一種als突變型基因在抗除草劑方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物蛋白和植物抗除草劑領域。具體而言，本發(fā)明設及水稻的乙酷乳 酸合成酶(ALS)突變蛋白，該蛋白能賦予植物尤其水稻抗乙酷乳酸合成酶抑制劑類除草劑 的特性。本發(fā)明公開了該蛋白的序列，W及它們在植物抗除草劑領域中的應用。
【背景技術】
[0002] 雜草是制約農業(yè)生產穩(wěn)產高產的不利因素。與傳統(tǒng)依靠栽培措施、人工除草和機 械除草等方法相比，化學除草劑的使用是一種高效的、簡便的和經濟的治理雜草方法。
[0003] 乙酷乳酸合成酶(ALS)(也稱乙酷徑酸合成酶，AHAS;EC 4.1.3.18)抑制劑類除草 劑WALS作為祀標而導致雜草死亡，主要包括橫酷脈類（Sulfonylureas，SU)、咪挫嘟酬類 (Imidazolinones , IMI )、S挫喀晚類（TriazoIopyrimidines ,TP)、喀晚氧（硫）苯甲酸類 [PyrimidinyIthio(or oxy)-benzo曰tes,PTB;pyrimidinyl-c曰rboxyherbicides;PCs]和橫 酷胺基幾基S挫嘟酬類（Sulfonylamino-ca;rbonパ1:;riazolinones,SCT)等l3類化合物。ALS 抑制劑類除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、低毒高效等特點，目前已大面積推廣使用。但運 些除草劑對一般不具有抗(耐)除草劑特性的農作物本身也產生藥害，極大限制了其使用時 間和使用空間，如需要在農作物播種前一段時間使用除草劑才能避免農作物遭受藥害。培 育抗(耐)除草劑作物品種可減少作物藥害、拓寬除草劑的使用范圍。
[0004] 成熟的ALS蛋白大約由670個氨基酸組成，其序列在不同物種間高度保守。ALS蛋白 在Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、T巧 537、T巧 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654、 化I 669等氨基酸位點（W模式植物擬南芥的ALS氨基酸位置計算)發(fā)生突變可W產生ALS抑 制劑類除草劑抗性，運在多種農作物(包括玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵等）、模式植物擬 南芥和上百種雜草中均有報道。
[0005] 其中，水稻已知的抗ALS抑制劑突變位點包括Gly 95、Ala 96、Ala 122、lYp 548、 Ser 627、Ser 653和Gly 654eALS突變體抗除草劑水平與ALS氨基酸突變的位置有關，還與 突變后的氨基酸種類及突變氨基酸的數目有關。
[0006] 目前，ALS抑制劑類除草劑的作用機理尚未確定，很難提前預測ALS蛋白其它氨基 酸位點的突變是否會產生除草劑抗性，只能依賴于科研人員長期、艱苦的實踐探索，并憑 借一些運氣才可能發(fā)現ALS蛋白新的除草劑抗性位點。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一種ALS突變型基因。
[000引本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述ALS突變型基因所編碼的ALS蛋白。
[0009] 本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了含有上述的ALS突變型基因的表達盒、重組 載體或細胞。
[0010] 本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了上述ALS突變型基因、蛋白、表達盒、重組載 體或細胞在制備綠色植物除草劑方面的應用。
[0011] 本發(fā)明還要解決的技術問題是提供了獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法。
[0012] 本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供了鑒定具有除草劑抗性的綠色植物的方法。
[0013] 本發(fā)明人通過長期、艱苦的研究，對釉稻優(yōu)良恢復系9311的EMS突變植株進行長 期、不斷地篩選，發(fā)現了一系列ALS突變蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突變蛋白和新 ALS突變蛋白，其對ALS抑制劑類除草劑不敏感，從而使得植物具有ALS抑制劑類除草劑抗 性。本發(fā)明在植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，還開 發(fā)了運些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因如水稻等作物中的應用。
[0014] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下：一種ALS突變型基因，其在水 稻的ALS基因序列的第75位核巧酸由G變成核巧酸C、第339位核巧酸由A變成核巧酸C和第 710位核巧酸由C突變?yōu)楹饲伤酺。
