白和水稻黑條矮縮病毒（Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)編碼的plO蛋白都能引起植物的UPR反應。定量結果 顯示表達了運些蛋白后，與WR相關的標志基因都被大量的上調了。植物發(fā)生WR的過程是 一個相對復雜的生理過程，現(xiàn)在已知的參與IPR的植物因子還是相當?shù)挠邢?，且很多是通過 同源分析酵母和哺乳動物的UPR因子得來。運就需要提供新的途徑來篩選或發(fā)現(xiàn)W及驗證 內質網IPR反應相關的植物因子。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明小組驚奇的發(fā)現(xiàn)一個大蒜X病毒(2015年采集于浙江省杭州市，采集人魯宇 文KGarlic virus X)分離物編碼的pll蛋白能夠誘導UPR反應，并當其通過PVX過量表達 后，能引起與IPR相關的本氏煙的程序性死亡。利用運種死亡表型的差異可W做為篩選本氏 煙中與內質網UPR反應相關植物因子或者基因。
[0005] -方面，本發(fā)明提供一種含有PVX:pll侵染性克隆質粒在篩選本氏煙中與內質網 UPR反應相關植物因子中的用途。大蒜X病毒(Garlic virus X)分離物編碼的Pll蛋白的基 因序列插入到PVX侵染性克隆載體PgRioe中獲得過質粒載體在篩選本氏煙中與內質網UPR 反應相關植物因子中的用途，其中編碼Pll蛋白的基因序列如SEQ N0:4所示。優(yōu)選的，通過 酶切連接的方法，在該Pll基因兩端引入ClaI和Sail,然后連接到用相同酶切酶切的PVX侵 染性克隆載體PgRioe中。
[0006] 另一方面，本發(fā)明提供一種大蒜X病毒(Garlic virus X)分離物編碼的Pll蛋白的 基因序列在在篩選或鑒定本氏煙中與內質網WR反應相關植物因子中的用途，其中該序列 如沈Q NO:4所示。
[0007]本發(fā)明提供一種植物UPR相關因子的鑒定方法，該方法包括：利用大蒜X病毒 (Garlic virus X)分離物編碼的pll蛋白的基因序列插入到PVX侵染性克隆載體PgRioe中 獲得過質粒載體，其中編碼Pll蛋白的基因序列如SEQ N0:4所示。
[000引在一些優(yōu)選的方式中，植物WR相關因子為本氏煙bZIP60基因，其序列如SEQ NO: 7 所示。
[0009] 在一些優(yōu)選的方式中，通過酶切連接的方法，在該Pll基因兩端引入ClaI和Sail， 然后連接到用相同酶切酶切的PVX侵染性克隆載體PgRioe中。在一些優(yōu)選的方式中，還獲得 同樣的對照質粒載體，該載體包括巧光蛋白基因（GFP)的質粒載體PVX = GFP質粒載體，所使 用的載體也是PgRioe。
[0010] 在一些優(yōu)選的方式中，將bZIP60基因 3'末端300bp的序列通過限制性酶切位點 XbaI和SmaI連接插入到相同酶切位點的TRV RNA2載體上獲得含有bZIP60基因的質粒載體。 在一些優(yōu)選的方式中，使用TRV:00為對照質粒載體，即使用的載體為TRV RNA2空載體。
[0011] 優(yōu)選的，分別將包括有Pll基因的克隆載體PgRioe和包括有bZIP60基因的TRV RNA2載體通過電擊轉化到農桿菌中。優(yōu)選的，對獲得的陽性農桿菌載體的表達菌液對煙草 葉片進行接種，其中先在兩批煙草葉片上分別接種包括有bZIP60基因的TRV RNA2加TRV RNAl和TRV: 00加TRV RNAl的農桿菌表達菌液，然后再在同時在煙草植物上接種包括有Pl 1 基因的克隆載體PgRioe的農桿菌表達液。優(yōu)選的，觀察是否具有減緩作用。
[0012] 優(yōu)選的，前述所有質粒所轉化的宿主載體為農桿菌載體進行相關蛋白的表達。 [001引優(yōu)選的，所述的植物為本氏煙煙草。
[0014] 在本發(fā)明中將一種新發(fā)現(xiàn)大蒜X病毒(Garlic virus X，GarVX)編碼的Pll蛋白嵌 合到馬鈴馨X病毒(Potato virus X，PVX)中，根據接種了嵌合病毒后癥狀表型的差異在本 氏煙的病毒誘導基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)的植株中篩選出與內質 網未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)相關的植物因子。
[001引研究表明，該Pll蛋白能誘導本氏煙的UPR反應，并在PVX載體中過量表達時，能誘 發(fā)與UPR相關的細胞程序性死亡。當與UPR相關的細胞因子被下調后，PVX:pll誘導與UPR相 關的細胞程序性死亡的程度也會有相應的減輕，其表型與對照相比為壞死斑明顯減少，從 而鑒別出與UPR相關未知的植物細胞因子。
[0016] 本領域的一般技術人員了解，本發(fā)明所使用的一些質粒載體也可W采用另外的別 的載體來使用，表達載體也可W是大腸桿菌，農桿菌，酵母菌等。植物可W是煙草，例如本氏 煙草，也可是是其他雙子葉植物。
【附圖說明】
[0017] 圖1.為PVX載體(P曲106)圖譜示意圖。
