一種重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)及回收可溶性蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用桿狀病毒表面展示系統(tǒng)展示可溶性蛋白以及從桿狀病毒表面回收可溶性蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桿狀病毒是節(jié)肢動(dòng)物門的專性寄生病毒，自20世紀(jì)80年代被開發(fā)為表達(dá)載體依賴，由于其真核表達(dá)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的重視和研究，在短短不到30年的時(shí)間里，桿狀病毒表達(dá)體系的重組載體構(gòu)建技術(shù)、篩選技術(shù)得到了很大程度的改進(jìn)和簡化，成為與大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物相并列的四大表達(dá)載體系之一。在表面展示、類病毒顆粒表達(dá)、哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移、RNA干擾等方面取得了重要的成果。
[0003]桿狀病毒基因組為130kb左右，因此可以容納較大的外源DNA片段。病毒基因組中多角體蛋白基因是病毒感染晚期高效表達(dá)的基因，卻是病毒復(fù)制增殖的非必需區(qū)，因此適用于插入外源基因的多拷貝。該基因受強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控，可較高水平表達(dá)外源蛋白。外源DNA插入多角體蛋白基因內(nèi)，使此基因功能喪失，不能再合成多角體蛋白。另外，桿狀病毒表面展示系統(tǒng)能夠完成翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾，使外源產(chǎn)物具有較高生物學(xué)活性。
[0004]桿狀病毒表面展示系統(tǒng)在經(jīng)過不斷地研究與改進(jìn)后，表現(xiàn)出了極為廣闊的應(yīng)用前景，該系統(tǒng)屬于高等真核生物展示系統(tǒng)，可彌補(bǔ)原核展示系統(tǒng)的不足，并保持表面展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，在高親和力抗體及多肽藥物的篩選、蛋白質(zhì)抗原表位分析、構(gòu)建多肽文庫和抗體庫、新型疫苗研制、基因治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]雖然目前桿狀病毒表面展示系統(tǒng)已經(jīng)研究的很成熟了，但是目前商業(yè)化的桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)量較低，且表達(dá)的蛋白難以分離純化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是為了克服以上的技術(shù)缺陷提供一種可溶性蛋白桿狀病毒表面展示系統(tǒng)。
[0007]本發(fā)明的目的之二是為了提供一種對(duì)上述桿狀病毒表面展示的可溶性蛋白進(jìn)行回收的方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]—種重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)，所述展示系統(tǒng)除含有表達(dá)載體外，其特征在于，還包括特定基因片段，所述特定基因片段包括:GP64信號(hào)肽、缺失信號(hào)肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)以及終止密碼子。
[0010]進(jìn)一步地，所述缺失信號(hào)肽的目的可溶性蛋白cDNA基因片段位于GP64信號(hào)肽與蛋白標(biāo)簽之間。
[0011]進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為pFastBaclvector。
[0012]進(jìn)一步地，所述蛋白標(biāo)簽為MyC、His、GST或HA，優(yōu)選為His標(biāo)簽。
[0013]進(jìn)一步地，所述終止密碼子為TGA，TAA或TAG，優(yōu)選為TAG。
[0014]利用上述重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)回收可溶性蛋白的方法，
[0015]1)構(gòu)建表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化大腸桿菌:首先通過基因擴(kuò)增方法得到含有目的可溶性蛋白核酸序列的基因片段，將得到的基因片段插入到表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切位點(diǎn)選用凝血酶的切割位點(diǎn)；基因片段插入表達(dá)載體的步驟包括:首先對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行消化處理，然后在連接酶的作用下將表達(dá)載體與核酸序列進(jìn)行連接，形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒，最后將環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中；
