含h7n9病毒ha基因的重組序列、重組桿狀病毒及該病毒在疫苗制備中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含H7N9流感病毒HA蛋白基因的重組核苷酸序列，該重組核苷酸序列編碼的氨基酸序列，利用該重組核苷酸序列構(gòu)建的家蠶重組桿狀病毒，該家蠶重組桿狀病毒的制備方法，以及該家蠶重組桿狀病毒在H7N9流感疫苗制備中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]H7N9型流感是一種新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒。
[0003]對于病毒性疾病，最好的預(yù)防方法是接種疫苗。由于減毒活疫苗研制周期長，目前國際上廣泛使用的流感疫苗為純化的多價(jià)滅活疫苗。流感病毒滅活疫苗，共有三種類型，即全毒粒疫苗，裂解疫苗與毒粒亞單位疫苗。全毒粒疫苗使用最早，據(jù)Francis.T報(bào)導(dǎo)，1943年，美國的臨床試驗(yàn)表明，全毒粒滅活疫苗的保護(hù)率可達(dá)70%，1945年，美國首次批準(zhǔn)這種流感滅活疫苗投放市場。這種早期的粗制疫苗，是用含流感病毒粒子的雞胚尿囊液，經(jīng)有限的純化后用甲醛滅活而成的。在本世紀(jì)60年代，由于超速離心與層析等技術(shù)的發(fā)展，使病毒粒子的純化程度進(jìn)一步提高。流感病毒粒子的雙層脂膜上具有刺狀突起，這就是血凝素(HA)與神經(jīng)氨酸酶(NA)，全毒粒疫苗含有來自病毒包膜上的類脂質(zhì)，接種后局部反應(yīng)及高熱的發(fā)生率較高，兒童在使用時(shí)常常會出現(xiàn)不良反應(yīng)，所以，全病毒粒子疫苗主要用于成人。
[0004]以后，純化的全毒粒疫苗進(jìn)一步改良成為裂解的純化疫苗,它用裂解劑如乙醚，SDS, Triton X-100等將病毒的結(jié)構(gòu)蛋白如基質(zhì)蛋白等釋放出來，並部分溶解表面糖蛋白，所以這類疫苗既含有內(nèi)部抗原也含有外部抗原，可以全面刺激抗體產(chǎn)生，而且由于去除了類脂質(zhì)等反應(yīng)原，不良反應(yīng)就大大減少了。這種裂解疫苗一直到現(xiàn)在仍在廣泛地使用著。目前歐洲，美國，日本等地使用的主要就是裂解疫苗。此外我國使用的法國梅里厄公司的凡而靈疫苗，以及衛(wèi)生部上海生物制品研究所從日本大阪大學(xué)微生物研究所引進(jìn)，2001年獲得生產(chǎn)文號的流感疫苗也均為裂解疫苗。
[0005]20世紀(jì)70-80年代，在裂解疫苗的基礎(chǔ)上，又研制出毒粒亞單位疫苗，它只含表面抗原，沒有內(nèi)部抗原與類脂質(zhì)，接種后的不良反應(yīng)進(jìn)一步減少，但免疫原性遠(yuǎn)不如全毒粒疫苗，也不如裂解疫苗。
[0006]匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的禽流感疫苗研究小組，在2006年2月出版的《病毒學(xué)》雜志發(fā)表文章指出，他們研制的一種禽流感疫苗在老鼠和雞身上進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有效率達(dá)百分之百。科學(xué)家根據(jù)H5N1病毒的基因序列數(shù)據(jù)，人工生成了一種帶有紅血球凝聚素的DNA,然后把這些DNA片斷附著在能引起人類感冒的病毒上，就制成了禽流感疫苗。實(shí)驗(yàn)顯示，注射了這種疫苗后，動(dòng)物體內(nèi)不僅產(chǎn)生了對流感病毒的抗體，還形成了一種可以抗擊多種病毒的免疫細(xì)胞，這種免疫細(xì)胞會隨著外界病毒的變異而變化，從而繼續(xù)發(fā)揮作用。目前，這一研究成果正在等待美國食品藥品管理局的批準(zhǔn)，一旦獲準(zhǔn)，疫苗將在8月份進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段。NIH正在和賽諾菲巴斯德和凱龍等疫苗公司合作，賽諾菲巴斯德公司的疫苗研發(fā)工作進(jìn)行得最為深入。最近研究者們在452名健康的成年人中對賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的H5N1疫苗進(jìn)行了測試，并得出了結(jié)論。