的裂解酶的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能降解黃曲霉毒素B1的裂解酶的分離純化方法，屬于生物工程 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉（Aspergillusflavus)和寄生曲霉 (Aspergillusparasiticus)產(chǎn)生的帶有一個(gè)氧雜萘鄰?fù)鸵粋€(gè)雙咲喃環(huán)的強(qiáng)毒性次級(jí)代 謝產(chǎn)物。目前已經(jīng)鑒定出的黃曲霉毒素有20多種，而AFBi是糧食中最常見(jiàn)的，也是毒性最 大的，被世界衛(wèi)生組織定為1A類致癌物質(zhì)。
[0003]AFBi在糧食中的存在嚴(yán)重威脅著動(dòng)物以及人體的健康，研究高效、安全降解AFB1 已成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)。在各種AFBi去除方法中，由于物理法和化學(xué)法存在破壞糧食的營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)成分或造成化學(xué)物質(zhì)殘留和影響適口性等不足，目前生物脫毒普遍被認(rèn)為是最有前 途的方法。生物脫毒是指毒素分子上的毒性基團(tuán)被微生物或是其代謝產(chǎn)物分解破壞，同時(shí) 產(chǎn)生無(wú)毒降解產(chǎn)物的過(guò)程。在自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括細(xì)菌，真菌（含酵母）在內(nèi)的多種微生 物能夠吸附真菌毒素或是分泌降解真菌毒素的物質(zhì)，這些微生物的脫毒機(jī)理主要有：菌體 細(xì)胞對(duì)毒素的吸附作用和發(fā)酵產(chǎn)生的酶對(duì)毒素的降解作用。
[0004] 前期我們篩選到1株不但能明顯抑制黃曲霉生長(zhǎng)，且能高效降解AFBi的安全 菌株，目前已保藏至中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，命名為解淀粉芽孢桿菌CGMCC N0.9021。對(duì)解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0.9021降解AFBi的特性研究發(fā)現(xiàn)，AFBi的降解不是 依賴菌體吸附，而是由于其代謝產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。然而， 和目前大多數(shù)降解六?8 1菌種研究相類似，由于目的蛋白不明確，發(fā)酵工藝優(yōu)化工作難以開(kāi) 展，導(dǎo)致大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用工作進(jìn)展遲緩。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種能降解黃曲霉毒素隊(duì)的裂解酶的分離純化方 法。本發(fā)明通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAEFF陰離子交換層析和Superdux75凝膠過(guò)濾層析 等步驟獲得解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0. 9021發(fā)酵液中降解AFBi的活性物質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜鑒定 和熒光色譜技術(shù)分析該活性蛋白及其降解機(jī)理。
[0006] 所述方法是從解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0. 9021的發(fā)酵液中，依次利用硫酸銨分級(jí) 沉淀、DEAEFF陰離子交換層析和Superdux7510/300GL凝膠過(guò)濾層析來(lái)分離純化得到黃 曲霉毒素隊(duì)裂解酶。
[0007] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括：（1)硫酸銨分級(jí)沉淀：解淀粉芽孢 桿菌CGMCCN0. 9021發(fā)酵液經(jīng)0-40%硫酸銨沉淀后離心，然后將沉淀的蛋白復(fù)溶，透析； (2)透析后的蛋白溶液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，上樣于DEAEFF陰離子交換柱，用磷酸鹽緩沖液 沖洗，然后用含lmol/LNaCl的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行恒梯度洗脫，收集具有降解AFB^g性的組 分；（3)將上一步收集得到的活性組分上樣于Superdux75 10/300GL凝膠過(guò)濾層析柱，用 磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集具有降解AFBi活性的組分。
[0008] 所述步驟（2)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，中收集的是第二個(gè)蛋白吸收峰的蛋白 溶液。
[0009] 所述步驟（3)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，收集的是第三個(gè)蛋白吸收峰的蛋白溶 液。
[0010] 所述硫酸銨沉淀，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是使用20-40 %硫酸銨沉淀。