[0016]2)表達(dá)載體驗(yàn)證:在得到大腸桿菌Amp抗性轉(zhuǎn)化株后，挑取部分轉(zhuǎn)化株，在含有Amp濃度為80-120 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，使用酶切消化處理質(zhì)粒DNA ;通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒是否插入正確的位點(diǎn)，同時(shí)用PCR方法對(duì)陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析，最后，將找到的陽性重組子進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的正確性；
[0017]3)表達(dá)目的可溶性蛋白用重組桿狀病毒粒子克隆的制備:提取陽性重組子的質(zhì)粒DNA，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DHlOBacTMEcoli，轉(zhuǎn)變?yōu)闂U粒；利用藍(lán)/白斑法篩選出含有重組桿粒的克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有重組桿粒的大腸桿菌，抽提重組桿粒，凍干保存，備用；
[0018]4)昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和重組桿狀病毒粒子的收集:①sf9細(xì)胞計(jì)數(shù)，取12.5cm2新細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶加入9 X105個(gè)細(xì)胞，并以全培培養(yǎng)12-24h，使細(xì)胞貼壁；②溶解2yg步驟3)得到的純化重組桿狀病毒質(zhì)粒于100 μ L無添加成分的Grace’ s培養(yǎng)基中；③將轉(zhuǎn)染試劑充分搖勻后，取10 μ L加入100 μ L無添加成分的Grace’ s培養(yǎng)基中，混勻；④將②和③所得溶液混勻，室溫孵育30min，同時(shí)以2mL含10% FBS的Grace’s培養(yǎng)基洗滌待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并棄去洗滌液；⑤取0.8mL無添加成分的Grace’s培養(yǎng)基加入④所得質(zhì)粒于轉(zhuǎn)染劑的混合液中，輕輕混勻，總體積約lmL，加入④步洗滌完成的待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，27°C繼續(xù)培養(yǎng)5h ;⑥移除質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑混合物，加入2mL含10% FBS的Grace’ s培養(yǎng)基，27°C孵育，直至病變現(xiàn)象產(chǎn)生?’⑦5天后，lOOOrpm離心lOmin收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的重組桿狀病毒粒子，轉(zhuǎn)移上清到凍干管中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱中避光保存。
[0019]5)重組桿狀病毒粒子的擴(kuò)增以及目的可溶性蛋白的表達(dá):①取適當(dāng)體積的重組桿狀病毒粒子原液加入到匯聚度90%的新鮮傳代的sf9細(xì)胞中，27°C恒溫培養(yǎng)箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動(dòng)一次；②去掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入新鮮的含10% FBS的Grace’ s培養(yǎng)基，27°C恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3天后，lOOOrpm離心lOmin收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒粒子，轉(zhuǎn)移上清液到凍干管中，貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱中避光存放；④得到的重組病毒粒子重復(fù)上述①-③步驟，以獲得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的重組桿狀病毒粒子到匯聚度達(dá)95%的新鮮傳代的sf9細(xì)胞中，27°C恒溫培養(yǎng)箱中，靜置lh，每隔15min輕輕晃動(dòng)一次；⑥去掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入新鮮的含10% FBS的Grace’ s培養(yǎng)基，27°C恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)?’⑦40-44h后，輕輕倒盡細(xì)胞上清培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上靜置30min ;⑧收集細(xì)胞裂解液，加入等體積的2 X SDS凝膠加樣緩沖液上樣緩沖液，混勻，100°C保持lOmin SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；
[0020]6)目的蛋白的回收:目的可溶性蛋白展示完成后，將上述步驟5)得到的重組桿狀病毒粒子溶液于18000-22000rpm，4°C離心15分鐘，收集沉淀，既得表面展示有目的可溶性蛋白的重組桿狀病毒粒子，后用少量的純水重懸重組桿狀病毒粒子得重組桿狀病毒粒子溶液，用終濃度為500-1000單位/L的凝血酶切割重組桿狀病毒粒子表面的可溶性蛋白，使帶有特定標(biāo)簽的目的可溶性蛋白與桿狀病毒分離，然后用帶有特定標(biāo)簽的分離柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行回收純化，最后得到高純度的目的蛋白。