該疫苗產(chǎn)生了很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但需要90 μ g的疫苗量，而普通的三價(jià)流感疫苗則只需要45 μ g。另外，由于人類從未接觸過H5N1病毒，因此在首次免疫一個(gè)月后需要進(jìn)行加強(qiáng)免疫，這樣總共需要180 μ g的量。凱龍公司同樣也在研發(fā)H5N1的疫苗，對此疫苗初步的測試中添加了公司的專利佐劑MF59。英國牛津PowderMed有限公司開發(fā)出一種基于DNA的禽流感疫苗，并聲稱可以快速、大批量的進(jìn)行生產(chǎn)。預(yù)計(jì)直到今年年中，才會對疫苗進(jìn)行早期臨床試驗(yàn)，目前的事實(shí)是，盡管有不少公司宣布研制了禽流感疫苗，但它們都還在臨床前研究或者最初的臨床研究中，還沒有真正能向市場推廣的禽流感疫苗。
[0007]盡管滅活苗在流感的預(yù)防方面取得了較好的效果，但在用雞胚制備疫苗的過程中存在的安全隱患也是顯而易見的。今天，成千上萬的重組蛋白已經(jīng)成功利用昆蟲桿狀病毒載體得到表達(dá)。昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，是繼大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)之后建立起來的，始于本世紀(jì)80年代初。它采用一個(gè)或多個(gè)桿狀病毒基因啟動(dòng)子，其中最常用的是多角體蛋白基因啟動(dòng)子和PlO蛋白基因啟動(dòng)子，將外源目的基因插入到啟動(dòng)子后，獲得重組病毒，這種重組病毒在昆蟲細(xì)胞或蟲體內(nèi)復(fù)制的同時(shí)，使外源基因得到表達(dá)。整個(gè)系統(tǒng)由轉(zhuǎn)移載體、桿狀病毒載體和宿主(細(xì)胞或蟲體)組成。重組桿狀病毒的構(gòu)建過程大致可分為三步:將目的基因插入到轉(zhuǎn)移載體多克隆位點(diǎn)中，在大腸桿菌中擴(kuò)增，轉(zhuǎn)移載體帶有多角體或者PlO蛋白啟動(dòng)子及用于同源重組的桿狀病毒多角體或者PlO蛋白基因兩端的側(cè)翼序列；通過細(xì)胞內(nèi)同源重組將目的基因轉(zhuǎn)移到桿狀病毒基因組的多角體或者PlO蛋白基因部位，取代多角體或者PlO蛋白基因；篩選重組病毒并在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞或蟲體內(nèi)擴(kuò)增與表達(dá)。
[0008]目前，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用的昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要有兩類=AcNPV和BmNPV載體表達(dá)系統(tǒng)。NPV的多角體蛋白(polyhedrin)基因和plO基因是病毒感染晚期高效表達(dá)的基因，其缺失對病毒的復(fù)制增殖毫無影響，因而可以作為外源基因理想的插入位點(diǎn)。而且多角體蛋白基因被外源基因取代后，不形成多角體，在光學(xué)顯微鏡下很容易與形成多角體的野生病毒相區(qū)別，這些特征使得NPV特別適合于表達(dá)外源基因。這一構(gòu)想由Miller于1981年提出，并由Summers和Smith于1983年首次實(shí)現(xiàn)。他們利用AcNPV的多角體蛋白基因構(gòu)建了一個(gè)轉(zhuǎn)移載體，并將β-干擾素基因克隆到上面，和野生型AcNPV DNA共轉(zhuǎn)染秋粘蟲培養(yǎng)細(xì)胞Sf-9，實(shí)現(xiàn)了干擾素的高效表達(dá)。1985年Maeda等用家蠶核型多角體病毒(BmNPV)作表達(dá)載體，在家蠶體內(nèi)也高水平地表達(dá)出人α-干擾素。此后各種來源不同的外源基因在桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)中得到聞效表達(dá)。