[0011] 所述復(fù)溶，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是使用20mmol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩沖 液。
[0012] 所述磷酸鹽緩沖液，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，濃度為10-50mmol/L，pH 6. 8-7. 4〇
[0013] 所述磷酸鹽緩沖液，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，濃度為20mmol/L，pH7. 0。
[0014] 所述方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體包括：
[0015] (1)解淀粉芽孢桿菌06110：-9021發(fā)酵液經(jīng)40%硫酸銨沉淀，然后于4°(：、1000(^/ min離心lOmin，將沉淀蛋白用20mmol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，透析過(guò)夜；
[0016] (2)透析后的蛋白溶液通過(guò)0?22ym微孔濾膜過(guò)濾，上樣于HiPr印16/10DEAEFF 離子交換柱，用20mmol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗，然后用含lmol/LNaCl的磷酸鹽緩 沖液（20mmol/L、pH7.0)進(jìn)行恒梯度洗脫，收集第二個(gè)蛋白吸收峰；
[0017] (3)將上一步收集的蛋白溶液上樣于Superdux7510/300GL凝膠過(guò)濾層析柱，用 20mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第三個(gè)蛋白吸收峰。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種黃曲霉毒素隊(duì)裂解酶的鑒定方法。
[0019] 所述鑒定方法是：收集分離純化的各個(gè)步驟中具有降解AFB^g性的成分進(jìn)行 Tricine-SDS-PAGE分析，分析各個(gè)泳道中共有的條帶，選擇共有條帶（即目標(biāo)條帶）進(jìn)行手 動(dòng)切膠，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（MALDI-T0F/T0F)，用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì) 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索匹配，Mascot分值大于59即可認(rèn)定物質(zhì)鑒定有效。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種黃曲霉毒素隊(duì)裂解酶的黃曲霉毒素降解機(jī)理分析方法。
[0021] 所述分析方法，是將AFBjg準(zhǔn)溶液和降解AFBi的活性物質(zhì)溶液加入棕色反應(yīng)瓶 中，37°C避光反應(yīng)。采用三倍體積的三氯甲烷進(jìn)行液相萃取AFBi，之后加入50%的甲醇溶 液震蕩溶解，在365nm的激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過(guò)熒光強(qiáng)度的改變推測(cè)降解機(jī)理。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：成功分離純化到了電泳純的解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0. 9021 來(lái)源的黃曲霉毒素隊(duì)裂解酶，活性蛋白為分子量約27kDa。本發(fā)明的裂解酶通過(guò)破壞黃曲霉 毒素隊(duì)的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)降低毒性，本發(fā)明方法可以指導(dǎo)優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0. 9021 工業(yè)化產(chǎn)黃曲霉毒素隊(duì)裂解酶的發(fā)酵及純化工藝，奠定其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1:硫酸銨分級(jí)沉淀各部分對(duì)AFBi的降解作用；
[0024] 圖2 :HiPr印16/10DEAEFF色譜柱色譜洗脫圖譜；
[0025] 圖3:Superdux75 10/300GL色譜柱色譜洗脫圖譜；
[0026]圖4 :Tricine-SDS-PAGE圖譜；其中：M為標(biāo)樣，1為上清液，2為40%硫酸銨沉淀 溶液，3為L(zhǎng)1 (離子色譜峰1)，4為L(zhǎng)2 (離子色譜峰2)，5為N3 (凝膠色譜峰3);
[0027] 圖5 :蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析結(jié)果；注：（a)為條帶1的MALDI-T0F分析，（b)~（f)為 條帶1的MALDI-T0F-T0F分析；
[0028] 圖6 :解淀粉芽孢桿菌裂解酶對(duì)AFBi焚光特性的影響；
[0029] 圖7 :解淀粉芽孢桿菌裂解酶對(duì)AFBi的可能作用機(jī)理。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1 :黃曲霉毒素隊(duì)裂解酶的分離、純化、鑒定
[0031] (1)解淀粉芽孢桿菌CGMCCN0. 9021發(fā)酵液經(jīng)飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，測(cè)定各個(gè) 部分沉