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一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細胞模型及其用途和使用方法

文檔序號:9919801閱讀:518來源:國知局
一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細胞模型及其用途和使用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種用于篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的細胞模型,屬于醫(yī)藥 生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 慢性缺氧病變,如慢性阻塞性肺疾病,是一種具有氣流受限特征的疾病,與肺部對 香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應及慢性缺氧有關。隨著病程的進展,長期 慢性炎癥及缺氧會引發(fā)缺氧性肺血管收縮,肺血管內(nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重構等最終導致 肺動脈高壓的發(fā)生,肺血管重構與病程進展及其并發(fā)肺動脈高壓密切相關。病理變化過程 主要設及機體細胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)氧變化,相關的功能基因則為缺氧誘導因子 (Hypoxia inducible factor-la,HIF-la)。
[0003] 隨著生命科學的快速發(fā)展,基于檢測報告基因的藥物篩選方法近年來取得了較大 的發(fā)展和廣泛的應用,其設及完整細胞,在活細胞自然條件下研究藥物對生命體功能的影 響,更接近體內(nèi)的生化過程,可W較為準確地了解藥物的生物學特性。
[0004] 構建抗慢性缺氧病變活性的快速、分類篩選模型不僅有助于從中藥或已有的化學 藥或運新化學實體中尋找和發(fā)現(xiàn)治療神經(jīng)纖維性病變的有效藥物,為新藥研發(fā)提供新的先 導化合物,也可為各種藥物治療神經(jīng)纖維性病變的作用機制研究提供一定的前期基礎,有 利于中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。
[0005] 盧瓊報道了基于HIF-Ia啟動子構建的藥物篩選模型,但并沒有公開所用的基因片 段的堿基序列,本領域技術人員無從知曉此篩選模型的具體結(jié)構和構建方法(盧瓊,腦缺血 藥物篩選細胞模型的構建及應用研究,西南交通大學學位論文,2014年)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了構建一種具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的篩選模型,本發(fā)明提供了一種基 因構建物。
[0007] 本發(fā)明提供的基因構建物從5'端到3'端依次含有:HIF-Ia啟動子基因-583bp~+ 23bp序列和報告基因序列。
[000引 W大鼠為例,HIF-Ia啟動子基因-583bp~+23bp序列詳見沈QN0.1: 進一步地,上述報告基因選自:巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0009] 優(yōu)選地,上述巧光蛋白基因為綠色巧光蛋白(GFP)基因或紅色巧光蛋白(RFP)基 因;上述巧光素酶基因為蛋火蟲巧光素酶基因。
[0010] 紅色巧光蛋白中E2-化imson較為常用。
[0011] 本發(fā)明進一步提供了一種重組載體,此載體含有上述的基因構建物。
[0012]本發(fā)明中的載體指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移至受體 細胞的一種能自我復制的DNA分子,常用的有質(zhì)粒、隧菌體和動植物病毒。
[0013] 本發(fā)明進一步構建了一種穩(wěn)定的細胞,此細胞含有上述的重組載體或其基因組中 整合上述的基因構建物。
[0014] 進一步地,此細胞選自HEK293細胞、化Ia細胞、C冊細胞或干細胞中的任一種。
[0015] 本發(fā)明進一步提供了構建上述重組載體的方法,它包括如下步驟: (1) 合成HIF-Ia啟動子基因-583bp~巧3bp序列; (2) 將步驟(1)合成的序列與帶有報告基因的報告載體分別進行酶切,連接報告載體與 啟動子片段,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,抗性篩選,挑選陽性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒,即得重組載體。
[0016] 進一步地,步驟(2)中,所述報告載體為帶有報告基因的pSC基礎質(zhì)粒。
[0017] 此處所述的報告基因同上述,即選自巧光蛋白基因和/或巧光素酶基因。
[0018] 本發(fā)明進一步提供了構建上述的穩(wěn)定的細胞的方法,即將述的重組載體轉(zhuǎn)染 肥K293細胞、Hela細胞、C冊細胞或干細胞中的任一種。
[0019] 本發(fā)明進一步提供了此穩(wěn)定的細胞的用途,此穩(wěn)定的可用于篩選可提高HIF-Ia表 達水平或具有抗慢性缺氧病變活性的藥物,如各類中藥、現(xiàn)有的化學藥、新化學實體等等。
[0020] 本發(fā)明進一步提供了一種篩選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物的方法,此方法包 括如下步驟: (1) 將候選藥物給予本發(fā)明構建的穩(wěn)定的細胞; (2) 檢測所述細胞中報告基因的表達情況; (3) 判斷結(jié)果,若所述候選藥物能提高報告基因的表達,則表明該候選藥物可提高HIF-Ia表達水平或具有抗慢性缺氧病變活性。