[0009]由于桑蠶是具有我國特色的經(jīng)濟(jì)資源，因而本申請人著重研究與之相關(guān)的BmNPV。1992年，本申請人首次克隆出了 BmNPV PlO基因，發(fā)現(xiàn)該基因和AcNPV PlO具有較高同源性；利用BmNPV PlO基因，本申請人第一次成功構(gòu)建了桿狀病毒的非融合通用轉(zhuǎn)移載體，使得同一載體在不同宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因成為可能；另外，本申請人利用家蠶核多角體病毒鎮(zhèn)江株的多角體蛋白啟動(dòng)子首次構(gòu)建了適應(yīng)于我國家蠶品種的BmNPV表達(dá)系統(tǒng)，并成功表達(dá)β -半乳糖甘酶，產(chǎn)量高達(dá)580 μ g/蠶，這些都為構(gòu)建高質(zhì)量的BmNPV載體表達(dá)系統(tǒng)的打下了的基礎(chǔ)。
[0010]現(xiàn)在，通過篩選獲得重組病毒的幾率已從最初的0.1%?1%提高到現(xiàn)在的100%，并且出現(xiàn)了一些新的宿主域擴(kuò)大的昆蟲桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)。我們利用BmNPV解螺旋基因DNA與BacPAK6 DNA在昆蟲細(xì)胞中同源重組，經(jīng)累代篩選獲得了既可感染家蠶細(xì)胞又可感染秋粘蟲細(xì)胞Sf-21的宿主域擴(kuò)大的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體(HyBacPAK6)，它與含植酸酶基因的轉(zhuǎn)移載體Pvll393 phy在家蠶細(xì)胞中的重組率達(dá)90%以上。
[0011]對于昆蟲桿狀病毒載體系統(tǒng)的改進(jìn)主要有兩個(gè)方面:一是親本病毒的線型化，另一是桿狀病毒穿梭載體的構(gòu)建。親本病毒的線型化大大提高重組病毒篩選效率，如BacPAK6，Baculo Gold和Bac-N-Blue系統(tǒng)都是線性化后作為親本病毒，其重組效率可達(dá)95%左右。另外，重組拯救可線性化技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了重組病毒載體的篩出率，Possee等設(shè)計(jì)的重組-救活可線性化AcNPV病毒載體AcBacPAK6的重組效率較高，高達(dá)80%以上；我們利用BmNPV DNA與BacPAK6 DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)同源重組篩選到重組-救活可線性化病毒載體BmBacPAK，該系統(tǒng)將重組病毒篩出率提高到100%，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0012]為了提高病毒重組效率，研究者們也開發(fā)出原核和真核細(xì)胞桿狀病毒穿梭載體以及轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組載體。桿狀病毒基因組被改造成一個(gè)能在大腸桿菌中增殖的復(fù)制子，如Luckow等構(gòu)建的桿狀病毒基因組像一個(gè)巨型質(zhì)粒一樣能在大腸桿菌中復(fù)制，被稱為Bacmid。Bacmid含可在大腸桿菌中復(fù)制的F因子復(fù)制子、卡那霉素抗性基因和轉(zhuǎn)座接觸位點(diǎn)att Tn7，這種方法可得到100%的陽性重組病毒。
[0013]在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)宿主方面，除昆蟲幼蟲外，還出現(xiàn)了高水平表達(dá)重組蛋白的昆蟲細(xì)胞系，如秋粘蟲細(xì)胞系sf-9和sf-21，家蠶細(xì)胞系BmN和來自甘藍(lán)尺蠖的BTITN5 B1-4。本申請人以家蠶細(xì)胞系BmN為選育對象，經(jīng)過多輪選育，獲得懸浮性能較好的BmN-ZJ-S細(xì)胞株；以蓖麻蠶血細(xì)胞為材料，建立了兩株細(xì)胞系，即Pcr-Sl和Pcr-S2。
[0014]現(xiàn)今，除了家蠶外，家蠶蛹也開始作為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的宿主得到利用，蟲蛹作為表達(dá)宿主具有不用飼養(yǎng)和管理，可進(jìn)行自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。VanHook等利用幼蟲-蛹變態(tài)期的甘藍(lán)銀紋夜蛾為宿主成功表達(dá)了環(huán)氧化物酶。本申請人