[0021]本發(fā)明提供的一種重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)及回收可溶性蛋白的方法，此展示系統(tǒng)可以展示不同種屬的可溶性蛋白，利用N端展示技術(shù)將可溶性目的蛋白展示在桿狀病毒表面，然后利用回收和純化桿狀病毒、酶切使目的蛋白與桿狀病毒分開、再利用特定的標(biāo)簽回收目的蛋白，得到蛋白的活性、產(chǎn)量等各個(gè)方面都有極大的改進(jìn)和完善，適用于診斷抗原以及活性蛋白的開發(fā)。同時(shí)，本發(fā)明利用特定的蛋白分離、純化方法，從桿狀病毒表面回收可溶性的目的蛋白，該回收方法可以提高可溶性蛋白的回收效率，適用于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的包含目的可溶性蛋白基因序列的特定基因片段，該特定的基因片段包含有:ATG、GP64信號(hào)肽、缺失信號(hào)肽的目的可溶性蛋白cDNA、9His標(biāo)簽、凝血酶切割位點(diǎn)、TM(跨膜區(qū))、CT(胞內(nèi)部分)、終止密碼子。
[0023]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的構(gòu)建完成的含有目的可溶性蛋白的環(huán)狀質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1提供的方法與空載質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比對(duì)，圖中1對(duì)應(yīng)的條帶是空載質(zhì)粒同樣實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖中2對(duì)應(yīng)的條帶是采用本發(fā)明的方法制備出來的PCV-20RF2蛋白條帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0026]實(shí)施例1重組PCV-2 0RF2蛋白桿狀病毒表面展示及再回收工藝
[0027]1、構(gòu)建表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
[0028]首先，用下列引物擴(kuò)增序列表中SEQ ID N0.1，其中SEQ ID N0.1是PCV-2 0RF2蛋白的全基因序列，序列長度為702bp。
[0029]P1:5，-TCAGGATCCATGACGTATTCCAAGGAGGCG-3’
[0030]P2:5， -GCTCTCGAGTAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3?
[0031]以上引物由武漢金開瑞生物工程有限公司自行合成，依照說明溶解于適量滅菌超純水中，按20 μ L/管分裝，保存于-20 °C冰箱備用。
[0032]SEQ ID N0.1序列表中的核苷酸序列擴(kuò)增完成后，將經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證正確的核苷酸序列為模板，以下列引物擴(kuò)增模板，得到缺失N端41個(gè)氨基酸的核定位信號(hào)區(qū)的0RF2基因，該擴(kuò)增片段的長度為579bp。
[0033]P3:5’ -GCTCTCGAGATGAATGGCATCTTC-3’ (下劃線為 Xhol 酶切位點(diǎn))
[0034]P4:5’ -GGGCTGCAGAAGTGGGGGGTCTTTAAG-3’ (下劃線為 PstI 酶切位點(diǎn))。
[0035]基因擴(kuò)增完成之后，按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒的說明書對(duì)特定的目標(biāo)片段序列進(jìn)行回收、純化。
[0036]特定片段的序列回收、純化完成之后將載體質(zhì)粒與目的基因的限制性酶切反應(yīng)均參照供應(yīng)商提供的條件進(jìn)行(購自英駿公司)。配制酶切反應(yīng)體系時(shí)按照雙蒸水、對(duì)應(yīng)的酶切Buffer、PCR產(chǎn)物片段、限制性內(nèi)切酶(Xhol、PstI)的順序加入，酶切反應(yīng)的條件為37°C3.5h。酶切完成后按照方法進(jìn)行瓊脂糖電泳回收，再進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)的反應(yīng)體系如下:在20 μ L的反應(yīng)體系中，加入1/10總體積的10Χ連接Buffer，再加入一定量的外源片段及載體DNA，再加入1 μ L的連接酶后，加水補(bǔ)齊總體積至20 μ L混勻，混勻置于16 °C連接過夜。
[0037]質(zhì)粒與目標(biāo)基因片段連接完成之后即轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞DH5α。
[0038]2、表達(dá)載體驗(yàn)證。
[0039]在得到Amp抗性轉(zhuǎn)化株后，挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化株，在含有100 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，使用BamHI和Sail消化處理質(zhì)粒DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒是否插入正確的位點(diǎn)，同時(shí)用PCR方法對(duì)陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析，最后，將找到的陽性重組子進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的正確性。
[0040]3、表達(dá)PCV-2 0RF2蛋白用桿狀病毒粒子克隆的制備。
[0041]提取陽性重組子的質(zhì)粒DNA，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入D