[0021] 進一步地, 步驟(1)包括將候選藥物加入上述構建的穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系中共培養(yǎng); 步驟(2)包括檢測實驗組的報告基因的表達,并與空白對照組比較,空白對照組是不添 加所述候選藥物的與實驗組相同條件培養(yǎng)的本發(fā)明構建的穩(wěn)定的細胞; 若實驗組中報告基因的表達水平高于對照組,表明候選藥物可提高HIF-Ia表達水平或 具有抗慢性缺氧病變活性。
[0022] 進一步優(yōu)選地,實驗組的報告基因的表達水平/對照組的報告基因的表達水平> 150%,則表明候選藥物具有抗慢性缺氧病變活性。
[0023] 本發(fā)明構建了 WHIF-Ia啟動子為祀點的細胞篩選模型,可系統(tǒng)、有效、多方面地篩 選具有抗慢性缺氧病變活性的藥物。
【附圖說明】
[0024] 圖1質(zhì)粒構建示意圖 圖2單克隆細胞株的構建(巧光場和明場,200X ) 圖3構建得到的穩(wěn)定293-P化-E2細胞株(巧光場,100X) 圖4紅色巧光蛋白巧2)細胞模型功能鑒定(巧光場,IOOX ), A:293-pHp-E2(0yM CoCl2);B:293-pHp-E2(300yM CoCl2) 圖5巧光素酶細胞模型(293-p化-Luc)功能鑒定 圖6 5個中藥提取物的篩選結(jié)果。
【具體實施方式】
[00劇材料 1.1菌株與細胞株大腸桿菌菌株DH5a(四川大學國家生物醫(yī)學材料工程研究技術中屯、 505實驗室保藏)、人胚腎上皮細胞皿K293(四川大學國家生物醫(yī)學材料工程研究技術中屯、 505實驗室保藏)。
[0026] 1.2質(zhì)粒PSC-E2,即連接有報告基因E2-化imson化2)(紅色巧光蛋白)的pSC質(zhì)粒 (505實驗室構建)、pSC-Luc,即連接有報告基因Luciferase化UC)(巧光素酶)的pSC質(zhì)粒 (505 實驗室構建)(構建方法參見 S Liu, L Ma, R Tan, et al. Safe and efficient local gene delivery into skeletal muscle via a combination of Pluronic L64and modified electrotransfer.Gene Therapy(2014)21,558-565)。
[0027] 1.3主要試劑LA Taq聚合酶(TaKaRa)、Pfu DNA聚合酶(Fermentas)、Plalimum度 Taq聚合酶(Invitrogen);限制性內(nèi)切酶化e;rmen1:as) :MluI、Af I n、MunI、BamHI、NotI、Hind 虹、XbaI; T4DNA連接酶(TaKaRa);E. Z. N. A. ?質(zhì)粒小量提取試劑盒化.Z. N. A. ? Plasmid Mini Kitl,Omega)、膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit,Bioflux);哺乳動物細 胞轉(zhuǎn)染試劑<Xip〇fectamine?2000, Invitrogen)、巧光素酶檢測試劑盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer,Promega)、蛋白質(zhì)濃度測定試劑含(Picnx''!;' BCAProteinAssay Kit ,!"Iiermo)、G4IS(Amresco)、二甲亞諷(DMSO, Sigma)、二氯化鉆 (CoCl2, Sigma)、細胞培養(yǎng)皿(Iliermo)、各種規(guī)格培養(yǎng)板(Corning);其它化學試劑除注明 夕h均為國產(chǎn)分析純。
[002引 1.4儀器PCR儀(S1000? Thermal 切cler,BI0-RAD)、電泳儀(DYY-虹型,北京六一 儀器廠)、凝膠成像分析系統(tǒng)(化emiDoc XRS+型,BI0-RAD)、超微量分光光度計(化no化OP 2000,化6細0 Scient if ic)、顯微鏡(DMIL,Leica)、倒置相差巧光顯微鏡(DMI4000B, Leica)、C02培養(yǎng)箱(MAC0-15AC,SANYO)、超凈工作臺(SW-CJ-2N型,哈爾濱東聯(lián)公司)、酶標 儀(―Vario濁抑勵Flash,Thermo Scientif ic)。
[0029] 實施例1重組質(zhì)粒的構建 1.1試驗方法 W大鼠基因組DNA為模板,設計引物在rHIF-la啟動子序列的上下游分別引入MluI和 Afl^酶切位點PCR擴增得到啟動子片段:rHIF-lapro(縮寫為Hp)(-583bp~+23bp)(+l為基 因轉(zhuǎn)錄起始位點),正向引物的序列詳見SEQ NO.2,反向引物的序列詳見SEQ NO.3。1%瓊脂 糖凝膠電泳鑒定,乙醇沉淀回收得到各啟動子片段。分別雙酶切載體PSC-E2及各啟動子片 段化p),l%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收目的片段,連接載體與啟動子片段,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,氨 節(jié)青霉素平板抗性篩選,挑選陽性轉(zhuǎn)化子,進行快速裂解鑒定,陽性者擴大培養(yǎng)后提取質(zhì) 粒,進行酶切和PCR鑒定,對鑒定成功的質(zhì)粒進行測序,最后獲得重組質(zhì)粒P化-E2。
[0030] 同理制備獲得重組質(zhì)粒P化-Luc。
[0031] 1.2實驗結(jié)果 如圖1的示意圖所示,本研究構建了兩種報告基因體系,其中報告基因E2為紅色巧光蛋 白,用于快速定性觀察和判斷;Luc為巧光素酶,用于定量測定。雙酶切、PCR鑒定結(jié)果顯示重 組質(zhì)粒構建成功。送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果
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