[001引圖2.PVX:pll在本氏煙中引起IP時目關的細胞程序性死亡的實驗結果圖。
[0019] 圖3.定量PCR顯示TRV:bZIP60的植株中bZIP60基因明顯下調結果圖。
[0020] 圖4.沉默了 bZIP60植株在PVX:pll侵染過程中的壞死程度明顯緩和的實驗結果 圖。
[0021] 有益效果
[0022] 本發(fā)明提供一種新的Pll蛋白W及含有該基因的表達載體，可W評估已知的IPR反 應的植物因子在細胞死亡中的作用和影響，還可W利用該載體篩選一些未知的W財直物因 子。
【具體實施方式】
[0023] 為了充分論述本發(fā)明的可行性，本發(fā)明舉例進行說明本發(fā)明如何實現(xiàn)，但是運個 舉例并不構成對本發(fā)明的限制，本發(fā)明的范圍體現(xiàn)在本發(fā)明的權利要求中。
[0024] 實施例子l:pll基因的克隆
[0025] 通過本實驗室已經報道的大蒜X病毒余杭分離物序列（在genbank登錄的序列編 號:AJ292229)進行同源分析，AJ292229序列為如下序列（SEQ N0:1):
[0026]
[0027]設計如下引物獲得Pll基因全長序列：pll-f〇rward:5'ATGA GCTTCACTCC CCC 3' (沈Q N0:2);pll-forward:5'TTAG TGGGGTATAG TAGA 3'（沈Q N0:3)。
[002引Pll蛋白全長序列的獲得如下步驟：
[0029] 1.首先將取得的大蒜病樣用Trizol法提取總RNA，方法如下：
[0030] (1).取適量樣品置2ml離屯、管中，用液氮速凍后迅速研磨，然后加入1ml Trizol (lml/1 OOmg樣品），劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。4°C，13,000巧m離屯、5min。
[0031] (2).取上清于1.5ml E卵endo計管中，加200iil體積氯仿，劇烈混勻15sec，室溫靜 置2~3miru4°C ,13,000巧m離屯、30min。
[0032] (3).底層為氯仿相，中層為蛋白相，上層是含RNA的無色水相。取上層水相于新的 離屯、管中，加入1/5體積氯仿，振蕩混勻，室溫靜置2~3miru4°C ,13,000巧m離屯、30min。
[0033] (4).將上層水相轉入一新的離屯、管，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，-70°C放置 化。4°C ,13,000巧m離屯、30min。
[0034] (5).棄上清，加入1ml預冷的75%乙醇（用RNase-打ee水配制），洗涂沉淀。4°C，13， 000巧m 離屯、5min。
[0035] (6).重復步驟5-次，徹底洗凈殘留鹽份。
[0036] (7).棄上清，室溫驚干，加適量RNase-打ee水溶解。
[0037] 2.用步驟1提取的總RNA反轉錄合成CDNA第一鏈，具體操作如下表的配比和條件： 「00381

LUUW」 將上還試刑依次加入KNase-化ee EP菅甲，混勻后，42心111，721：日111111。完成后用十 PCR擴增獲取Pll基因序列，PCR擴增的試劑配比如下：
[0042] 悠巧浩片熙講巧席別細Il吿巧浩的Pll甚巧全長席別加下WRQ NO.4).
[0040]
[0041]
[0043]
[0044] 實施例子2:載體構建
[0045] l.PVX:pll質粒載體的構建
[0046] PVX表達Pll的載體構建是通過酶切連接的方法如下：在Pll基因（SEQ N0:4)兩端 引入限制性酶切位點ClaI和Sail,然后連接到用相同酶切酶切的PVX侵染性克隆載體 pGR106(Gene bank基因序列號:AY297843)中（圖1)，獲得PVX:pll質粒，引物設計如下：口11-ClaI-forward:5'ATCGATATGA GCTTCACTCC CCC 3'(SEQ NO：5)；piI-Sal!-forward:5' GTCGACTTAG TGGGGTATAG TAGA 3'（沈Q N0:6)。獲得PVX:pll質粒，具體結構如圖I所示。
[0047] 按照上述相同的方法，構建另一個對照質粒載體，其中Pll基因被常用的巧光蛋白 基因(GFP)(該序列是常用公知的基因序列，再次不在重復敘述)序列替代獲得PVX:GFP質粒 載體作為對照。
[004引 2.TRV:VIGS-bZIP60質粒載體的構建。
[0049] 本氏煙中 bZIP60 基因 NibenlOlScf 24096g00018.1)基于煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV)的病毒誘導基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)的載體 構建方法如下(bZIP60也是UPR反應中的一個重要的標記基因）：
[0050] 將bZIP60基因3'末端30化P的序列通過限制性酶切位點XbaI和SmaI連接插入到相 同酶切位點的TRV RNA2載體