[001引上述ALS突變型基因其核巧酸序列如沈Q ID No:3所示。
[0016] 上述的ALS突變型基因所編碼的ALS蛋白。該突變來源于水稻，與對ALS抑制劑類除 草劑敏感的野生型水稻ALS(如Genbank登錄號BAB20812.1)相比，其氨基酸在Gln25、 Glnll3、Ala237(突變植株2)位點上發(fā)生突變;或其在水稻的ALS基因序列的第75位核巧酸 由G變成核巧酸C、第339位核巧酸由A變成核巧酸C，該ALS突變型基因其核巧酸序列如SEQ ID No:l所示，即其氨基酸在Gln25、Glnll3(突變植株1)位點上發(fā)生突變(其氨基酸序列如 沈Q ID NO.2所示）。
[0017] 目前還沒有報道表明，在來自水稻的ALS的Gln25、Glnl 13和Ala237位點突變，會使 得水稻具有ALS抑制劑類除草劑抗性。
[0018] 上述的ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]本
【發(fā)明內容】
還包括表達盒、重組載體或細胞，其含有上述的AL狹變型基因。
[0020] 本
【發(fā)明內容】
還包括上述的ALS突變型基因、蛋白、表達盒、重組載體或細胞在綠色 植物抗除草劑方面的應用。
[0021] 上述綠色植物為水稻、煙草、擬南芥、棉花等。
[0022] 本
【發(fā)明內容】
還包括獲得具有除草劑抗性的綠色植物的方法，包括如下步驟：
[0023] 1)使綠色植物包含所述的ALS突變型基因；或
[0024] 2)使綠色植物表達所述的ALS蛋白。
[0025] 上述的方法，包括轉基因、雜交、回交或無性繁殖步驟。
[0026] 鑒定權利要求上述的方法獲得的綠色植物的方法，包括W下步驟：
[0027] 1)測定所述綠色植物是否包含上述的ALS突變型基因；或，
[002引 2)測定所述綠色植物是否表達上述的ALS蛋白。
[0029] 有益效果：田間噴施ALS抑制劑類除草劑"百壟通"的實驗結果表明，含有本發(fā)明的 ALS突變蛋白的水稻3-4葉幼苗在施用3mL百壟通/L水(9倍推薦使用濃度)后，植株仍然正常 生長發(fā)育和結實，而野生型水稻3-4葉幼苗在施用ImL百壟通/化水（1倍推薦使用濃度)30天 后表現為整株死亡。
【附圖說明】
[0030] 圖1百壟通除草劑篩選獲得的抗性水稻突變體；
[00川圖2 PCR擴增ALS基因5'端結果圖；第I泳道為Marker;Marker分子量從上到下依次 為化6、3此、化6、1此、75化9、50069、25化9、10化9，第2泳道為9311野生型水稻0臟，第3~13 泳道為抗除草劑突變植株1的DNA，其它泳道為抗除草劑突變植株2的DNA;目的片段長度 1162bp；
[0032] 圖3 PCR擴增ALS基因3'端結果圖；第1泳道為MarkenMarker分子量從上到下依次 為化6、3此、化6、1此、75化9、50069、25化9、10化9，第2泳道為9311野生型水稻0臟，第3~13 泳道為抗除草劑突變植株1的DNA，其它泳道為抗除草劑突變植株2的DNA;目的片段長度 120 化P;
[0033] 圖4A和圖4B分別為百壟通除草劑對野生型和抗除草劑突變植株1和突變植株2的 ALS酶活性抑制；
[0034] 圖5百壟通除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和突變植株2的ALS 酶活性抑制的吸光值測定；
[0035] 圖6A和圖6B分別為甲喀橫隆除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和 突變植株2的ALS酶活性抑制；
[0036] 圖7甲喀橫隆除草劑對野生型和抗除草劑水稻突變體突變植株1和突變植株2的 ALS酶活性抑制的吸光值測定。
[0037] 圖8A突變突變植株1的ALS基因的過量表達載體BamHI/SacI雙酶切驗證圖；第1泳 道為Marker !Marker分子量從上到下依次為 19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、 1489、92化P，第2泳道為未經酶切的重組載體，第3泳道為重組載體經BamHI/SacI雙酶切后 產生的基因片段和質粒片段DNA;圖8B突變突變植株2的ALS基因的過量表達載體BamHI/ SacI雙酶切驗證圖；第1泳道為未經酶切的重組載體，第2泳道為Marker，分子量從上到下依 次為化b、3kb、、化b、750bp、500bp、250bp、IOObp，第3、4泳道為重組載體經BamHI/SacI 雙 酶切后產生的基因片段和質粒片段DNA，基因片段大小符合預期，證明載體構建成功；
[0038] 圖9轉突變型ALS基因水稻PCR檢測圖；總共有21個泳道，第1泳道、第9泳道、第19泳 道為Marker; Marker 分子量從上到下依次為f5kb、3kb、化b、1 kb、750bp、500bp、250bp、1 OObp， 第8泳道、第18泳道為為野生型DNA，作為陰性對照，第20、21泳道為質粒DNA，作為陽性對照， 第3~7泳道為突變植株1的轉基因DNA，其他泳道為突變植株2的轉基因DNA。
【具體實施方式】
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